王宇宏,張 彬,王玉國(guó)

（1.山西省生物研究所，山西太原030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

小麥幼胚離體培養(yǎng)再生體系的建立

王宇宏1,張 彬2,王玉國(guó)2

（1.山西省生物研究所，山西太原030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

選擇不同小麥品種的幼胚作為試驗(yàn)材料，對(duì)影響其愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的因素進(jìn)行分析。結(jié)果表明，小麥幼胚組培最適胚齡為12～14 d；在最適胚齡下，基因型對(duì)胚性愈傷組織的發(fā)生頻率影響較大，對(duì)小麥幼胚培養(yǎng)出愈率的影響并不顯著。在加有2，4-D 1mg/L＋KT 0.5mg/L的基本培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，晉農(nóng)232、晉農(nóng)318和晉農(nóng)234胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，分別達(dá)74.6%，70.3%和60.8%。此外，培養(yǎng)基中添加一定量的含氮有機(jī)物，也可提高胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率，即晉農(nóng)232添加300 mg/L Gln，晉農(nóng)318添加500 mg/L Gln＋300 mg/L CH后，其胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率均有顯著提高。分化培養(yǎng)中，添加ZT 3mg/L和NAA 1mg/L對(duì)晉農(nóng)232、晉農(nóng)318和晉農(nóng)234等3個(gè)品種愈傷組織誘導(dǎo)分化的效果最好，其再分化率分別達(dá)到72.5%，57.5%和62.5%。生根培養(yǎng)中添加IAA 0.8mg/L的1/2基本培養(yǎng)基可以誘導(dǎo)芽快速生壯根。

小麥；幼胚；愈傷組織；植株再生

小麥（Triticum aestivum L.）屬禾本科（Gramineae）麥屬（Tritium），是重要的糧食作物之一，是世界上種植面積最廣、總產(chǎn)量最高的作物[1]。生物技術(shù)的興起與發(fā)展，為改良小麥品種資源提供了新的有效方法。植物組織培養(yǎng)技術(shù)為小麥無性系的利用及小麥遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立提供了技術(shù)支持。目前，小麥的離體再生是一項(xiàng)國(guó)際難題，只有少數(shù)實(shí)驗(yàn)室獲得了小麥遺傳轉(zhuǎn)化體系，這阻礙了小麥基因工程方面的進(jìn)一步研究。優(yōu)化小麥組織培養(yǎng)條件，提高植株再生效率是小麥生物技術(shù)育種亟待解決的重要課題。小麥幼胚愈傷組織分化能力較其他組織器官高，是進(jìn)行小麥基因轉(zhuǎn)化的良好受體[2-4]。

本研究以原產(chǎn)于山西省的6個(gè)小麥栽培種（晉農(nóng)232、晉農(nóng)234、農(nóng)大189、晉麥48、晉農(nóng)318、小麥207）作為試驗(yàn)材料，系統(tǒng)研究了影響小麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的因素，旨在探索建立一套合適的植株再生體系最有效的方法。

1 材料和方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)選用了原產(chǎn)于山西省的6個(gè)小麥栽培種作為試驗(yàn)材料，其中，晉麥48與農(nóng)大189由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)栽培實(shí)驗(yàn)室提供，小麥207、晉農(nóng)232、晉農(nóng)234與晉農(nóng)318由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)遺傳育種實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 基本培養(yǎng)基 MSB＋3%蔗糖＋6%瓊脂粉，pH值調(diào)至5.8。

1.2.2 愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基＋2，4-D 2mg/L。

1.2.3 繼代培養(yǎng)基 （1）基本培養(yǎng)基＋2，4-D 1 mg/L＋KT 0.5 mg/L；（2）基本培養(yǎng)基＋2，4-D 1 mg/L＋ABA 0.5 mg/L；（3）基本培養(yǎng)基＋2，4-D 1 mg/L；（4）基本培養(yǎng)基＋2，4-D 2 mg/L＋ABA 0.5 mg/L；（5）基本培養(yǎng)基＋2，4-D 6mg/L。

1.2.4 分化培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基＋ZT/NAA不同濃度配比（1∶0.5，2∶0.5，2∶1，3∶1，3∶1.5）激素組合或BA/NAA不同濃度配比（1∶0.5，2∶0.5，3∶0.5，1∶1，2∶1，3∶1）激素組合。

1.2.5 生根培養(yǎng)基 1/2 MS培養(yǎng)基（其余的同基本培養(yǎng)基）＋不同濃度的IAA和IBA。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 無菌外植體的制備 選擇生長(zhǎng)發(fā)育正常且具有代表性的小麥植株作為試驗(yàn)材料，在其開花前進(jìn)行掛牌標(biāo)記，并實(shí)時(shí)觀察胚的發(fā)育情況。開花10d起隔日取樣，剝?nèi)プ蚜?nèi)外穎殼，將去殼后的未成熟種子在無菌條件下先用75%的乙醇溶液消毒30 s，使用無菌水漂洗3～4次后用0.1%的氯化汞溶液消毒15min，再用無菌水重復(fù)漂洗3～4次。小心地剝出幼胚作為外植體，此操作要嚴(yán)格按照要求在超凈工作臺(tái)中完成。

1.3.2 愈傷組織的誘導(dǎo) 在超凈工作臺(tái)中將幼胚盾片向上接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿接種20枚，封口膜封口，置于室溫為（23±1）℃的培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)。30d后對(duì)愈傷組織的出愈率及胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)記錄，觀察胚性愈傷組織的大小、顏色與質(zhì)地。具體的統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)為：胚性愈傷組織表現(xiàn)出表面淡黃、凹凸不平、致密不透明；非胚性愈傷組織表現(xiàn)出表面發(fā)白，質(zhì)地松散。通過比較小麥幼胚胚齡和基因型對(duì)幼胚培養(yǎng)出愈率及體細(xì)胞胚性無性系產(chǎn)生的影響，篩選出小麥幼胚培養(yǎng)的最佳時(shí)期。

愈傷組織出愈率＝產(chǎn)生的愈傷組織數(shù)/接入的幼胚數(shù)×100%；胚性愈傷組織誘導(dǎo)率＝胚性愈傷組織數(shù)/產(chǎn)生的愈傷組織總數(shù)×100%。

1.3.3 繼代培養(yǎng) 將誘導(dǎo)獲得的愈傷組織接種于含有不同濃度的2，4-D或者另配有不同濃度的ABA，KT的繼代培養(yǎng)基上（1.2.3中的（1）～（5）），在室溫（23±1）℃下進(jìn)行暗培養(yǎng)，每隔7d繼代培養(yǎng)一次。培養(yǎng)過程中實(shí)時(shí)觀察愈傷組織的色澤、大小和質(zhì)地；準(zhǔn)確記錄胚性愈傷組織誘導(dǎo)情況并統(tǒng)計(jì)其誘導(dǎo)率，以此為依據(jù)，篩選出最適繼代培養(yǎng)的激素濃度配比，并在此基礎(chǔ)上，添加不同濃度的谷氨酰胺（Gln）、水解酪蛋白（CH）、水解乳蛋白（LH），觀察這3種有機(jī)物對(duì)體細(xì)胞無性系產(chǎn)生的影響。

1.3.4 分化培養(yǎng) 將繼代培養(yǎng)中產(chǎn)生的胚性愈傷組織接種到含有不同激素配比的分化培養(yǎng)基上，在光強(qiáng)2500lx，光照16h/d，室溫26℃的條件下進(jìn)行分化培養(yǎng)。期間每隔5～7d繼代培養(yǎng)一次，觀察記錄胚性愈傷組織形態(tài)變化的特征和時(shí)間并計(jì)算分化率。

分化率＝產(chǎn)生綠色原基的愈傷組織數(shù)/接入的愈傷組織數(shù)×100%。

1.3.5 生根培養(yǎng) 將分化培養(yǎng)產(chǎn)生的綠芽及其分蘗接種于生根培養(yǎng)基中，在光強(qiáng)2500lx，室溫26℃的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在1/2 MS生根培養(yǎng)基中添加IAA和IBA這2種生長(zhǎng)素，觀察比較培養(yǎng)基對(duì)誘導(dǎo)生根的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)

2.1.1 胚齡對(duì)小麥幼胚組織培養(yǎng)的影響 自小麥開花后10d起，隔日取樣。將脫去外穎殼后的未成熟種子進(jìn)行消毒，在無菌條件下剝出幼胚并接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，30 d后記錄統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率、胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和幼胚直接萌發(fā)率。

3個(gè)小麥品種不同胚齡的幼胚組織培養(yǎng)后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果列于表1。每個(gè)品種的出愈率和胚性愈傷誘導(dǎo)率的大小均與胚齡相關(guān)。以晉農(nóng)318為例，胚齡為10～18 d的幼胚出愈率均達(dá)到90%以上，隨幼胚胚齡的升高出愈率也逐漸升高，在第18天時(shí)達(dá)到100%；幼胚在胚齡為14，12 d時(shí)，胚性愈傷組織形成量顯著多于其他胚齡，其胚性愈傷誘導(dǎo)率分別為60.53%和57.85%，而18 d時(shí)，胚性愈傷誘導(dǎo)率僅為35%。在培養(yǎng)過程中，對(duì)不同品種不同胚齡的小麥幼胚的直接萌發(fā)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，隨著胚齡的增加幼胚的直接萌發(fā)率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，胚齡為10 d時(shí)，3個(gè)品種均未出現(xiàn)萌發(fā)現(xiàn)象，晉麥48在整個(gè)幼胚培養(yǎng)的過程中直接萌發(fā)率較其他2個(gè)品種高。綜合比較發(fā)現(xiàn)，在直接萌發(fā)率較高的胚齡下，產(chǎn)生的胚性愈傷組織較少，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率較低。綜合分析胚齡與出愈率、胚性愈傷組織誘導(dǎo)率及直接萌發(fā)率的相關(guān)性，認(rèn)為最適宜小麥幼胚組織培養(yǎng)的胚齡為12～14d。

表1 胚齡對(duì)小麥幼胚培養(yǎng)特性的影響

2.1.2 基因型對(duì)小麥幼胚組織培養(yǎng)的影響 對(duì)處于適宜胚齡（12～14 d）的6個(gè)小麥品種（系）進(jìn)行取樣、培養(yǎng)，比較各品種幼胚的出愈率和胚性愈傷誘導(dǎo)率，分析基因型對(duì)小麥幼胚組織培養(yǎng)的影響（表2）。在最適胚齡條件下，6個(gè)小麥品種的幼胚出愈率在92.67%～100%，變異幅度小，因此，供試小麥基因型對(duì)其幼胚出愈率的影響并不顯著。此外，不同小麥品種幼胚胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率存在一定差異，其中，晉農(nóng)232的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到64.77%，農(nóng)大189的誘導(dǎo)率最低，僅為18.79%，二者差異顯著，由此可見，基因型對(duì)胚性愈傷組織的發(fā)生頻率有影響。

表2 基因型對(duì)小麥幼胚培養(yǎng)特性的影響

2.2 繼代培養(yǎng)

2.2.1 植物激素對(duì)小麥幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響 為了研究2，4-D，ABA，KT等植物激素種類及濃度對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響，本試驗(yàn)以晉農(nóng)232、晉農(nóng)318、晉農(nóng)234等3個(gè)小麥品種的幼胚誘導(dǎo)15 d所得的愈傷組織為材料進(jìn)行不同的繼代處理，結(jié)果如表3所示。在培養(yǎng)基中加入1 mg/L的2，4-D和0.5 mg/L的KT后，3個(gè)小麥品種的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率均明顯高于其他處理，并產(chǎn)生顏色淡黃，表面多瘤狀突起的愈傷組織，即典型的胚性愈傷組織。僅在培養(yǎng)基中添加2，4-D，愈傷組織的生長(zhǎng)速度隨2，4-D濃度的增加而加快，但胚性愈傷組織誘導(dǎo)率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，由表3可知，當(dāng)2，4-D為6 mg/L時(shí)，3個(gè)小麥品種的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率均在15%以下，產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)量明顯下降，顏色發(fā)白、水漬狀嚴(yán)重。

表3 不同植物激素對(duì)小麥胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.2.2 不同有機(jī)物添加配方對(duì)小麥幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響 本試驗(yàn)以晉農(nóng)232和晉農(nóng)318這2個(gè)小麥品種的幼胚誘導(dǎo)15 d所得的愈傷組織為供試材料，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上添加相應(yīng)濃度配比的有機(jī)物（Gln，CH，LH）配方如表4所示。

表4 添加不同有機(jī)物配方 mg/L

由圖1可知，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上添加一定量的有機(jī)物配方后，晉農(nóng)318幼胚的胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率較未添加時(shí)高。在僅添加300 mg/L或500 mg/L的Gln，CH或LH的培養(yǎng)基中，小麥幼胚胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率并無明顯差異，但添加CH產(chǎn)生的作用效果略優(yōu)于LH，Gln的作用相對(duì)較弱。同時(shí)添加Gln和CH或LH與單獨(dú)添加其中一種有機(jī)物對(duì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)效果無明顯差異。在加有500mg/L的Gln和300 mg/L的CH的培養(yǎng)基中培養(yǎng)出的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高。對(duì)于晉農(nóng)232，單獨(dú)添加300 mg/L的3種有機(jī)物對(duì)提高胚性愈傷組織誘導(dǎo)率均有一定效果，其中，CH的作用效果更明顯。

2.3 分化培養(yǎng)

將上一階段由繼代培養(yǎng)基（1）中誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚性愈傷組織分別培養(yǎng)于含有不同激素配比的分化培養(yǎng)基中，比較幼胚愈傷組織分化情況。分化培養(yǎng)期間觀察發(fā)現(xiàn)，在胚性愈傷組織上首先形成了綠色葉狀體，隨后由葉狀體的基部生成多個(gè)綠芽。分化培養(yǎng)35～40d后記錄，統(tǒng)計(jì)分化率。

2.3.1 不同濃度ZT與NAA配比對(duì)小麥幼胚愈傷組織分化的影響 由表5可知：（1）在ZT/NAA的配比為2∶1和3∶1時(shí)，最有利于小麥幼胚愈傷組織的分化，分化率均達(dá)到50%以上。以晉農(nóng)232為例，當(dāng)NAA為0.5 mg/L，ZT分別為1，2 mg/L時(shí)，晉農(nóng)232幼胚愈傷組織的分化率分別為15%和45%，NAA為1 mg/L時(shí)晉農(nóng)232的分化率分別達(dá)到了67.5%和72.5%。不同濃度配比的NAA和ZT對(duì)晉農(nóng)318和晉農(nóng)234這2個(gè)小麥品種幼胚愈傷組織分化的影響也有相同的趨勢(shì)。當(dāng)ZT達(dá)到3 mg/L同時(shí)NAA增大到1.5mg/L時(shí)，3個(gè)小麥品種幼胚的分化率均急劇下降，均低于15%。（2）增加ZT濃度有利于愈傷組織的分化。當(dāng)ZT為3 mg/L，NAA為1 mg/L時(shí)，晉農(nóng)232、晉農(nóng)318及晉農(nóng)234幼胚愈傷組織的分化率分別為72.5%，57.5%和62.5%，均較其他配比組合要高。但當(dāng)增加NAA濃度時(shí)，3個(gè)品種的分化率均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。由此可見，ZT和NAA濃度配比為3∶1時(shí)最適宜以上3個(gè)小麥品種幼胚愈傷組織的分化。在最適激素配比下品種間也存在差異，其中以晉農(nóng)232的分化率最高。

表5 不同ZT/NAA濃度配比對(duì)小麥愈傷組織分化的影響

2.3.2 不同濃度BA與NAA配比對(duì)小麥幼胚愈傷組織分化的影響 從表6可以看出，在BA和NAA配比中，當(dāng)BA濃度不變時(shí)，提高NAA濃度會(huì)抑制愈傷組織的分化。例如，當(dāng)BA為2 mg/L時(shí)，NAA由0.5 mg/L升高到1 mg/L時(shí)，3個(gè)品種愈傷組織分化率分別由50%降低到22.5%（晉農(nóng)232），40%降低到10%（晉農(nóng)318），47.5%降低到17.5%（晉農(nóng)234）。此外，從表6還可以看出，BA和NAA濃度配比為2∶0.5時(shí)，3個(gè)品種的幼胚愈傷組織分化率最高，即該濃度配比最適合晉農(nóng)232、晉農(nóng)318和晉農(nóng)234愈傷組織的分化。

表6 不同濃度NAA與BA配比對(duì)小麥愈傷組織分化的影響

綜合比較上述2種激素組合（ZT/NAA和BA/ NAA）在各自最適濃度配比下3個(gè)品種幼胚愈傷組織的分化情況，只有在同時(shí)添加了1 mg/L NAA和3 mg/L ZT后的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的3個(gè)品種幼胚愈傷組織分化率同時(shí)超過50%，晉農(nóng)232為72.5%，晉農(nóng)318為57.5%，晉農(nóng)234為62.5%，因此，以上激素組合配比最佳。在最適激素濃度配比下，以晉農(nóng)232的分化率最高。

高中物理課堂教學(xué)方式方法革新，是應(yīng)新課標(biāo)為己任的新式教學(xué)方法，也是以互動(dòng)學(xué)習(xí)和基礎(chǔ)學(xué)習(xí)為目標(biāo)的學(xué)科系統(tǒng)化教學(xué).高中物理知識(shí)點(diǎn)如力和運(yùn)動(dòng)的關(guān)系、動(dòng)能概念、 電磁感應(yīng)、核能等教學(xué)內(nèi)容，需要教學(xué)方式上進(jìn)行創(chuàng)新，才能最大程度實(shí)現(xiàn)高中課堂教學(xué)效果最大化.為順應(yīng)新式教學(xué)理念，倡導(dǎo)物理教學(xué)方式方法革新，應(yīng)用合作學(xué)習(xí)具體教學(xué)策略，最終實(shí)現(xiàn)學(xué)生教學(xué)理性變化，注重合作學(xué)習(xí)方法的合理應(yīng)用.

2.4 生根培養(yǎng)

本試驗(yàn)以晉農(nóng)232為供試材料。將其幼胚愈傷組織表面綠芽及其分蘗接種于不同的生根培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)過程中，綠芽逐漸伸長(zhǎng)并同時(shí)產(chǎn)生大量的小根。

由圖2可知，在含有0.8 mg/L IAA的生根培養(yǎng)基中，生根率最高，達(dá)到83%。生根培養(yǎng)過程中觀察到，此培養(yǎng)基能促進(jìn)芽快速生根，根系叢生，根系發(fā)達(dá)，主根粗長(zhǎng)健壯，須根多且盤曲；當(dāng)生根培養(yǎng)基中含0.2 mg/L IAA或1.2 mg/L IAA時(shí)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的根較少，只有少數(shù)短而粗的主根，且生長(zhǎng)緩慢。在添加了IBA的生根培養(yǎng)基中，當(dāng)IBA濃度為0.4mg/L時(shí)，芽快速誘導(dǎo)生根，生根率達(dá)78%以上，產(chǎn)生的主根多且長(zhǎng)，并產(chǎn)生粗長(zhǎng)盤曲的少量須根。綜上所述，IAA更有利于小麥試管苗生根，最適濃度為0.8 mg/L，其次為IBA，有效濃度為0.4mg/L。

3 結(jié)論與討論

3.1 胚齡對(duì)小麥幼胚組織培養(yǎng)的影響

在小麥幼胚組織培養(yǎng)的過程中，外植體幼胚的發(fā)育程度在相當(dāng)大的程度上決定了培養(yǎng)工作的成敗和培養(yǎng)效果的好壞。研究者習(xí)慣用幼胚“直徑大小”[5]或“授粉后胚發(fā)育的天數(shù)”[6]來表示幼胚的胚齡，其中，“授粉后胚發(fā)育的天數(shù)”更為客觀，應(yīng)用更廣。目前關(guān)于小麥幼胚組織培養(yǎng)最適胚齡的研究由于受到品種、栽培條件等因素的限制并無統(tǒng)一結(jié)論，王常云等[6]研究認(rèn)為，煙臺(tái)地區(qū)小麥幼胚培養(yǎng)的有效胚齡為14～20 d，最適胚齡為16 d，與栗現(xiàn)芳等[7]對(duì)雜交小麥西雜一號(hào)、西雜五號(hào)及其親本的研究結(jié)果相同。宋運(yùn)賢等[8]研究發(fā)現(xiàn)，宿9908及皖麥53的最適胚齡為14d。而關(guān)于胚齡在幼胚組織培養(yǎng)中的作用有學(xué)者認(rèn)為，胚齡影響了愈傷組織發(fā)生的起始部位和強(qiáng)度[9]，也有人認(rèn)為，胚齡影響了愈傷組織的分化率，對(duì)幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)率并無影響[6]。本試驗(yàn)中選用的3個(gè)小麥品種晉農(nóng)318、晉農(nóng)232和晉麥48種植于山西省晉中地區(qū)，因此，本研究初步認(rèn)為晉中地區(qū)小麥幼胚組織培養(yǎng)的最適胚齡為12～14d。

3.2 基因型對(duì)小麥幼胚組織培養(yǎng)的影響

植物基因型作為內(nèi)因顯著影響了植物離體培養(yǎng)過程中胚性愈傷組織和體細(xì)胞胚的發(fā)生。曾寒冰等[10-13]研究認(rèn)為，在小麥幼胚培養(yǎng)過程中，誘導(dǎo)愈傷組織及誘導(dǎo)分化上的差異取決于品種的遺傳特性。于曉紅等[14]研究發(fā)現(xiàn)，基因型只影響到愈傷組織的分化率。由此可見，基因型與愈傷組織的分化存在相關(guān)性已達(dá)成一定的共識(shí)，但對(duì)于基因型是否影響愈傷組織的出愈率仍無定論。外植體培養(yǎng)過程中，產(chǎn)生了胚性和非胚性2種類型的愈傷組織。小麥的再生植株發(fā)生都經(jīng)過了愈傷組織階段，有再生能力的胚性愈傷組織在所有愈傷組織中的比例大小直接關(guān)系到基因型對(duì)分化率的影響，因此，基因型是通過影響胚性發(fā)生率來影響再生植株的分化率。

本試驗(yàn)從小麥幼胚愈傷組織出愈率和胚性愈傷誘導(dǎo)率2個(gè)方面對(duì)基因型所產(chǎn)生的作用進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，基因型對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率產(chǎn)生了顯著影響，而出愈率與基因型并無顯著相關(guān)性。在最適的胚齡期內(nèi)對(duì)供試的6個(gè)品種進(jìn)行取樣、培養(yǎng)，在同一培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)率均達(dá)到90%以上，但胚性愈傷組織誘導(dǎo)率之間的差異卻很明顯，晉農(nóng)232最高，達(dá)到64.77%，農(nóng)大189最低，只有18.75%。

3.3 激素對(duì)小麥幼胚組織培養(yǎng)的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加2 mg/L的2，4-D最佳，而在繼代培養(yǎng)基中則是以1 mg/L效果較好。此外，對(duì)于另一些激素的作用也有相關(guān)的報(bào)道，Nabors等[20]在小麥未成熟胚培養(yǎng)試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分裂素可以顯著促進(jìn)一些品種的胚發(fā)生，在含生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基上添加KT可提高胚性愈傷組織的形成和胚狀體的發(fā)生。本試驗(yàn)也得出了類似的結(jié)果，研究表明，KT顯著提高了小麥幼胚胚性愈傷組織誘導(dǎo)率，最適宜濃度為0.5mg/L。

小麥愈傷組織在光照條件下，在分化培養(yǎng)基中先后分化產(chǎn)生分化原基、芽或不定根。不定根和芽的分化順序?qū)⒂绊懼仓甑脑偕?，只有先分化形成芽，愈傷組織在生根培養(yǎng)基上進(jìn)一步長(zhǎng)出根，才能形成完整的再生植株。因此，有效地誘導(dǎo)芽分化是提高植株再生率的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。植物激素在植物組織培養(yǎng)器官或胚狀體的分化過程中起到了重要的調(diào)節(jié)作用。不同作物品種對(duì)外源激素的敏感性不同。適宜濃度配比的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素可以有效地控制胚性愈傷組織的分化，形成苗和根，最終獲得再生植株。本研究結(jié)果表明，針對(duì)供試的3個(gè)小麥品種，添加一定比例的激素組合ZT/NAA較BA/NAA這一組合對(duì)提高幼胚愈傷組織分化率的效果更明顯。在生根培養(yǎng)基中添加0.8mg/L IAA和0.4mg/L IBA能誘導(dǎo)芽快速生根，根系健壯。IAA對(duì)生根率的作用效果要優(yōu)于IBA。

4 結(jié)論

小麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)過程中，選擇胚齡為12～14 d幼胚，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高；在最佳胚齡條件下，不同基因型小麥的胚性愈傷組織的發(fā)生頻率不同，因此，誘導(dǎo)率之間也存在較大差異，晉農(nóng)232和晉農(nóng)318效果最好，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率分別達(dá)到64.77%，62.67%。

在小麥幼胚愈傷組織繼代培養(yǎng)過程中，在附加了1 mg/L 2，4-D＋0.5 mg/L KT激素組合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的晉農(nóng)232、晉農(nóng)318、晉農(nóng)234等3個(gè)小麥品種的胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率分別達(dá)到74.6%，70.3%和60.8%，明顯高于其他處理，此外，含氮有機(jī)物的添加也可促進(jìn)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，添加300 mg/L Gln對(duì)晉農(nóng)232以及添加500 mg/L Gln＋300 mg/L CH對(duì)晉農(nóng)318胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的提高均起到了促進(jìn)作用。

在小麥幼胚愈傷組織分化培養(yǎng)過程中，NAA 1 mg/L＋ZT 3 mg/L是培養(yǎng)基中添加的最理想激素配比。在此條件下，晉農(nóng)232、晉農(nóng)234、晉農(nóng)318等3個(gè)小麥品種愈傷組織分化率均較高，分別達(dá)到72.5%，62.5%和57.5%。

小麥幼胚離體培養(yǎng)后期，添加0.8 mg/L IAA和0.4 mg/L IBA，可以誘導(dǎo)芽快速生根，且根系健壯，0.8mg/L的IAA的生根效果最佳。

由生根試驗(yàn)結(jié)果可知，在無激素的基本培養(yǎng)基上或添加了IAA，NAA，IBA的培養(yǎng)基上，小麥試管苗均能誘導(dǎo)生根，但生根率及根系生長(zhǎng)狀況存在一定差異。

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Establishment of Regeneration System of W heat Immature Embryos Culture in vitro

WANG Yuhong1，ZHANG Bin2，WANG Yuguo2
（1.Biology Institute ofShanxi，Taiyuan 030031，China；2.College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

The paper studied wheatimmature embryoswith six cultivars in vitro and the factors of wheatcallus induction and plant regeneration.The resultshowed that the age of immature embryos for its tissue culturewas14-16 d.Among the optimum ageof immature embryos,genotype had little effects on callus induction of immature embryos while it had remarkable effect on the induction frequency of embryogenic callu.Jinnong232 and Jinnong 318 had relatively good culturing characters.The optimum subculturemedium was the basal medium supplementedwith 2,4-D（1mg/L）and KT（0.5mg/L）.In thismedium,the induction frequency ofembryogenic callusof Jinnong 232,Jinnong 318 and Jinnong 234 could reach 74.6%,70.3%,60.8%.The optimum hormone concentration added to basal medium for callus differentitation was NAA 1 mg/L and ZT 3 mg/L with a callus differentiation frequency more than 50%.The root formation could be stimulated by halfamountofbasal medium togetherwith 0.8mg/L IAA.

wheat;immature embryos;callus;plant regeneration

Q813.1；S512.1

A

1002-2481（2016）07-0900-07

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.07.03

2016-02-29

王宇宏（1979-），女，山西懷仁人，助理研究員，碩士，主要從事農(nóng)學(xué)及土壤生態(tài)學(xué)研究工作。王玉國(guó)為通信作者。