樊新萍，喬永勝，石美娟，田 鑫，王 勇，武彥霞

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，山西太谷030800）

不同核桃品種葉片和莖抗寒性測(cè)定

樊新萍，喬永勝，石美娟，田 鑫，王 勇，武彥霞

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，山西太谷030800）

為了探討不同核桃品種及優(yōu)系的抗寒機(jī)制，以核桃生長(zhǎng)期葉片和休眠期一年生枝條為試材，應(yīng)用石蠟切片法、生理生化指標(biāo)測(cè)定法，測(cè)定分析葉片結(jié)構(gòu)、枝條生理生化指標(biāo)與抗寒性之間的相關(guān)性。SAS統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，柵欄組織厚度和葉片厚度、細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度（CTR值）是影響抗寒性的主要組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)，其葉片抗寒性強(qiáng)弱排序?yàn)椋航鸨∝S＞金薄香1號(hào)＞香玲＞西林2號(hào)。在低溫脅迫下，西扶1號(hào)、遼核1號(hào)、禮品2號(hào)當(dāng)年生枝條的過(guò)氧化物酶（POD）活性和可溶性蛋白含量比較高；而優(yōu)系FY-2、禮品2號(hào)、金薄香6號(hào)等品種的脯氨酸（FAS）含量和可溶性糖含量比較高。因此，核桃品種的抗寒性是植物適應(yīng)環(huán)境的一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程。

抗寒性測(cè)定；核桃；葉片組織結(jié)構(gòu)；生理生化指標(biāo)

由于核桃本身的特性以及許多地區(qū)每年初冬的驟至寒潮和早春的倒春寒氣候，常常使核桃樹(shù)遭受凍害，嚴(yán)重影響著核桃的產(chǎn)量和質(zhì)量，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，近年來(lái)，核桃樹(shù)凍害成為核桃生產(chǎn)中的重大問(wèn)題和制約核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的突出問(wèn)題。研究核桃的抗凍機(jī)制和防凍措施對(duì)于核桃生產(chǎn)的防凍減災(zāi)和抗凍育種都有重要的指導(dǎo)意義。

自20世紀(jì)以來(lái)，人們?cè)诤颂胰~片、枝條的解剖結(jié)構(gòu)、生化成分、質(zhì)膜透性、細(xì)胞液濃度、保護(hù)酶活性等方面已經(jīng)有了初步的研究。吳國(guó)良等[1]率先對(duì)核桃實(shí)生苗性狀與抗寒性關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞膜的透性和細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度可以作為核桃品種抗寒性鑒定的預(yù)選指標(biāo)。劉杜玲等[2]對(duì)早實(shí)核桃不同品種葉片組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行了抗寒性分析，結(jié)果分類出抗寒和不抗寒類型。白重炎等[3]對(duì)陜西渭南和渭北的一些核桃品種的葉片和莖組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，不同品種在葉莖解剖結(jié)構(gòu)的諸多方面存在差異。相昆等[4]對(duì)不同核桃品種耐寒性進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，對(duì)山東推廣的一些品種進(jìn)行了分析，結(jié)果確定了其適宜的栽培區(qū)域。王勇等[5]也對(duì)生產(chǎn)上的一些優(yōu)良品種進(jìn)行了生理生化指標(biāo)分析。近年來(lái)，有關(guān)核桃抗寒的分子生物學(xué)研究已迅速展開(kāi)，但還處于初步研究階段。

本研究擬從形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化指標(biāo)2個(gè)層面對(duì)不同核桃品種抗寒性進(jìn)行探討，深入理解核桃抗寒機(jī)制，旨在為核桃防寒減災(zāi)和抗寒育種提供服務(wù)，為解決核桃寒害奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所資源圃的8年生核桃樹(shù)的葉片（金薄香1號(hào)、金薄豐、香玲、西林2號(hào)）和枝條（金薄香1號(hào)、金薄香6號(hào)、金薄豐、遼核1號(hào)、香玲、禮品2號(hào)、西扶1號(hào)以及優(yōu)系FY-1和FY-2）為試材，分別于2014年6月和11月采集葉片和枝條。

1.2 石蠟切片法測(cè)試不同品種核桃葉片

夏季在資源圃采集不同品種的成熟葉片，當(dāng)年生枝第2個(gè)復(fù)葉向陽(yáng)面的第2片小葉，顏色深綠，以主脈為中心切1 cm×1 cm見(jiàn)方的小塊浸入50% FAA固定液中，固定24 h以上；然后用95%乙醇配成梯度酒精脫水處理，每梯度脫水2 h；再?gòu)募円掖贾鸩竭^(guò)渡到二甲苯中透明；將已熔石蠟和二甲苯配制成不同配比進(jìn)行浸蠟；最后包埋、切片、烤片。

將烤好的載玻片放入純二甲苯中30 min，再經(jīng)過(guò)不同梯度的酒精洗滌后，番紅-固綠染色，最后中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。利用軟件測(cè)定葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度，計(jì)算柵欄組織厚度/海綿組織厚度的值、細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度（CTR）（柵欄組織厚度/葉片厚度）和細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度（SR＝海綿組織厚度/葉片厚度）。所有測(cè)量數(shù)據(jù)均為30個(gè)視野的平均值。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

按照李合生[6]的方法處理試材，配液，提取粗酶液，對(duì)丙二醛（MDA）、可溶性蛋白、可溶性糖、游離脯氨酸含量、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物酶活性（POD）6個(gè)生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定與分析。

MDA活性的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法（采用TBA顯色法）[7]；可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G250法[8]；可溶性糖含量的測(cè)定采用張志良等[8]的蒽酮-乙酸乙酯法；脯氨酸含量的測(cè)定采用酸性茚三酮法[9]；SOD活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑（NBT）還原法[10]；POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[10]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析用Excel和SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同核桃品種葉片解剖結(jié)構(gòu)與抗寒性的關(guān)系

從表1可以看出，各個(gè)品種的葉片結(jié)構(gòu)有明顯的差異，葉片厚度均值為167.06 μm，其中，金薄香1號(hào)的葉片厚度最大，為193.97 μm，香玲的最小，為142.77μm，變異系數(shù)為8.96%。其中，金薄香1號(hào)和香玲葉片厚度之間呈顯著差異性。

金薄豐的柵欄組織厚度最大，為94.12 μm；香玲的最小，僅為66.13 μm，二者有顯著差異性，其變異系數(shù)為3.77%。金薄豐的柵海比最大，西林2號(hào)最小，變異系數(shù)為0.15%，二者之間差異顯著。金薄豐的CTR值最大，香玲的最小，變異系數(shù)為0.02%，各個(gè)品種間CTR值差異不顯著。西林2號(hào)的SR值最大，金薄豐最小，變異系數(shù)為0.03%，二者之間差異顯著。

表1 4個(gè)核桃品種葉片組織結(jié)構(gòu)指標(biāo)差異性比較

表1的變異系數(shù)數(shù)據(jù)顯示，核桃葉片的葉片厚度（8.96%）、柵欄組織厚度（3.77%）、海綿組織厚度（7.06%）等在同一種類的不同樣品間會(huì)有較大浮動(dòng)，但是其比值（柵海比（0.15%），CTR（0.02%），SR（0.03%））在同一種類的不同樣品間保持相對(duì)一致性。這反映了種或品種間的遺傳特性。而抗寒性正是植物的遺傳特性之一。

從表2可以看出，4個(gè)核桃葉片的柵海比值與CTR值具有顯著正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.958；與SR值具有顯著負(fù)相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為-0.973。

由表3可知，在主分量分析結(jié)果中，綜合指標(biāo)1的貢獻(xiàn)率達(dá)61.72%，綜合指標(biāo)2的貢獻(xiàn)率為27.82%，二者之和達(dá)到89.54%。在綜合指標(biāo)1中，SR和海綿組織厚度的絕對(duì)系數(shù)值排在前2位，所以綜合指標(biāo)1是以SR和海綿組織厚度為主的排隊(duì)結(jié)果。從表4可以看出，西林2號(hào)的絕對(duì)系數(shù)值最大，香玲排在第2位，也就是說(shuō)西林2號(hào)和香玲的SR（葉片細(xì)胞疏松度）和海綿組織厚度值較其他品種較大。在綜合指標(biāo)2中，柵欄組織厚度和葉片厚度絕對(duì)系數(shù)值排在前2位，所以，綜合指標(biāo)2是以柵欄組織厚度和葉片厚度為主的排隊(duì)結(jié)果。從表4還可以看出，金薄豐的絕對(duì)系數(shù)值最大，金薄香1號(hào)排在第2位，也就是說(shuō)金薄豐和金薄香1號(hào)的柵欄組織厚度和葉片厚度值較其他品種大。

根據(jù)彭偉秀等[11]、簡(jiǎn)令成等[12]的研究結(jié)果可知，CTR即細(xì)胞組織緊密度與其種類的抗寒性呈明顯的正相關(guān)性。根據(jù)4個(gè)核桃品種葉片組織結(jié)構(gòu)對(duì)其抗寒性由強(qiáng)到弱排序?yàn)椋航鸨∝S＞金薄香1號(hào)＞香玲＞西林2號(hào)。

表2 4個(gè)核桃品種葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)相關(guān)性比較

表3 4個(gè)核桃品種葉片組織結(jié)構(gòu)貢獻(xiàn)率及綜合系數(shù)值比較

表4 4個(gè)核桃品種葉片組織結(jié)構(gòu)主分量綜合系數(shù)分析比較

2.2 不同核桃品種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與抗寒性的關(guān)系

滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（脯氨酸、甜菜堿和可溶性糖等）的合成與增加，可以提高細(xì)胞的滲透壓，降低水勢(shì)，增強(qiáng)根細(xì)胞的吸水力。

2.2.1 不同低溫處理對(duì)核桃1年生枝條的可溶性蛋白含量的影響 從圖1可以看出，各品種可溶性蛋白含量變化趨勢(shì)除了金薄香1號(hào)、西扶1號(hào)和優(yōu)系FY-2外，趨勢(shì)大致相同，從5℃到-30℃呈現(xiàn)升高降低再升高的趨勢(shì)，在-30℃達(dá)到最高。金薄香1號(hào)5℃最高，0℃降到最低，然后小幅升高，

但在-30℃時(shí)仍低于初始5℃的數(shù)值。西扶1號(hào)和FY-2從初始5℃一路走低，在-20℃達(dá)到最低，然后回升，在-30℃達(dá)到最高值。通過(guò)相關(guān)性分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，溫度變化與可溶性蛋白含量相關(guān)性極顯著，呈負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)，即溫度越低，可溶性蛋白含量越高。

2.2.2 不同低溫處理對(duì)核桃1年生枝條的可溶性糖含量的影響 由圖2可知，不同的低溫處理對(duì)各核桃品種1年生枝條的可溶性糖含量的影響不大。各品種可溶性糖含量雖然變化不同，但變化幅度不大，集中在67～71 μg/g，大部分集中在68 μg/g左右。休眠期枝條，隨著溫度的降低，可溶性糖含量變化在相對(duì)小的范圍進(jìn)行調(diào)節(jié)。

2.2.3 不同低溫處理對(duì)核桃1年生枝條脯氨酸含量的影響 從圖3可以看出，金薄香6號(hào)、香玲、西扶1號(hào)、優(yōu)系FY-1和優(yōu)系FY-2在-10，-20℃脯氨酸含量都比較低，金薄香6號(hào)和禮品2號(hào)在-30℃都比較高，隨著溫度的降低，除了遼核1號(hào)，各品種游離脯氨酸含量變化趨勢(shì)一致，在0℃開(kāi)始下降，然后小幅上升。通過(guò)觀察各個(gè)指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果可知，脯氨酸含量的變化還與SOD酶活性、可溶性蛋白含量之間相關(guān)性顯著。

2.3 不同核桃品種膜質(zhì)氧化與抗寒性的關(guān)系

丙二醛（MDA）是膜脂過(guò)氧化物，MDA含量升高，引起生物膜透性發(fā)生變化，致使膜系統(tǒng)受損，細(xì)胞代謝失常，因此，MDA可作為膜系統(tǒng)受損程度的衡量指標(biāo)。由表4可知，隨著脅迫溫度的降低，各品種除了優(yōu)系FY-1和遼核1號(hào)，MDA含量變化規(guī)律基本相同，都是先大幅下降，再小幅上升，然后下降，只是變化幅度有所不同，優(yōu)系FY-1和遼核1號(hào)在-10℃達(dá)到最高，都是先升后降。金薄香6號(hào)在0℃降到一個(gè)數(shù)值，然后在0～-20℃趨于平穩(wěn)，其他各品種基本在0～-20℃值達(dá)到最大值，升值不大，在-20℃后開(kāi)始下降。由此可以推斷，在低溫下，不同品種有各自的MDA臨界值，基本在-20℃，不同品種1年生枝條都可以耐受，超過(guò)-20℃后MDA開(kāi)始下降，系統(tǒng)抵制膜脂過(guò)氧化，避免膜脂氧化，導(dǎo)致膜系統(tǒng)受損。

2.4 不同核桃品種保護(hù)酶活性與抗寒性的關(guān)系

2.4.1 不同低溫處理對(duì)核桃1年生枝條SOD活性的影響 從圖5可以看出，隨著脅迫溫度的降低，SOD活性的變化趨勢(shì)各有不同，香玲和金薄香6號(hào)變化幅度大，分別呈降—升—升—降和降—降—升—升的變化趨勢(shì)，其他品種大體為降—升—降—降的變化趨勢(shì)。

2.4.2 不同低溫處理對(duì)核桃1年生枝條POD活性的影響 從圖6可以看出，不同品種隨著脅迫的加深，POD活性呈現(xiàn)先降后升，再降再升的規(guī)律，不同品種出現(xiàn)峰值的溫度相同、升降幅度不同。其中，西扶1號(hào)呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)，峰值在-20℃。金薄香1在-10℃降到最低，在-20℃升到最高。金薄香6號(hào)在5～-30℃的POD值接近。通過(guò)自身系統(tǒng)的協(xié)調(diào)，使POD保持在一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)。優(yōu)系FY-1和禮品2號(hào)趨勢(shì)一致，這與實(shí)際觀察中二者萌芽都比較遲相一致。

2.5 各個(gè)抗寒性生理指標(biāo)主分量分析結(jié)果

通過(guò)相關(guān)性分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，溫度變化與可溶性蛋白含量之間呈極顯著負(fù)相關(guān)（即溫度越低，可溶性蛋白含量越高），與可溶性糖含量之間呈極顯著正相關(guān)；MDA含量與POD酶活性之間具有顯著相關(guān)性，與可溶性糖含量之間具有顯著負(fù)相關(guān)性；SOD酶活性與可溶性糖含量之間有極顯著負(fù)相關(guān)性，與脯氨酸含量之間有顯著的負(fù)相關(guān)性；可溶性蛋白含量與脯氨酸含量之間具有極顯著相關(guān)性（表5）。

表5 各個(gè)指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果

從表6可以看出，優(yōu)系FY-1、金薄豐、金薄香1號(hào)的MDA含量與其他各品種間差異性顯著，遼核1號(hào)的可溶性糖含量與其他品種間差異性顯著；遼核1號(hào)、香玲的可溶性蛋白含量之間有顯著差異性；西扶1號(hào)、遼核1號(hào)及優(yōu)系FY-1的POD酶活性之間有顯著差異性；金薄豐、遼核1號(hào)的SOD酶活性之間有顯著差異性；金薄香6號(hào)的脯氨酸含量與各品種間差異性顯著。

表6 各個(gè)指標(biāo)間差異性對(duì)比

通過(guò)SAS軟件數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)主分量分析方法，從表7可以看出，綜合指標(biāo)1所占總信息的59.26%，其中，可溶性蛋白含量和POD活性的絕對(duì)系數(shù)值位居前2位，所以，綜合指標(biāo)1是以POD活性和可溶性蛋白含量為主的排隊(duì)結(jié)果。

表7 不同核桃品種1年生枝條抗寒生理指標(biāo)貢獻(xiàn)率比較

由表8可知，在綜合指標(biāo)1的綜合參數(shù)中西扶1號(hào)、遼核1號(hào)、禮品2號(hào)的POD活性和可溶性蛋白含量名列前茅。綜合指標(biāo)2占總信息量的22.63%，其中，可溶性糖含量和FAS含量的絕對(duì)系數(shù)值位居前2位，所以，綜合指標(biāo)2是以FAS含量和可溶性糖含量為主的排隊(duì)結(jié)果。由表8還可知，在綜合指標(biāo)2的綜合參數(shù)中優(yōu)系FY-2、禮品2號(hào)、優(yōu)系FY-1等品種的FAS含量和可溶性糖含量名列前茅。

表8 不同核桃品種各個(gè)指標(biāo)綜合系數(shù)比較

3 討論

3.1 細(xì)胞生理功能對(duì)逆境的反應(yīng)與適應(yīng)

脫落酸（ABA）生物合成加強(qiáng)，含量迅速提高，會(huì)引起氣孔關(guān)閉，減少水分丟失。滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（脯氨酸、甜菜堿和可溶性糖等）的合成與增加，可提高細(xì)胞的滲透壓、降低水勢(shì)、增強(qiáng)根細(xì)胞的吸水力[13]。本研究結(jié)果表明，脯氨酸含量在-30℃時(shí)不同品種升到最高，而可溶性糖含量在5個(gè)溫度變化范圍內(nèi)，變化不大。在核桃不同品種中，11月份休眠期主要是脯氨酸受到影響。

3.2 膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的提高是植物對(duì)逆境適應(yīng)和增強(qiáng)抗性的關(guān)鍵因素

本研究結(jié)果表明，丙二醛在-20℃時(shí)含量達(dá)到最高，之后隨著溫度的下降，數(shù)值趨于穩(wěn)定或下降，這是植物體自身對(duì)不良環(huán)境的一種適應(yīng)，可導(dǎo)致相關(guān)的一系列酶例如超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶活性以及質(zhì)膜ATP酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、NADP-異檸檬酸鹽脫氫酶和丙酮酸激酶活性提高，使質(zhì)膜、葉綠體膜、線粒體膜或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和液泡膜保持正常狀態(tài)，膜的流動(dòng)性穩(wěn)定，具有較強(qiáng)的清除活性（自由）氧的能力，從而使得枝條耐凍穩(wěn)定性顯著提高。

3.3 細(xì)胞膜系統(tǒng)對(duì)逆境脅迫的反應(yīng)

本研究主要對(duì)葉片的解剖結(jié)構(gòu)柵欄組織和海綿組織進(jìn)行了相關(guān)研究，一般情況下，不同品種保持其品種的抗寒遺傳特性，即相對(duì)一致性，本研究并未對(duì)葉片的葉綠體進(jìn)行詳細(xì)的分析。有研究表明，低溫逆境會(huì)對(duì)不同核桃品種抗氧化系統(tǒng)及超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響，低溫逆境下核桃葉肉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與其品種的抗寒性密切相關(guān)，低溫脅迫下核桃葉片細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的損傷與活性氧積累之間可能存在一定的相互關(guān)系[14]。葉綠體膜、類囊體空泡化、基粒片層數(shù)減少，會(huì)使光合作用強(qiáng)度降低，從根本上改變和破壞了植物的生長(zhǎng)與發(fā)育。

3.4 細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝對(duì)逆境的適應(yīng)性反應(yīng)

對(duì)葉片和莖的抗寒性生理指標(biāo)的測(cè)定，最終歸結(jié)到代謝途徑改變。有研究表明，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因（JrGSTTau1）[15]是植物耐寒調(diào)控的重要基因之一，從核桃中克隆并得到功能驗(yàn)證。當(dāng)植物受到低溫脅迫時(shí)，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因可促使谷胱甘肽過(guò)氧化酶，POD，SOD活性增高，降低過(guò)氧化氫酶活性、MDA含量和電導(dǎo)率，從而使植物適應(yīng)寒冷的環(huán)境。所以，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝是通過(guò)基因調(diào)控一系列的生理反應(yīng)，從而對(duì)逆境適應(yīng)的反應(yīng)。

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Determ ination of Cold Resistance on Leaves and Stem s of Different W alnut Cultivars

FAN Xinping，QIAOYongsheng，SHI Meijuan，TIAN Xin，WANG Yong，WU Yanxia
（InstituteofPomology，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Taigu 030800，China）

To reveal mechanism of cold tolerance of different varieties of walnut and superior lines,walnut leaves and dormant annual branches were used to measurement of leaf structure,physiological and biochemical indicators and branches of the correlation between cold resistance by paraffin section method,physiological and biochemical index determination method.Comprehensive index results showed that leaf thickness and palisade tissue thickness,cellular structure tightness（CTR）were the main factors related to the hardiness.The cold resistance for 4 cultivars was in order of Jinbaofeng＞Jinbaoxiang 1＞Xiangling＞Xilin 2.Under low temperature stress,peroxidase（POD）activity and soluble protein content in Xifu1,Liaohe 1 and Lipin 2 in annual brancheswere high.And proline and soluble sugar content in FY-2,Lipin 2 and Jinbaoxiang 6 were high.Therefore,the cold resistance of different walnut varieties is a complex regulatory processadapt to theenvironment.

determination ofcold resistance;walnut;leaf tissue structure;physiological and biochemical indexes

S664.1

A

1002-2481（2016）07-0945-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.07.13

2016-03-14

山西省回國(guó)留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目（2014-091）

樊新萍（1973-），女，山西永濟(jì)人，副研究員，博士，主要從事果樹(shù)分子生物學(xué)研究工作。