張妍，楊金宏

（安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西省蠶桑重點實驗室，陜西安康725099）

茶樹紫陽種RbcL基因片段的克隆與序列分析

張妍，楊金宏

（安康學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西省蠶桑重點實驗室，陜西安康725099）

RbcL基因是綠色植物進行光合作用的關(guān)鍵基因，其序列是分子系統(tǒng)學(xué)研究中使用最為廣泛的分子標(biāo)記之一。利用PCR擴增和測序，獲得了茶樹紫陽種RbcL基因744 bp的序列。對來自山茶科7個樣品的RbcL序列進行比對和系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果顯示，山茶屬的白毛變種、金花茶和丹寨禿茶首先與紫陽茶聚合，其他山茶科植物位于核心聚類群的外圍。以大頭茶RbcL基因為參照，進行山茶屬植物SNP位點的分析，結(jié)果顯示，在所比對的744 bp的序列中，山茶屬共存在10個SNP位點，其中，同義替換4個，非同義替換6個。

茶樹紫陽種；RbcL基因；序列分析

DNA條形碼（DNA barcoding）是根據(jù)生物的遺傳物質(zhì)序列種內(nèi)變異小于種間變異而實現(xiàn)物種鑒定的一種方法[1]。通過利用1個或幾個DNA片段序列對物種進行識別和鑒定，具有快速、準(zhǔn)確、客觀性強的特點，可以避免在傳統(tǒng)鑒定方法中人為因素所造成的主觀誤判，能夠提高鑒定的效率和準(zhǔn)確性。RbcL基因的編碼蛋白是1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RuBisCo）的活性中心，在光合和光呼吸過程中起重要作用，其含量占綠色植物葉片總蛋白的50%，是自然界中含量最豐富的蛋白質(zhì)[2]。RbcL基因不具有內(nèi)含子，位于葉綠體基因組的大單拷貝區(qū)（LSC），以單拷貝形式存在，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在綠色植物的系統(tǒng)進化研究中。迄今為止，已經(jīng)測定了被子植物、裸子植物、苔蘚、海藻、光合細菌等多種不同材料中的RbcL基因序列[3]。

陜西安康的紫陽茶產(chǎn)區(qū)以紫陽縣為中心，地處秦嶺南坡，大巴山北麓，具有適宜種茶的土壤條件、氣候和品種資源優(yōu)勢，是我國長江以北的重要產(chǎn)茶區(qū)之一[4]。紫陽群體種原產(chǎn)地包括安康的紫陽、平利、漢陰、旬陽、漢濱、石泉、嵐皋、鎮(zhèn)坪等縣區(qū)，以及漢中的鎮(zhèn)巴、西鄉(xiāng)等地區(qū)，主要分布在海拔1 000 m以下的河谷、丘陵、低山等地帶，是該茶區(qū)分布最廣的一個群體。紫陽種選育自紫陽群體種中葉類櫧葉種，是全國推廣的良種，各種有益成分高，自然品質(zhì)好，硒含量豐富，現(xiàn)人工種植已經(jīng)遍布陜西全省，其產(chǎn)量約占陜西省總產(chǎn)量的3/4[5]。

微量元素硒與人體免疫功能、抗氧化能力、抗癌作用等密切相關(guān)[6]。近年來，因紫陽地處富硒帶，紫陽富硒茶發(fā)展勢頭十分強勁，2014年全縣產(chǎn)茶4 565 t，實現(xiàn)產(chǎn)值7.5億元，市場前景廣闊[7]。但同時以非紫陽茶冒充紫陽茶等的不良市場行為也日益突出，嚴重損害了紫陽茶的信譽及消費者的利益。茶葉品種是成品茶品質(zhì)的基礎(chǔ)，因此，對茶葉品質(zhì)有效鑒別的前提是對成品茶的茶樹品種進行鑒別。如何從技術(shù)上對成品茶進行有效鑒別、維護茶葉市場的正常秩序、促進紫陽茶產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，具有重要的現(xiàn)實意義。

本研究成功地克隆了茶樹紫陽種RbcL基因片段，并利用多序列比對技術(shù)對不同茶葉品種的SNP位點進行了分析，找到了紫陽種特有的SNP位點，并進一步對RbcL基因的適應(yīng)性進化進行研究，旨在為紫陽群體種的來源和紫陽茶的鑒定提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料為紫陽種陜茶一號茶葉成品，購自安康市漢水韻茶葉有限公司[8]。

1.2 主要試劑

大腸桿菌DH5α由陜西省蠶桑重點實驗室保存，瓊脂糖購自Biowest公司，HP植物DNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司，EcoR I限制酶、Taq DNA聚合酶、DNA凝膠回收試劑盒、DNA marker（DL2 000，λ-EcoT14Ⅰdigest）等購自大連寶生物工程有限公司，pGEM-T Easy Vector購自Promega公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 方法

1.3.1 紫陽茶基因組DNA提取和RbcL基因的PCR擴增稱取茶葉干燥成品50 mg，加液氮冷凍研磨，后使用植物DNA提取試劑盒提取茶葉總DNA；同時用同樣的方法提取鮮葉基因組作為質(zhì)量對照。根據(jù)常用的RbcL基因序列擴增引物和NCBI登錄的茶葉葉綠體基因組序列設(shè)計引物，其序列分別為RbcLF：5′-TTATGTCACCACAAACAGAAAC-3′；RbcLR：5′-TTCGCATGTACCTGCAGTAGC-3′。以提取的干燥成品基因組DNA為模板和設(shè)計的引物進行PCR擴增，PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸50 s，30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測。

1.3.2 紫陽茶葉RbcL基因的克隆鑒定和測序利用DNA凝膠回收試劑盒回收純化目的條帶，并與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，送上海生工武漢測序部進行測序。所有步驟均按試劑使用說明書進行。

1.3.3 RbcL基因的序列分析NCBI在線BLAST對紫陽種茶葉的RbcL基因序列進行比對，并下載山茶科的相關(guān)序列（表1），采用Clustal X1.83軟件分別進行多序列比對[9]，采用BoxShade 3.21[10]對比對的序列文件進行描影和打印，統(tǒng)計山茶屬內(nèi)植物的SNP位點。采用Mega 5.0軟件構(gòu)建山茶科內(nèi)基于RbcL基因的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，計算1 000次的自展支持值[11]。

表1 所使用的序列及其登錄號

2 結(jié)果與分析

2.1 紫陽種成品茶RbcL基因PCR擴增和克隆測序結(jié)果

HP植物DNA提取試劑盒（OMEGA）是基于CTAB法[12]的植物基因組提取試劑盒，利用該試劑盒可以成功地提取茶葉成品中的基因組DNA，與鮮葉比較發(fā)現(xiàn)，雖然有部分基因組的降解，但主帶明顯，可以用于PCR等下游實驗（圖1-A）。以提取的紫陽種成品茶葉基因組DNA為模板，利用RbcLF和RbcLR引物進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在約750 bp處出現(xiàn)單一擴增條帶（圖1-B），與預(yù)期大小相符。回收該條帶并進行克隆，陽性克隆經(jīng)限制性酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示，出現(xiàn)載體和目的片段條帶（圖1-C），表明克隆成功。對陽性克隆進行測序，結(jié)果顯示，獲得了RbcL基因自起始密碼子起始的長744 bp的序列（Genbank登錄號：KR296794），表明利用該方法可以成功獲得成品茶葉RbcL基因的序列。

2.2 RbcL基因的多序列比對SNP分析

在線BLAST比對分析結(jié)果顯示，茶樹紫陽種RbcL基因與其他山茶屬植物的同源區(qū)域的相似性在98%以上，保守性較高。以大頭茶屬大頭茶的RbcL基因為參照，分析山茶屬植物的SNP位點，結(jié)果顯示，在所比對的744 bp序列中，本研究的6個山茶科植物中共存在10個SNP位點，其中，發(fā)現(xiàn)2個紫陽種獨有的SNP位點（圖2）。在所有SNP位點中，沒有造成氨基酸變化的同義替換（Ks）位點有4個，造成氨基酸變化的非同義替換（Ka）位點有6個，多于Ks位點數(shù)，顯示其進化可能受到正選擇壓力。

2.3 RbcL基因的系統(tǒng)進化分析

下載其他山茶科植物的RbcL基因同源區(qū)域的序列進行Clustal X比對和系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果顯示，來自山茶科山茶屬的白毛變種、金花茶和丹寨禿茶首先與紫陽茶聚合，然后與生于海拔2 200 m以上的五柱滇山茶聚合，來自大頭屬的大頭茶和木荷樹屬的港口木荷分別位于核心聚類群的外圍（圖3）；金花茶和白毛變種樹枝分歧的分值低于500，說明該基因非常保守，可能經(jīng)歷回復(fù)突變；靠近根部的自展支持值普遍高于樹枝末梢，說明該基因適合用于屬間的遺傳進化分析，不適合用于屬內(nèi)親緣關(guān)系近的物種的遺傳分析。

3 討論與結(jié)論

DNA條形碼作為一種新的分類系統(tǒng)，可以彌補傳統(tǒng)進化和分類方法的不足，加快全球生物物種系統(tǒng)進化和鑒定的步伐，其自Hebert于2003年提出后，已經(jīng)在動物、植物、真菌和藻類等的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究中發(fā)揮了重要作用。在植物中，RbcL，MatK，ITS是目前使用較多的DNA條形碼候選序列，但對每一植物科、屬或種內(nèi)都需進行針對性的研究和探索[13]。茶樹是典型的異花授粉植物，容易發(fā)生雜交和網(wǎng)狀進化，經(jīng)過長期的人工和自然選擇，遺傳背景非常復(fù)雜，各品種間擁有豐富的遺傳多樣性[14]。本研究結(jié)果表明，金花茶和白毛變種樹枝分歧的分值僅為256，低于500，不具有統(tǒng)計學(xué)意義；而且靠近進化樹根部的自展支持值普遍高于樹枝末梢，說明在分歧較晚的物種間，該基因的進化位點較少，不適合單獨用于系統(tǒng)發(fā)育分析，需要聯(lián)合其他條形碼序列。

茶葉品種是形成成品茶品質(zhì)的關(guān)鍵，但“掛羊頭賣狗肉”的不良行為屢見不鮮，如以紅茶代替金駿眉、以巖茶代替大紅袍、以普通綠茶冒充紫陽富硒綠茶，嚴重破壞了茶葉市場，因此，如何進行有效的茶葉品種鑒定是急需解決的問題。陳海軍等[15]應(yīng)用隨機引物擴增多態(tài)性技術(shù)（RAPD）對目前浙江推廣的10個優(yōu)良茶樹品種進行分析，結(jié)果表明，引物S16能在各個品種擴增后產(chǎn)生特異性的分子標(biāo)記，可以用來鑒別這些品種。陳春梅[16]利用葉綠體基因psbA，ycf15和trnL-F間隔區(qū)對山茶屬植物13個種進行鑒別發(fā)現(xiàn)，ycf15和psbA基因序列在所選材料中SNP位點并不豐富，不適合用于山茶屬植物種間的鑒定，trnL-F間隔區(qū)序列進化速率較快，可用于山茶屬不同種間的親緣關(guān)系研究。本研究成功獲得了紫陽種成品RbcL基因744 bp的核苷酸序列，可以通過一個Sanger測序獲得該片段DNA信息，在山茶科內(nèi)，該片段具有明顯的種間變異，發(fā)現(xiàn)了10個SNP位點，而且2個是紫陽種特有的SNP位點，符合理想DNA條形碼的條件，可以用于紫陽種和紫陽茶的鑒定。

Ks一般不受選擇的影響，Ka的突變則因選擇壓力的不同而差異較大。在蛋白質(zhì)水平上，Ks/Ka的值可以用來判斷該基因的進化是否受到自然選擇的影響[17]。RbcL基因蛋白是世界上最豐富的蛋白質(zhì)，其進化和起源具有重要的意義。有研究針對水龍骨科49種植物所進行的相似分析中得到了7個位點受到正選擇壓力[18]。陳潔等[19]基于分支模型對42種蕨類植物的RbcL基因所受到的選擇壓力進行了分析，結(jié)果檢測到4個分支處于正選擇壓力下。本研究結(jié)果表明，山茶科6個種中存在10個SNP位點，其中，6個為非同義突變，4個為非同義突變，說明該基因受到正選擇壓力是一個普遍的現(xiàn)象。

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Clonging and Sequence Analysis ofRbcLGene inCamellia sinensiscv.Ziyang

ZHANGYan，YANGJinhong
（College ofMordern Agriculture and Biotechnology，AnkangUniversity，the KeySericultural LaboratoryofShaanxi，Ankang725099，China）

The RbcL is the key gene to carry out photosynthesis and its sequence is widely used in molecular phylogenetic studies in green plants.UsingPCR amplification and sequencing,the paper obtained the RbcL 744 bp sequence ofCamellia sinensis cv.Ziyang. The RbcL sequences of 7 samples within Theaceae Camellia were compared and cluster analysis.The results showed that Camellia sinensis cv.Ziyang,Camellia petelotii,Camellia sinensis var.pubilimba and Camellia danzaiensis voucher preferred polymerization at the same branch,other Theaceae was in the distant branch.Polyspora axillaris as a reference,SNP analysis of RbcL gene was analyzed within Camellia L..The results showed that in the comparison of 744 bp,10 SNP loci,4 synonymous and 6 nonsynonymous replacement were detected.

Camellia sinensis cv.Ziyang;RbcL gene;sequence analysis

S571.1

A

1002-2481（2016）12-1772-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.12.08

2016-07-31

陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（2016sxjy026）

張妍（1995-），女，陜西渭南人，在校學(xué)生，研究方向：植物分子標(biāo)記。楊金宏為通信作者。