王長(zhǎng)彪，韓 斌，劉 江，崔 婷，任永康，趙興華，董艷輝，李亞麗，唐朝暉

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031；2.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031）

小麥相關(guān)功能基因的全基因組電子定位及基因注釋

王長(zhǎng)彪1，韓 斌2，劉 江1，崔 婷2，任永康3，趙興華1，董艷輝1，李亞麗1，唐朝暉1

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031；2.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西太原030006；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西太原030031）

電子克隆技術(shù)是通過(guò)對(duì)基因組或EST序列的組裝和拼接快速獲得功能基因的方法。運(yùn)用電子克隆技術(shù)，以小麥功能標(biāo)記為探針，在小麥全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中克隆與之相對(duì)應(yīng)的小麥功能基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，運(yùn)用UMN19，bx7_f_r，ZSBy9F2_R2，PPO33，Sus2_SNP_227_589L2，Pin_b_1，YP7A，cssfr7這些功能標(biāo)記，可以克隆出與之相對(duì)應(yīng)的功能基因。研究有助于下一步對(duì)小麥相關(guān)功能基因進(jìn)行精細(xì)作圖、圖位克隆及分子標(biāo)記輔助育種等工作。

生物信息學(xué)；小麥；功能基因；電子克隆

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾霓r(nóng)作物之一。過(guò)去幾十年中，運(yùn)用SSR，RFLP，AFLP，RAPD和DArT等分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)小麥重要基因進(jìn)行了染色體區(qū)域的分子定位，然而這些遺傳標(biāo)記通常與目標(biāo)基因具有一定的距離并且受群體的影響較大。因此，小麥功能基因的挖掘和克隆受到很大的限制[1]。

2014年《Science》雜志上，2個(gè)研究組分別公布了中國(guó)春小麥品種的每條染色體臂的基因組序列[2]以及3B[3]染色體基因組序列，另外2個(gè)研究小組[4-5]整理了現(xiàn)代普通小麥的系統(tǒng)發(fā)育歷史，這些成果將為加速小麥功能基因的研究提供有力的基因資源。同時(shí)，小麥紋枯病[6]、白粉病[7-8]、葉銹病[8]、葉枯病[8]、赤霉病[9]、禾谷孢囊線蟲(chóng)病[10]和條銹病[11]等病害已經(jīng)經(jīng)過(guò)田間鑒定篩選，為進(jìn)行基因克隆奠定了有力的資源基礎(chǔ)。

電子克隆技術(shù)是繼圖位克隆、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法克隆、mRNA差異顯示技術(shù)、抑制差減雜交技術(shù)和基因表達(dá)系列分析技術(shù)后發(fā)展起來(lái)的基因克隆新方法[5]。它依據(jù)豐富的基因組和EST遺傳資源[12]，借助日新月異的生物信息學(xué)技術(shù)，依托電子計(jì)算機(jī)強(qiáng)大的云計(jì)算能力，通過(guò)對(duì)基因組或EST序列的組裝和拼接快速獲得功能基因[13]。隨著作物基因組計(jì)劃的逐步推進(jìn)，該方法具有成本低、速度快、針對(duì)性強(qiáng)的特點(diǎn)，其優(yōu)勢(shì)將日益凸顯。到目前為止，大約有97個(gè)與性狀相關(guān)的小麥功能標(biāo)記被開(kāi)發(fā)出來(lái)。

本研究運(yùn)用電子克隆技術(shù)，以小麥功能標(biāo)記為探針，在小麥全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中克隆與之相對(duì)應(yīng)的小麥功能基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為小麥功能基因的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

本試驗(yàn)中小麥全基因組序列從URGI（https:// urgi.versailles.inra.fr/download/iwgsc/）以FASTA的格式下載，小麥功能分子標(biāo)記來(lái)源于文獻(xiàn)[1]。

1.2 方法

1.2.1 小麥功能基因的定位 在Linux平臺(tái)上，采用re-PCR策略以97個(gè)功能標(biāo)記為引物將其定位到小麥全基因組序列中，并對(duì)定位結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。使用Fgenesh程序?qū)δ芘c功能標(biāo)記聯(lián)配的序列進(jìn)行功能基因的預(yù)測(cè)。

1.2.2 小麥功能基因的序列分析 使用blast2go軟件對(duì)獲得的功能基因進(jìn)行基因的GO[14]注釋及基于KEGG[15]的生物通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥功能基因的序列分析

2.1.1 功能基因的GO注釋 大量全基因組數(shù)據(jù)的增多，使得關(guān)于基因、基因產(chǎn)物以及生物學(xué)通路的數(shù)據(jù)也越來(lái)越多。利用計(jì)算機(jī)程序提供的結(jié)構(gòu)化標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)模型，在基因組范圍內(nèi)描述蛋白質(zhì)功能，成為從整體水平系統(tǒng)研究基因及其產(chǎn)物的系統(tǒng)方法。GO注釋系統(tǒng)包含生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組成3個(gè)分支[16]。

本研究對(duì)功能基因所做的GO注釋結(jié)果中，涉及生物學(xué)過(guò)程的功能基因有18個(gè)。生物學(xué)過(guò)程二級(jí)水平中包含的6種反應(yīng)類(lèi)型有單器官進(jìn)程（single-organismprocess）、應(yīng)激反應(yīng)（response tostimulus）、定位（localization）、多器官進(jìn)程（multi-organism process）、細(xì)胞進(jìn)程（cellular process）及代謝進(jìn)程（metabolic process）（表1）。其中，參與單器官進(jìn)程的功能基因有1種，應(yīng)激反應(yīng)4種，定位1種，多器官進(jìn)程2種，細(xì)胞進(jìn)程10種，代謝進(jìn)程15種（圖1）。

表1 小麥功能基因生物學(xué)過(guò)程二級(jí)水平的GO注釋

涉及分子功能的功能基因有22個(gè)（表2）。分子功能二級(jí)水平包含5種類(lèi)型：營(yíng)養(yǎng)庫(kù)活性類(lèi)（nutrientreservoiractivity）功能基因3個(gè)，結(jié)合類(lèi)（binding）功能基因12個(gè)，酶活性調(diào)節(jié)類(lèi)（enzymeregulator activity）功能基因1個(gè)，轉(zhuǎn)運(yùn)活性類(lèi)（transporter activity）功能基因1個(gè)，催化活性類(lèi)（catalytic activity）功能基因15個(gè)（圖2）。

與細(xì)胞組成相關(guān)的功能基因共10個(gè)（表3）。細(xì)胞組分二級(jí)水平包含6種類(lèi)型（表3）：細(xì)胞器（organelle）功能基因6個(gè)，共質(zhì)體（symplast）功能基因1個(gè)，細(xì)胞聯(lián)結(jié)（cell junction）功能基因1個(gè)，細(xì)胞（cell）功能基因6個(gè)，胞外區(qū)（extracellular region）功能基因2個(gè)，膜（membrane）功能基因5個(gè)（圖3）。

表2 小麥功能基因分子功能二級(jí)水平的GO注釋

表3 小麥功能基因細(xì)胞組成二級(jí)水平的GO注釋

2.1.2 基于KEGG的生物通路富集分析 運(yùn)用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)獲得的功能基因進(jìn)行生物通路富集分析[17-18]，共有20個(gè)功能基因編碼的12種酶涉及到11個(gè)生物化學(xué)途徑：萜類(lèi)和類(lèi)固醇的生物合成，丙酮酸代謝，糖酵解途徑，類(lèi)胡蘿卜素的生物合成，抗生素生物合成，酪氨酸代謝，淀粉和蔗糖代謝，異喹啉類(lèi)生物堿的生物合成，檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)），嘌呤代謝，硫胺素代謝。這些酶包括合酶、乙酰轉(zhuǎn)移脫氫酶、氧化酶、腺嘌呤焦磷酸酶、磷酸酶（表4）。

表4 小麥功能基因基于KEGG的生物通路富集分析

2.2 小麥功能基因的定位

將97個(gè)小麥功能標(biāo)記與小麥全基因組序列庫(kù)進(jìn)行電子定位和功能注釋后，得到與小麥功能標(biāo)記對(duì)應(yīng)的小麥功能基因及功能預(yù)測(cè)（表5）。將所得基因的功能與之相應(yīng)的小麥功能標(biāo)記的功能進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，運(yùn)用UMN19，bx7_f_r，ZSBy9F2_R2，PPO33，Sus2_SNP_227_589L2，Pin_b_1，YP7A，cssfr7這些功能標(biāo)記可以克隆出其相應(yīng)的功能基因；運(yùn)用其余的功能標(biāo)記所克隆出的功能基因與之在功能上有一定差異。

3 結(jié)論

隨著小麥基因組序列測(cè)序的完成，越來(lái)越多的基因組序列信息能夠幫助人們了解基因結(jié)構(gòu)及其功能[19]。電子克隆速度快，成本低，適宜小實(shí)驗(yàn)室操作的優(yōu)點(diǎn)可以使研究者將更多的精力和資金投入到后續(xù)基因功能的研究中去。運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行小麥功能基因的電子克隆將起到不可替代的作用。它將大大加速小麥基因結(jié)構(gòu)、功能的研究進(jìn)程，同時(shí)它也會(huì)推動(dòng)比較基因組學(xué)的發(fā)展以及小麥起源、進(jìn)化和發(fā)育方面的研究。

本研究利用電子克隆技術(shù)成功克隆到小麥的功能基因，證明該技術(shù)的有效性[20]。然而，電子克隆也存在一定的缺點(diǎn)，因種內(nèi)多態(tài)性的存在，電子克隆所得序列與真實(shí)的序列可能存在差異，其準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

表5 小麥功能基因的特征

參考文獻(xiàn)：

［1］Liu Y N，HeZ H，Rudi Appels，et al.Functional markers in wheat：current status and future prospects[J].Theoretical and Applied Genetics，2012，125：1-10.

［2］Mayer K F，Rogers J，Doleěel J，et al.A chromosome-based draft sequenceofthehexaploidbreadwheat（Triticum aestivum）genome [J].Science，2014，345：1251788-1251799.

［3］Frédéric C，Adriana A，Sébastien T，et al.Structural and functional partitioningofbreadwheatchromosome3B[J].Science，2014，345：1249721-1249727.

［4］Thomas M，SandveS R，LiseH，et al.Ancient hybridizations among the ancestral genomes of bread wheat[J].Science，2014，345：1250092-1250095.

［5］Matthias P，Kugler K G，Sandve S R，et al.Genome interplay in the grain transcriptome of hexaploid bread wheat[J].Science，2014，345：1250091-1250097.

［6］邢小萍，袁虹霞，孫炳劍，等.小麥品種對(duì)紋枯病的抗性鑒定及評(píng)價(jià)[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（6）：77-78.

［7］胡銳，邢彩云，吳營(yíng)昌，等.11個(gè)優(yōu)質(zhì)小麥品種對(duì)小麥白粉病抗性的初步鑒定[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，40（5）：108-110.

［8］邢小萍，劉春元，袁虹霞，等.35個(gè)優(yōu)質(zhì)小麥品種（系）對(duì)葉部主要病害的抗性鑒定及評(píng)價(jià)[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005（10）：49-52.

［9］夏金初.小麥品種資源抗赤霉病性鑒定研究[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，1987（S1）：43-45.

［10］王振躍，高書(shū)峰，李洪連，等.不同小麥品種(系)對(duì)禾谷孢囊線蟲(chóng)病的抗性鑒定[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（5）：50-52.

［11］何文蘭，宋玉立，楊共強(qiáng).離體葉段鑒定小麥白粉病、條銹病和葉銹病抗性方法的研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999（10）：20-22.

［12］黃驥，張紅生，曹雅君，等.水稻功能基因的電子克隆策略[J].中國(guó)水稻科學(xué)，2002，16（4）：295-298.

［13］王冬冬，朱延明，李勇，等.電子克隆技術(shù)及其在植物基因工程中的應(yīng)用[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37（3）：403-408.

［14］劉武藝.基因本體論的蟾蜍bHLH轉(zhuǎn)錄因子功能富集分布[J].生物信息學(xué)，2011，9（4）：292-302.

［15］袁媛，唐東芹，楊柳燕，等.郁金香‘上農(nóng)早霞’花色變異相關(guān)基因的信息分析 [J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)科學(xué)版，2015，33（2）：9-17.

［16］胡文靜.棉纖維起始發(fā)育優(yōu)勢(shì)基因表達(dá)譜和三個(gè)新基因的克隆與功能初步分析[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［17］Masaaki Kotera，Yuki Moriya，Toshiaki Tokimatsu，et al.KEGG and genome net，new developments，metagenomic analysis[J]. EncyclopediaofMetagenomics，2015：329-339.

［18］ Kiyoko F，Aoki-Kinoshita，Minoru Kanehisa，et al.Glycomic analysis using kEGG GLYCAN glycoinformatics[J].Methods in MolecularBiology，2015，1273：97-107.

［19］韓斌，王長(zhǎng)彪，任永康，等.小麥分子育種研究進(jìn)展IV.小麥相關(guān)分子標(biāo)記[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（4）：489-492.

［20］羅火林，熊冬金，羅麗萍，等.辣椒CaArcA基因的電子克隆與生物信息學(xué)分析[J].生物技術(shù)，2013，23（6）：17-21.

In Silico Mapping and Annotation of Whole Genome Related Functional Genes in Wheat

WANG Changbiao1，HANBin2，LIU Jiang1，CUI Ting2，RENYongkang3，ZHAOXinghua1，DONG Yanhui1，LI Yali1，TANG Zhaohui1
（1.BiotechnologyResearchCenter，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan030031，China；2.CollegeofBio-engineering，Shanxi University，Taiyuan030006，China；3.InstituteofCropSciences，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan030031，China）

In silicocloning was a newway of gene-cloning by bioinfomatics,which developed with genome enforcementand EST project.Thisstudyclonedwheatfunctional geneinsilicocloningtechnology,labeledwithwheatfunctional markersasprobesinthewheat genome database.Furthermore,bioinformatics analysis were made on these functional genes.The results showed that the functional markers of bx7_f_r,ZSBy9F2_R2,PPO33,Sus2_SNP_227_589L2,UMN19,Pin_b_1,YP7A and cssfr7 could be cloned the corresponding functional genes.This study will contribute to the next step of wheat gene cloning,fine mapping and marker assisted breedingwork.

bioinformatics;wheat；functional gene;insilicocloning

S512.1

A

1002-2481（2016）07-0894-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.07.02

2016-12-16

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20130311001-8）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育種工程項(xiàng)目（11yzgc028）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院育種基礎(chǔ)項(xiàng)目（yzjc1201）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技攻關(guān)項(xiàng)目（2013GG51）

王長(zhǎng)彪（1975-），男，山西祁縣人，助理研究員，主要從事分子標(biāo)記輔助育種研究工作。唐朝暉為通信作者。