郭偉

（南京市江寧區(qū)林業(yè)局，江蘇南京211100）

麥谷蛋白源外啡肽B5對肉雞免疫功能的影響

郭偉

（南京市江寧區(qū)林業(yè)局，江蘇南京211100）

麥谷蛋白源GE-B5來源于日常人類飲食中的主要糧食產(chǎn)品小麥的蛋白酶解產(chǎn)物，具有阿片樣的生物學(xué)特性，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其有調(diào)節(jié)激素分泌進(jìn)程，進(jìn)而調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)；延緩哺乳動物胃排空，抑制其腸道運動；具有一定的免疫反應(yīng)性等功能。麥谷蛋白源GE-B5屬于阿片樣物質(zhì)中免疫反應(yīng)性最強的一種外啡肽。試驗根據(jù)麥谷蛋白源GE-B5氨基酸結(jié)構(gòu)，采用人工合成的方式，優(yōu)化工藝制得高純度的麥谷蛋白源GE-B5；將制得的GE-B5添加到傳染性支氣管炎滅活疫苗中作用于肉仔雞，通過對雞淋巴細(xì)胞增殖測定及雞血清中抗體效價的檢測，以判定麥谷蛋白源GE-B5的免疫效果。結(jié)果表明，人工合成的麥谷蛋白源GE-B5純度高、成本低，一定濃度的GE-B5可明顯促進(jìn)雞外周血淋巴細(xì)胞增殖和血清抗體水平。因此，麥谷蛋白源GE-B5具有一定的免疫增強作用。

麥谷蛋白；外啡肽B5；免疫功能

麥谷蛋白的谷類食品是存在于人類日常飲食中的主要糧食產(chǎn)品，包括小麥、大麥及黑麥。谷蛋白攝入量與麩質(zhì)過敏癥及失調(diào)癥（如糖尿病、抑郁癥和精神分裂癥）緊密相關(guān)[1]。然而，迄今為止，關(guān)于谷蛋白攝入可能對人體產(chǎn)生有毒的影響意見還不一致，因為麩質(zhì)過敏癥患者往往沒有明顯癥狀。面筋是包含麥谷蛋白和麩朊的主要結(jié)構(gòu)蛋白復(fù)合物。麥谷蛋白是獨特的蛋白質(zhì)類高分子聚合物，且為小麥蛋白質(zhì)的小部分，可溶于稀酸溶液。谷粒中乙醇可溶性蛋白質(zhì)被稱為醇溶谷蛋白，在小麥中的醇溶谷蛋白即被特稱為麩朊。麩朊能進(jìn)一步促進(jìn)阿片樣物質(zhì)的多肽（外啡肽）在消化道集為一體。在哺乳類動物日常的主要糧食產(chǎn)品中，存在一些特殊蛋白質(zhì)，該類特殊蛋白質(zhì)隱藏含有一些特殊的肽質(zhì)（能夠被消化酶作用分解釋放，且能夠參與內(nèi)分泌協(xié)調(diào)的特殊肽）[2]。經(jīng)研究證明，該類谷類食品特殊蛋白質(zhì)中隱藏含有的特殊肽即為阿片肽。

在哺乳類動物激素分泌進(jìn)程中，阿片樣物質(zhì)和生長素激素抑制素系統(tǒng)是用于調(diào)整細(xì)胞增殖擴(kuò)散的2種主要調(diào)節(jié)系統(tǒng)。其中，阿片樣物質(zhì)對腸道運動的影響極為顯著。胃排空和腸道運動受阿片樣物質(zhì)內(nèi)因性和外因性的影響。嗎啡因能延長人類胃腸道運動時間而聞名，但其作用能被納洛酮（一種嗎啡拮抗藥）所消除[3]。早期研究表明，麥谷蛋白外啡肽能誘導(dǎo)胃腸道通過時間大大增加，當(dāng)嗎啡拮抗藥作用時，該效果被徹底摧毀，最新研究結(jié)果不斷驗證了科學(xué)家的早期發(fā)現(xiàn)。目前，麥谷蛋白外啡肽能延緩胃排空、抑制腸道運動的作用已廣為大家所接受。

阿片樣物質(zhì)的免疫反應(yīng)性在人類腫瘤形成過程首次由Lundberg等證明，抗血清、阿片樣物質(zhì)的特效藥（由兔培養(yǎng)）像腦啡肽一樣具有免疫反應(yīng)性。在1987年，Zagon等[4]研究發(fā)現(xiàn)，阿片樣肽類存在于人和動物腫瘤神經(jīng)系統(tǒng)和非神經(jīng)組織中；腫瘤被發(fā)現(xiàn)起源于外胚層、中胚層和內(nèi)胚層，既有惡性的也有良性的；該研究認(rèn)為，阿片樣物質(zhì)是大部分腫瘤細(xì)胞的整體部件。阿片肽是一類具有免疫反應(yīng)性、能夠調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)、延緩胃排空、抑制腸道運動的阿片樣物質(zhì)。其分為外源性阿片肽（外啡肽）和內(nèi)源性阿片肽（內(nèi)啡肽）[5]。其中，外啡肽又根據(jù)其組織結(jié)構(gòu)分為5大類，本試驗研究的外啡肽B5為其中較為重要的一類。對于阿片樣物質(zhì)免疫反應(yīng)性這一特性，外啡肽B5效果最為顯著。

本試驗擬將麥谷蛋白源GE-B5與傳染性支氣管炎滅活疫苗混合作用于肉仔雞，通過檢測肉雞的免疫性能，從而為GE-B5的進(jìn)一步使用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物和抗原傳染性支氣管炎病毒毒株

傳染性支氣管炎病毒非免疫肉仔雞（180只、1日齡）（泰安東岳種禽有限公司）；疫苗抗原傳染性支氣管炎病毒（IBV）IBVM41（試驗用）（江蘇省生物教學(xué)示范中心）；SPF雞胚（上海拜力生物科技有限公司）。

1.1.2 試驗試劑淋巴細(xì)胞分離液（美國BECKMAN COULTER有限公司）；RPMI1640固體粉狀培養(yǎng)基（上海創(chuàng)賽科技有限公司），配制培養(yǎng)基基本步驟：先采用超純水配制；再加入青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL；再加入細(xì)胞培養(yǎng)生長液，采用濃度為10%的小牛血清（鄭州九龍生物制品有限公司）實現(xiàn)；5 mg/mL的四甲基偶氮唑藍(lán)溶液和1 mg/mL的ConA溶液（Spectrum公司）（過濾采用0.22 μm的混合纖維素酯濾膜）；DEPC水（Amresco公司）；乙醇、氯仿、異丙醇和二甲亞砜等均為分析純。

1.1.3 外啡肽B5的人工合成根據(jù)其氨基酸的一級結(jié)構(gòu)特點，以優(yōu)化化學(xué)合成工藝為準(zhǔn)則，采用小肽固相合成法進(jìn)行化學(xué)合成，具體操作流程及步驟由青島沃生生物科技有限公司加工合成，其合成路線如圖1所示。

對加工所得產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜鑒定（先經(jīng)高效液相色譜分析及純化），結(jié)果證明，所得產(chǎn)物為高純度的目標(biāo)產(chǎn)物，將其冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 傳染性支氣管炎病毒抗原制備及殘留毒素檢測選取SPF雞胚（9～10日齡），將其培養(yǎng)1代，獲得疫苗抗原IBVM41株（試驗用）。按照一般方法用0.1%的甲醛處理新獲得的IBV M41雞胚尿囊液（每0.1 mL≥106EID50），滅活24 h，將處理后得到的雞胚尿囊液作為疫苗抗原，放于冰箱冷藏保存（4℃）備用。為雞胚（9～10日齡）接種按照上述方法制備的滅活病毒，每枚雞胚接種0.1 mL，在37℃環(huán)境下培養(yǎng)，培養(yǎng)3代后，觀察記錄受接種雞胚情況；取存活雞胚尿囊液測定活胚尿囊液病毒血凝效價，進(jìn)行殘留毒素檢測。

1.2.2 滅活疫苗制備其制備過程如表1所示。

表1 滅活疫苗制備過程

1.2.3 滅活疫苗成品質(zhì)量檢測將1.2.1滅活疫苗成品接種在普通瓊脂板和血平板2種平板上進(jìn)行檢驗。在37℃的環(huán)境下培養(yǎng)5 d，觀察記錄2種平板上有無細(xì)菌生成。試驗組是對每只肉仔雞（14日齡）注射上述滅活疫苗成品1 mL。對照組是對每只肉仔雞（14日齡）注射滅菌生理鹽水1 mL。接種滅活疫苗成品及滅菌生理鹽水后記錄觀察14 d（主要觀察精神狀態(tài)及有無不良癥狀[7]）。

1.2.4 試驗動物處理傳染性支氣管炎病毒非免疫雛雞（180只種禽）隨機(jī)分為6組（每組為30只，試驗組為1～5組，對照組為第6組），籠養(yǎng)，自由采食飲水。其中，試驗組于14，21 d時均采用滅活疫苗（0.1 mL/只，105EID50/0.1 mL）注射，誘發(fā)肉仔雞產(chǎn)生免疫反應(yīng)。對照組是不對肉仔雞進(jìn)行任何處理。

1.2.5 雞淋巴細(xì)胞（PBMC）增殖試驗

1.2.5.1 雞外周血淋巴細(xì)胞的制備從雞的外周血中分離培養(yǎng)淋巴細(xì)胞，對肉仔雞第1次注射滅活疫苗成品后14，21 d時，分別從雞翅靜脈處取1 mL外周血（無菌操作）；后將外周血緩緩沿側(cè)壁加入已含有淋巴細(xì)胞分離液4 mL的離心管中，將外周血加入分離液的液面上。對玻璃離心管進(jìn)行離心，以2 000 r/min的速度，離心15 min。離心后得到上下2層，采集上下2層界面上的細(xì)胞（肉眼觀察呈白色霧狀）；將采集到的界面細(xì)胞加入新的離心管中，且用PBS緩沖液加入界面細(xì)胞溶液至8 mL，手動搖勻，以2 000 r/min對新離心管離心10 min，去除上層清液，對下層沉淀（界面細(xì)胞）用PBS緩沖液洗滌2次，得到的細(xì)胞即為雞外周血淋巴細(xì)胞；用活細(xì)胞染色計數(shù)的方法，通過營養(yǎng)液調(diào)節(jié)，將雞外周血淋巴細(xì)胞密度調(diào)至5×106個/mL。然后將雞外周血淋巴細(xì)胞懸液加入細(xì)胞板中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5.2 淋巴細(xì)胞增殖試驗將1.1.3人工化學(xué)合成的終外啡肽B5質(zhì)量濃度調(diào)至10，20，40，80 mg/L，將4種質(zhì)量濃度的GE-B5加入到酶標(biāo)孔中各100 μL，每種質(zhì)量濃度做3次水平重復(fù)；陰性對照：100 μLRPMI-1640培養(yǎng)基加入PBS緩沖液，3次水平重復(fù)；陽性對照：100 μL RPMI-1640培養(yǎng)基加入氫氧化鋁。所有孔均加入刀豆球蛋白A，3次水平重復(fù)；將酶標(biāo)板置于37℃環(huán)境下培養(yǎng)44 h后，每酶標(biāo)孔加入40 μL噻唑藍(lán)，再置于37℃環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)4 h[8]。吸除孔中完全培養(yǎng)液，每酶標(biāo)孔加入100 μL二甲基亞砜，手動振蕩溶解沉淀。將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀上，測定OD570的值，參照文獻(xiàn)[9]計算刺激指數(shù)。

1.2.6 血清抗體效價檢測測量抗體效價參考A-vian等2008年研究的OIE方法[10]進(jìn)行。對肉仔雞第1次注射滅活疫苗成品后14，21，28 d時，分別從雞翅靜脈處取血分離（無菌操作），按國標(biāo)用微量檢檢測法測定血清效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工合成外啡肽B5產(chǎn)物檢測結(jié)果

由青島沃生生物科技有限公司操作，采用小肽固相合成法進(jìn)行化學(xué)合成，對加工所得產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜鑒定（先經(jīng)高效液相色譜分析及純化），結(jié)果證明，所得產(chǎn)物為高純度的目標(biāo)產(chǎn)物，達(dá)到試驗所設(shè)想的預(yù)期目標(biāo)，質(zhì)譜鑒定測得分子量為594 Da（圖2），高效液相色譜分析測得，其GE-B5產(chǎn)物濃度大于98%（圖3）。

2.2 IBV抗原殘留毒素檢測及疫苗成品質(zhì)量檢測結(jié)果

將滅活疫苗成品通過接種平板和對滅活疫苗成品毒液進(jìn)行離心2種方法，觀察有無雜菌生成及有無離心分層，判定滅活疫苗成品質(zhì)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本試驗中制備的滅活疫苗沒有菌落生長，且離心后沒有分層。

2.3 GE-B5對雞淋巴細(xì)胞增殖效果

試驗采取的是MTT比色法[10]即噻唑藍(lán)比色法檢測細(xì)胞存活和生長情況。由圖4、表2可知，試驗組中質(zhì)量濃度為20，40，80 mg/L的刺激指數(shù)（SI值）均比對照組高，且GE-B5質(zhì)量濃度為20 mg/L時的刺激指數(shù)最高[6]。因此，外啡肽B5在質(zhì)量濃度為20 mg/L時對雞淋巴細(xì)胞增殖效果最好。

表2 雞血清中IBV抗體效價測定結(jié)果log2

2.4 GE-B5對雞血清抗體效價影響結(jié)果

從表2可以看出，使用GE-B5組的肉仔雞的IBV抗體效價顯著高于空白對照組，特別是試驗2，3，4組更為顯著。說明GE-B5可顯著提高肉仔雞的抗體效價，抗體效價是衡量機(jī)體抵抗病原能力的重要指標(biāo)。

3 討論

淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答功能的重要組成部分[11]。本試驗通過測定肉雞外周血中淋巴細(xì)胞的增殖評價麥谷蛋白源GE-B5有無免疫效果，結(jié)果顯示，普通情況下，將傳染性支氣管炎病毒滅活疫苗注射到肉雞體內(nèi)，肉雞的免疫應(yīng)答較弱，產(chǎn)生的抗體水平較低[12]；在傳染性支氣管炎病毒滅活疫苗中加入氫氧化鋁，肉雞的免疫應(yīng)答有所增強；在傳染性支氣管炎病毒滅活疫苗中加入不同質(zhì)量濃度的麥谷蛋白GE-B5，肉雞的免疫應(yīng)答均有明顯增強，且以質(zhì)量濃度為20 mg/L的麥谷蛋白GE-B5的添加量效果最為顯著。證明一定濃度麥谷蛋白GE-B5可以加入到滅活病毒疫苗中，制成滅活疫苗成品，以改善受體的免疫應(yīng)答，增強抗體水平。

外啡肽是非常高效的物質(zhì)，其極低濃度范圍內(nèi)就能發(fā)揮作用。盡管外啡肽的受體具有一定的特異性，但許多結(jié)構(gòu)的變化還是在可識別范圍內(nèi)[13]，雖然結(jié)構(gòu)的變化可能會伴隨著效用的降低，但事實上，就算只有1%的外啡肽，依然會是有效的并且有較強的藥理作用[14]。食物中的蛋白也有與之相類似但不完全相同的肽鏈序列，這是一種從外源性食物中得到的阿片樣肽，這種肽就是本試驗研究的外啡肽[15]?？梢栽谖傅鞍酌阜纸獾男←湹鞍字邪l(fā)現(xiàn)具有活性的外啡肽，這種蛋白常常作為治療腹腔疾病的ARIMAR因子為人所知，并且被認(rèn)為有可能是精神分裂癥的病因[16]。

由于谷蛋白源的GE-B5具有非特異性，故其能被添加到多種病毒疫苗中混合制得滅活疫苗成品，且GE-B5相較于傳統(tǒng)的氫氧化鋁，其免疫增強作用更為明顯。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，谷蛋白來源的GE-B5可采用人工合成方法制得，且得到的成品純度較高，通過給肉雞注射添加過谷蛋白來源的GE-B5的滅活疫苗成品，觀察記錄并測定雞外周血的淋巴細(xì)胞的增殖，結(jié)果顯示，與對照組相比，不同質(zhì)量濃度的谷蛋白來源的GE-B5均可明顯增強免疫應(yīng)答；并通過對滅活疫苗注射后雞血清抗體效價的測定，結(jié)果驗證了谷蛋白來源的GE-B5的免疫增強作用。

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Effects of Gluten Exorphin-B5 on Immune Function of Broilers

GUOWei
（NanjingJiangningForestryAdministration，Nanjing211100，China）

Gluten exorphin B5 was derived fromthe main food in dailyhuman diet products the protease solution products ofwheat. Gluten exorphin B5 was the biological characteristics of opioid.Up to now,the biological characteristics such as regulating hormone secretion process,regulating the endocrine system,delaying mammals gastric emptying,holding the bowel movement,having certain immune reactivity had been found.Gluten exorphin B5 was the strongest immune reactivity in opioid.According to the source of glutenin GE-B5 amino acid structure,with the method of artificial synthesis,optimizing process for high source of Gluten exorphin B5 was done in this experiment.High source of Gluten exorphin B5 were added to IBV.Through the determination of lymphocyte proliferation,the immune effect of Gluten exorphin B5 was determined.The resules showed that chemically synthesized Gluten exorphin B5 had high purity and lowcost.Appropriate concentration ofGE-B5 could obviously promote the chicken peripheral PBMC proliferation.So,Gluten exorphin B5 has a certain immune enhancement effect.

gluten protein;Gluten exorphin B5;immunogenicity

S831.92

A

1002-2481（2016）12-1843-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.12.26

2016-08-01

郭偉（1981-），男，江蘇南京人，助理畜牧師，主要從事動物疫病控制研究工作。