黃陽，葛曉松，吳平

(1江南大學附屬醫(yī)院·無錫市第四人民醫(yī)院，江蘇無錫214000；2杭州師范大學附屬醫(yī)院)

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系統性紅斑狼瘡患者血清miR-155水平變化及意義

黃陽1，葛曉松1，吳平2

(1江南大學附屬醫(yī)院·無錫市第四人民醫(yī)院，江蘇無錫214000；2杭州師范大學附屬醫(yī)院)

目的 探討血清miR-155在系統性紅斑狼瘡(SLE)患者中的水平變化及意義。方法 收集SLE患者50例(SLE組)，健康對照人群40例(對照組)，經糖皮質激素規(guī)律治療的SLE患者45例(治療組)。采用RT-PCR方法檢測血清miR-155水平，并分析其水平與患者臨床特征、療效之間的關系及對SLE的診斷和預后價值。結果 SLE組血清miR-155相對表達水平低于對照組(P<0.001)。SLE組中血清miR-155的表達水平與腎小球濾過率(r=0.576,P<0.001)、血清高敏C反應蛋白(hs-CRP)呈顯著正相關(r=0.406,P=0.003)，而與尿蛋白水平(r=-0.480,P=0.004)、狼瘡活動指數(r=-0.553,P<0.001)呈顯著負相關。對照組中血清miR-155與臨床各指標無顯著相關性(P均>0.05)。血清miR-155診斷SLE受試者特征(ROC)曲線的曲線下面積為0.867，診斷的靈敏度和特異度分別為84%和78%，其曲線下面積顯著高于血清補體C4和hs-CRP(P均<0.01)；miR-155預測SLE患者糖皮質激素治療療效的ROC曲線的曲線下面積為0.782，靈敏度和特異度分別為78%、72%。療效好(狼瘡活動評分較治療前減少3分以上)組患者治療前血清miR-155表達水平顯著高于療效差(狼瘡活動評分較治療前減少小于3分或者沒有減少)組(P<0.05)。療效好組治療前后血清miR-155水平比較，P<0.05，而療效差組治療前后比較，P>0.05。高表達miR-155組的療效好患者所占比例顯著高于低表達組(χ2=2.29,P<0.05)。高表達miR-155組從治療后到出現疾病復發(fā)的平均時間顯著長于低表達miR-155組(46比29個月，P=0.002)。結論 SLE患者血清miR-155水平升高。miR-155是潛在診斷指標、治療靶點和預后因子。

系統性紅斑狼瘡；微小RNA-155；糖皮質激素

系統性紅斑狼瘡(SLE)是一種常見的自身免疫功能紊亂引起的疾病，臨床上表現為多系統損害，有較高的發(fā)病率和病死率，其發(fā)病機制仍待研究并且其治療療效一直不能令人滿意[1]。該病發(fā)病機制復雜且疾病的進展缺乏規(guī)律，經常表現為復發(fā)與緩解交替出現，故尋找一種可靠的臨床標志物從而對本病進行動態(tài)監(jiān)測和治療療效評估尤為重要[2]。目前，臨床常用的診斷和治療方法不能滿足患者需求，尋找一種新的標志物成為提高SLE診斷和治療水平的重要途徑。microRNA (miRNA)是一類非編碼RNA分子，近年被認為是多種疾病的新型生物學標志物和潛在治療靶點[3，4]。有研究發(fā)現，miRNA在免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，其通過作用于基因轉錄后水平，參與免疫細胞發(fā)育和功能異常,與自身免疫病密切相關[5]。有研究發(fā)現，miR-155在免疫細胞分化、成熟、維持免疫平衡等生物過程中具有關鍵調控作用，其表達失調可引起炎癥及自身免疫性疾病[6]，然而血清miR-155在SLE的診斷和治療中的作用卻鮮有提及。本研究檢測了SLE患者血清miR-155的表達水平，并對其在SLE中的診斷、治療和預后價值進行了進一步探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2010年6月～2011年6月在江南大學附屬醫(yī)院和杭州師范大學附屬醫(yī)院住院的SLE患者50例，均符合SLE國際臨床協作組(SLICC) 2009年修訂的SLE分類標準[2]。其中男5例、女45例，年齡(32.9±13.8)歲。對照組選自江南大學附屬醫(yī)院體檢健康者，共45例，男5例、女40例，年齡(29.5±8.5)歲，抗核抗體、抗核抗體譜、血沉、血常規(guī)、尿常規(guī)、免疫球蛋白檢測結果均正常。另外收集經規(guī)律治療的SLE患者45例(治療組)，其中男6例、女39例，年齡(31.8±10.5)歲，根據SLICC 2009年修訂的SLE分類標準和SLE活動評分綜合判斷進行分度，其中輕度11例、中度27例、重度7例。根據血清miR-155表達水平及相關ROC曲線分析，將其分為高表達(血清miR-155>5.13)miR-155組28例和低表達(血清miR-155≤5.13)miR-155組17例。病例入選標準為采用糖皮質激素治療，可合用或不合用特異性免疫抑制劑，無其他重大合并疾病。3組年齡、性別有可比性(P均>0.05)。

1.2 治療方法 治療組患者均采用潑尼松治療，輕中度每日20～40 mg，重度每日50～80 mg,狼瘡危象則采用沖擊療法。潑尼松聯用環(huán)磷酰胺治療的患者共21例，環(huán)磷酰胺 0.5～1.0/m2體表面積加入生理鹽水中靜滴，前6個月每月1次，6個月以后每3個月1次，共2次，接下來以霉酚酸酯或硫唑嘌呤維持；聯用環(huán)孢素患者13例，環(huán)孢素3～5 mg/(kg·d)，每天分兩次口服；聯用硫唑嘌呤7例，1～3 mg/(kg·d);聯用甲氨喋呤4例，7.5～15 mg，口服，每周一次。所有患者在誘導緩解后潑尼松逐漸減至5～7.5 mg/d維持，免疫抑制藥以臨床有效最低劑量長期維持。療程療效評價標準以狼瘡活動評分(SLEDAI)減少≥3分為有效。根據SLEDAI及臨床醫(yī)生綜合判斷，將這些患者分為療效好(狼瘡活動評分較治療前減少3分以上)組27例和療效差(狼瘡活動評分較治療前減少小于3分或者沒有減少)組18例。

1.3 血清miR-155 mRNA的檢測 ①血清總RNA提?。翰捎妹绹?Qiagen 公司 miRNeasy 血清 miRNA 柱式提取試劑盒。200 μL血清樣本為研究對象，加入QIAzol 1 mL裂解，上下搖動后室溫充分裂解5 min；依次加入氯仿、異丙醇抽提總RNA，并通過濾柱吸附作用保留含有小RNA的總RNA，經過洗脫液RWT、RPE 及乙醇去除雜質后，最后將RNA產物溶解于焦碳酸二乙酯12 μL處理過的雙蒸水中，Nanodrop 2000紫外分光光度計檢測RNA濃度，-80 ℃保存待用。②RT-PCR：將健康人對照和SLE患者血清提取的總RNA 用RNA逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應。反應體系：RNA模板25 ng、RT引物工作液1 μL、無RNA 酶水補足至5.5 μL，混勻后瞬時離心，70 ℃ 10 min 后冰浴2 min，再加入以下試劑進行逆轉錄反應：RT緩沖液2.5 μL、dNTPs (2.5 mmol/L) 1 μL、RNA酶抑制劑(40 U/μL) 0.25 μL、RT酶(200 U/μL) 0.25 μL、無RNA酶水至12.5 μL。RT反應程序：42 ℃ 60 min，70 ℃10 min，然后用逆轉錄產物做RT-PCR。反應體系共25 μL，包括SYBR Green Mix 9 μL，逆轉錄產物2 μL，BulgeLoopTM miRNA Forward Prime(5 μmol/L)0.8 μL，Bulge-LoopTM miRNA Reverse Prime(5 μmol/L) 0.8 μL，無RNA 酶水補足至20 μL。反應程序：95 ℃預變性20 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，40個循環(huán)。U6作為內參基因，用miRNA-155及U6 的特異性引物進行逆轉錄。miR-155相對表達水平以與U6循環(huán)數之差2-ΔΔCt法計算。miR-155引物序列:上游5′-GTCCCAATGCTGTCT-3′,下游5′-GGAAGTTGCATGCAT-3′；U6引物序列：上游5′-CTTAGTTGCATGCAG-3′,下游5′-AATCGTGTATAAGTC-3′，引物均由廣州銳博生物技術公司設計并合成。

1.4 腎小球濾過率、血清高敏C反應蛋白(hs-CRP)、尿蛋白、血清補體的測算 采用99mTc-DTPA法測算腎小球濾過率，散射比濁法檢測血清hs-CRP，磺基柳酸比濁定量法檢測尿蛋白，ELISA法檢測血清補體C3、C4。

2 結果

2.1 兩組基本臨床特征比較 見表1、2。

表1 兩組腎功能,血清鈣、磷酸鹽、鈣磷乘積、堿性磷酸酶比較

表2 兩組血常規(guī)，血清hs-CRP、SLEDAI、血清補體比較

2.2 SLE組與對照組血清miR-155表達水平比較 SLE組血清miR-155相對表達水平為3.587±0.324，顯著低于對照組的5.320±0.564(t=4.462,P<0.05)。

2.3 血清miR-155表達水平與兩組臨床基本特征之間的相關性 SLE組中血清miR-155的表達水平與腎小球濾過率(r=0.576,P<0.001)、血清hs-CRP(r=0.406,P=0.003)呈顯著正相關，而與尿蛋白(r=-0.480,P=0.004)、SLEDAI(r=-0.553,P<0.001)呈顯著負相關。對照組中血清miR-155與臨床各指標無相關性(P均>0.05)。

2.4 血清miR-155在SLE中的診斷效能 血清補體C4和hs-CRP診斷SLE的ROC曲線下面積分別為0.816和0.784，診斷靈敏度分別為88%和76%，特異度分別為64%和74%；而血清miR-155的ROC曲線下面積為0.867，診斷的靈敏度和特異度分別為84%和78%，其ROC曲線下面積顯著高于血清補體C4和hs-CRP(P均<0.01)。

2.5 不同用藥患者血清miR-155水平比較及其對療效的預測價值 治療后，聯用環(huán)磷酰胺者血清miR-155表達水平為3.98±1.23，聯用環(huán)孢素者血清miR-155表達水平為3.73±0.78，聯用硫唑嘌呤者血清miR-155表達水平為4.09±1.02，聯用甲氨喋呤者血清miR-155表達水平為4.07±1.37，不同用藥患者血清miR-155表達水平差異無統計學意義(P均﹥0.05)，從而排除了不同治療藥物的干擾。進一步的研究發(fā)現，血清miR-155預測SLE患者糖皮質激素治療療效的ROC曲線的曲線下面積為0.782，靈敏度和特異度分別為78%、72%。療效好組治療前血清miR-155表達水平為4.33±0.86，治療后則升高至5.47±1.19，治療前后比較，P<0.05;療效差組患者血清miR-155水平在治療前后分別為3.13±1.02、3.51±1.08，治療前后比較，P>0.05。療效好組患者治療前血清miR-155表達水平高于療效差組(P<0.05)。

2.6 血清miR-155檢測對SLE患者預后的評估價值 高表達miR-155組中對糖皮質激素治療效果好的患者所占的比例為0.643(18/28)，低表達miR-155組中對糖皮質激素治療效果好的患者所占的比例為0.412(7/17)，高表達miR-155組療效好患者所占比例顯著高于低表達miR-155組(χ2=2.29,P<0.05)。高表達miR-155組從治療后到出現疾病復發(fā)的平均時間顯著長于低表達miR-155組(46比29個月，P=0.002)。

3 討論

miRNA廣泛參與調控固有免疫和適應性免疫細胞的分化發(fā)育與功能發(fā)揮，在生物發(fā)育和生理活動中起重要作用[4]。血液循環(huán)中的miRNA是一類能穩(wěn)定存在于外周血的miRNA，具有耐RNA酶的特點，在血漿中非常穩(wěn)定，不易被降解。腫瘤研究者認為可將血液循環(huán)中miRNA作為腫瘤診斷的標志物[7]。目前關于血液循環(huán)中miRNA與自身免疫性疾病的研究較少。SLE是一種發(fā)病機制不明，容易復發(fā)與緩解交替出現的疾病，給患者帶來了很大的痛苦，因此研究其血清中的miRNA表達水平，對尋找SLE診斷與治療監(jiān)測的生物標記物具有一定意義。前期研究發(fā)現，SLE外周血中miR1423p、miR181a、miR3423p、miR223和miR20a表達顯著升高，而miR106a、miR17、miR20a、miR203和miR92a表達顯著降低[8]。Wang等[9]研究發(fā)現，有19個miRNA表達升高，32個miRNA表達下降，其中包含miR-155。miR-155與基因的異常表達與一系列疾病的發(fā)生有關，如癌癥、心血管疾病、炎癥、自身免疫病及移植排斥反應等[10]。相關研究發(fā)現，miR-155通過靶向抑制轉化生長因子β激活激酶結合蛋白2負調控干擾素產物，從而防止?jié){細胞樣樹突細胞對Toll樣受體刺激過反應，提示miR-155與SLE的發(fā)生發(fā)展密切相關[11]。本研究結果與該研究結果相一致，血清miR-155在SLE患者外周血中表達降低，且與SLE相關炎癥指標相關，說明miR-155可能是SLE的潛在調節(jié)因子。

本研究發(fā)現，SLE患者的血清補體水平顯著降低，而hs-CRP顯著升高。miR-155在SLE患者血清中表達水平顯著降低，并且其降低水平與腎功能顯著相關，提示血清miR-155可能參與SLE相關的炎癥反應過程；進一步研究發(fā)現,血清miR-155診斷SLE的ROC曲線下面積達到了0.867，敏感度和特異度分別達到了84%和78%。提示血清miR-155對SLE的診斷有較大價值，是SLE潛在的診斷標志物。

SLE的治療一直是臨床所面臨的難點，由于發(fā)病機制不明，其治療一直以抑制自身免疫反應為主，療效不確定，不良作用大。因此尋找新的治療方法和發(fā)現新的治療靶點成為提高SLE疾病預后的重點。Wang等[12]研究發(fā)現，血miR-146和miR-155與SLE治療效果顯著相關，高表達miR-146和miR-155的SLE患者對骨化三醇的治療反應性強。杜文勝等[13]研究發(fā)現，外周血單核細胞miR-155水平在有效治療之后顯著升高，這些研究說明miR-155可能對提高SLE的治療療效有重要意義。我們研究了miR-155在糖皮質激素治療后SLE患者預后中的作用，發(fā)現miR-155在療效好的SLE患者血清中表達水平顯著升高，高表達miR-155的患者對糖皮質激素的治療反應更好，且具有更長的無病生存期。提示血清miR-155是SLE患者糖皮質激素治療的預后因子。

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Changes in levels of serum miR-155 in patients with systemic lupus erythematosus

HuangYang1,GEXiaosong,WUPing

(1TheAffiliatedHospitalofJiangnanUniversity/TheFourthPeople'sHospitalofWuxi,Wuxi214000,China)

Objective To investigate the changes in levels of serum miR-155 in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) and its significance. Methods Serum samples were collected from 50 patients with SLE (SLE group), and 40 healthy individuals (control group) and 45 SLE patients receiving glucocorticoids treatment (treatment group) were also selected. The serum level of miR-155 was detected by RT-qPCR. Then, the association between serum miR-155 level and clinical characteristics, treatment response of glucocorticoids was analyzed. Moreover, the diagnostic and prognostic value of serum miR-155 in SLE patients receiving glucocorticoid treatment was also investigated.Results In the SLE group, the serum miR-155 level was positively correlated with GFR (r=0.576,P<0.001) and hs-CRP (r=0.406,P=0.003) levels, while was negatively correlated with proteinuria (r=-0.480,P=0.004) and SLEDAI (r=-0.553,P<0.001). However, in the control group, no significant correlation was found between miR-155 and those four indexes. Receiver operator curve analysis showed that the area under the curve (AUC ) of miR-155 was 0.867, which was significantly higher than C4and hs-CRP (z=3.837,P<0.01). Besides, the sensitivity and specificity of miR-155 reached 84% and 78%, respectively. Moreover, the AUC of miR-155 in differentiating response to glucocorticoids was 0.782, with the sensitivity and specificity of 78% and 72%, respectively. The expression of miR-155 was significantly increased in patients showing better response to glucocorticoids treatment (the SLEDAI decreased more than 3 points after treatment) as compared with that of patients showing poor response (the SLEDAI decreased no more than 3 points after treatment) (P<0.05). Then we compared the expression variety of miR-155 in SLE patients before and after the glucocorticoids treatment. Our results showed that a statistical significance was found in patients with better response (P<0.05), while no statistical significance was found in patients with poor response (P>0.05). The proportion of patients showing better response to glucocorticoid was significantly higher in the high miR-155 expression group than in the low expression group (χ2=2.29,P<0.05). More importantly, SLE patients with high miR-155 expression showed longer disease-free survival as compared with that of patients with low miR-155 expression (46 months vs.29 months,P=0.002). Conclusion Serum miR-155 is highly expressed in patients with SLE, and can serve as a potential diagnostic marker, therapeutic target and prognostic indicator in SLE.

systemic lupus erythematosus; microRNA-155; glucocorticoids

國家自然科學基金青年項目(81502042)；江蘇省自然科學基金青年項目(BK20140171)。

黃陽(1974-)，副主任醫(yī)師，主要研究方向：系統性紅斑狼瘡的臨床研究。E-mail: wangyangjswx@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.008

R593.24

A

1002-266X(2016)45-0027-04

2016-07-14)