劉文，何國平，宋雅嫻，胡月，郭通航，張娛，張賢生

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院生殖中心，安徽 合肥 230001；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，安徽 合肥 230022)

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安徽地區(qū)1 163例男性不育患者Y染色體無精子因子基因微缺失分析

劉文1，何國平1，宋雅嫻1，胡月1，郭通航1，張娛1，張賢生2

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院生殖中心，安徽 合肥 230001；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，安徽 合肥 230022)

目的 通過分析安徽地區(qū)1 163例不育男性的Y染色體無精子因子(AZF)微缺失情況及特點，探討其在診治男性不育癥中的臨床價值。方法 采用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(mPCR)技術(shù)擴(kuò)增1 163例精子數(shù)目、活力異常的男性不育患者AZF基因的15個序列標(biāo)簽位點(STS)，并使用瓊脂糖凝膠電泳對目的片段進(jìn)行鑒別分析。結(jié)果 1 163例不育患者中130例(11.18%)患者AZF基因位點發(fā)生微缺失。在AZF微缺失組合類型中，AZFc+AZFd位點微缺失最多，共97例(8.34%,97/1 163)；其次為AZFb+AZFc+AZFd的組合缺失，共21例(1.81%,21/1 163)；AZFa+AZFb+AZFc+AZFd四個AZF區(qū)域均發(fā)生缺失的患者，以及僅僅在AZFa區(qū)域發(fā)生微缺失的患者分別為6例，各占總不育患者的0.52%(6/1 163)。結(jié)論 Y染色體AZF區(qū)域微缺失是部分男性不育癥的重要遺傳致病因素，有必要對精液質(zhì)量異常的男性不育患者進(jìn)行AZF基因微缺失檢測，將有助于明確病因并指導(dǎo)后續(xù)治療。

男性不育；無精子癥；少精子癥；無精子因子；Y染色體微缺失

近年來，由男方不育引起的不孕比例已由15%增至50%[1]。男性不育的影響因素較多，包括性交異常、免疫學(xué)病因和內(nèi)分泌因素等，其中由于遺傳因素引起的不育占整個影響因素的30%，包括染色體異常及與生精相關(guān)基因的異常[2]。Klinefelter’s征和Y染色體長臂無精子因子(Azoospermia factor,AZF)微缺失是主要的遺傳性不育因素[3]。AZFa、AZFb、AZFc、AZFd基因片段位于Yq11.23，包含了大量的插入重復(fù)片段和回文結(jié)構(gòu)，因此易發(fā)生微缺失[4]。進(jìn)一步可導(dǎo)致無精子癥或嚴(yán)重的少弱精子癥，約占無精子癥或嚴(yán)重少弱精子癥總數(shù)的10%～15%[5]。伴隨著Y染色體DNA文庫和覆蓋Y染色體DNA序列標(biāo)簽位點(Sequence tag sites,STS)物理圖譜的建立，對精子數(shù)目、質(zhì)量異常的不育患者進(jìn)行AZF微缺失檢測已成為國內(nèi)外男科、生殖醫(yī)學(xué)中心、產(chǎn)前遺傳咨詢門診的必備常規(guī)檢查。目前已發(fā)現(xiàn)AZF區(qū)域有近300個STS位點標(biāo)記，這種多位點標(biāo)記為檢測AZF缺失提供了有利的條件[6]。本研究總結(jié)了自2012年6月至2015年6月安徽地區(qū)1 163例男性不育患者進(jìn)行染色體檢查的結(jié)果。以患者的外周血基因組DNA為模板，采用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增Y染色體AZF區(qū)域15個序列標(biāo)簽位點(STS)的目的片段并電泳分析，探討AZF基因微缺失發(fā)生率及組合缺失類型，以期明確AZF微缺失與精子數(shù)量、質(zhì)量異常及男性不育癥發(fā)生的關(guān)聯(lián)，為臨床診療提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2012年6月至2015年6月在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院生殖中心進(jìn)行精液常規(guī)檢測發(fā)現(xiàn)異常的1 163例男性不育患者，年齡23～45周歲?；颊呔鶡o急性傳染性疾病、無接觸大劑量放射線、無接觸有害生化物質(zhì)和嚴(yán)重泌尿生殖道外傷史，同時排除急性睪丸炎、附睪炎、尿道炎等嚴(yán)重泌尿生殖道感染患者。

1.2 檢測試劑 血液基因組DNA提取試劑盒由北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供(Cat.No.CW9008-20)，Y染色體AZF基因微缺失檢測試劑盒由廣東深圳亞能生物技術(shù)有限公司提供(含PCR擴(kuò)增體系、STS及內(nèi)參照基因擴(kuò)增引物)，DNA marker由天根生化科技(北京)有限公司提供(Cat.No.DM110413)。1.3 檢測儀器 基因擴(kuò)增儀(TC-4000，英國Techne)、電泳儀(Plex 200 SYSTEM，美國Bio-Rad)、紫外-可見分光光度計(UV-2600，日本SHIMADZU)、全自動凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc XR+，美國Bio-Rad)。

1.4 研究方法

1.4.1 基因組DNA提取 按照試劑盒說明嚴(yán)格操作，靜脈抽取患者2 mL外周血，EDTA抗凝，混勻后取200 μL采用硅膠法進(jìn)行外周血基因組DNA抽提，使用紫外-可見分光光度計確認(rèn)DNA質(zhì)量。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 運用多重PCR技術(shù)檢測Y染色體AZFa、AZFb、AZFc、AZFd區(qū)域15個序列標(biāo)簽位點，4組多重PCR反應(yīng)體系各25 μL，分為Ⅰ管、Ⅱ管、Ⅲ管、Ⅳ管。15對引物AZFa(SY82、SY84、SY86)、AZFb(SY143、SY127、SY124、SY133、SY128、SY134)、AZFc(SY254、SY242、SY255、SY239)、AZFd(SY152、SY145)和一對內(nèi)控引物(SRY，472 bp)，目的片段長度見表1。PCR反應(yīng)條件設(shè)置如下：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃解鏈35 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，33個循環(huán)；72 ℃10 min后得到的PCR產(chǎn)物保存于4 ℃冰箱。

表1 Y染色體AZF微缺失檢測中STS位點、對應(yīng)區(qū)域及目的片段大小

1.4.3 核酸電泳 將各管中PCR產(chǎn)物于2.5%的瓊脂糖凝膠(含溴乙錠為染色劑)上120 V電泳1 h，再置于紫外光凝膠成像系統(tǒng)上觀察、記錄對照及AZF條帶的擴(kuò)增、缺失情況。

2 結(jié)果

2.1 1 163例患者精液常規(guī)及AZF基因微缺失檢測結(jié)果 在本院生殖中心發(fā)現(xiàn)的1 163例精液異?；颊咧?，不明原因性無精癥患者387例，梗阻性無精癥患者8例，少弱精癥患者686例、單純少精子癥患者82例。根據(jù)精液常規(guī)檢查結(jié)果將患者劃分為6組，分別為：(1)無精癥組(不明原因)；(2)無精癥組(梗阻性)；(3)輕度少弱精癥組；(4)中度少弱精癥組；(5)重度少弱精癥組；(6)單純少精癥組。見表2。PCR擴(kuò)增目的片段后瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，1163例不育男性中出現(xiàn)Y染色體AZF區(qū)域微缺失的患者共有130例，總體缺失比例為11.18%。其中，無精癥(不明原因性)患者AZF基因微缺失率為9.04%(35/387)，無精癥(梗阻性)患者缺失率為1.25%(1/8)，輕度少弱精癥患者缺失率為6.90%(4/29)，中度少弱精癥患者缺失率為6.81%(22/323)，重度少弱精癥患者缺失率為20.36%(68/334)，單純性少精癥患者缺失率為2.44%(2/82)。

表2 1 163例男性不育患者的精液參數(shù)及Y染色體AZF基因微缺失情況

2.2 130例Y染色體AZF基因微缺失患者缺失組合類型 上述130例Y染色體無精子因子微缺失患者4個區(qū)域的缺失發(fā)生率從高至低分別為：AZFc(95.38%,124/130)、AZFd(95.38%，124/130)、AZFb(20.77%,27/130)、AZFa(9.23%,12/130)。缺失的組合類型為：AZFa單獨缺失、AZFc+AZFd組合缺失、AZFb+AZFc+AZFd組合缺失及AZFa+AZFb+AZFc+AZFd組合缺失，AZFb/c/d發(fā)生單獨區(qū)域位點缺失及AZF4個區(qū)域中其它類型的組合缺失病例未在本研究中發(fā)現(xiàn)。本組中每種缺失類型的典型病例見圖1。

注：泳道自左至右分別為：DNA marker，Ⅰ管，Ⅱ管，Ⅲ管，Ⅳ管。

圖1 Y染色體AZF基因微缺失典型病例PCR擴(kuò)增后2.5%瓊脂糖凝膠電泳圖

在各種缺失類型中，AZFc+AZFd組合缺失患者最多，共97例，占74.62%(97/130)，其次為AZFb+AZFc+AZFd組合缺失類型，共21例患者(16.15%,21/130)，AZFa+AZFb+AZFc+AZFd位點全部缺失及AZFa區(qū)域單獨缺失患者分別為6例，各占總?cè)笔Щ颊呷藬?shù)的4.62%(6/1 163)。相關(guān)統(tǒng)計結(jié)果見表3。

表3 1 163例男性不育癥患者Y染色體AZF基因微缺失組合類型

3 討論

男性不育癥可能由多種因素綜合導(dǎo)致?；蛞蛩卦谀行圆挥Y中發(fā)揮著重要作用，無論是先天遺傳性的，還是后天各種原因?qū)е碌某Ｈ旧w、性染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)的異常，都會以不同途徑造成性腺軸或者精子發(fā)生、發(fā)育過程的異常，從而導(dǎo)致不育。

遺傳性男性不育患者中，Y染色體無精子因子(AZF)微缺失發(fā)生率僅次于Klinefelter’s征排在第二位，常引起較為嚴(yán)重的精子數(shù)目、形態(tài)、活力異常[3]。AZFa、AZFb、AZFc、AZFd4個區(qū)域與精子的發(fā)生、成熟均存在某些內(nèi)在關(guān)聯(lián)，但AZF基因微缺失影響正常生精的過程和機(jī)制尚未完全闡明。現(xiàn)有資料表明，AZFa區(qū)域發(fā)生微缺失的患者生精組織的病理類型多為唯支持細(xì)胞綜合征(SCOS)，臨床表現(xiàn)多為無精子癥；AZFb缺失通常與生殖細(xì)胞成熟停滯有關(guān)，影響其減數(shù)分裂，主要使其停留在精母細(xì)胞階段；AZFc缺失較常見，影響精原細(xì)胞向精子細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，致多種無精子和嚴(yán)重少弱精子發(fā)生；由于AZFd的序列與AZFb和AZFc存在重疊，因而該區(qū)的缺失與上述兩個AZF區(qū)域的微缺失臨床、病理表現(xiàn)類似[7-9]。另外，部分AZF缺失患者會出現(xiàn)內(nèi)分泌異常，具體表現(xiàn)為原發(fā)睪丸衰竭，睪丸發(fā)育障礙使睪酮產(chǎn)生減少，從而導(dǎo)致FSH增高、LH正?；蛳鄳?yīng)不同程度的增高[10]。

統(tǒng)計資料顯示Y染色體AZF基因微缺失在不育男性中的檢出率為2%～10%不等，其中無精子癥患者AZF微缺失檢出率最高，約為18%，少弱精子癥患者AZF微缺失檢出率約為 14%、而單純少精子癥患者AZF微缺失檢出率較低，僅為4%[11-12]。不同種族人群原發(fā)性男性不育癥Y染色體微缺失的發(fā)生率高低不一，與種族差異與地域差異有關(guān)。本研究中安徽地區(qū)1 163例男性不育癥患者無精因子微缺失的發(fā)生率約為11.18%，與國內(nèi)外各中心的研究結(jié)果相近。同時，AZF缺失范圍大小與男性精子生成障礙表現(xiàn)程度有緊密關(guān)聯(lián)，AZFc區(qū)基因缺失越多的患者中精子數(shù)量有可能越少[13]。研究發(fā)現(xiàn)不同的AZF缺失類型與精子質(zhì)量體現(xiàn)出一定的對應(yīng)關(guān)系，AZF片段缺失范圍越大，生精功能越差。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)男性不育患者多為多位點組合缺失，單一位點缺失較少，其中AZFc+AZFd位點同時缺失的類型最多，其次為AZFb+AZFc+AZFd組合缺失類型，AZFa+AZFb+AZFc+AZFd組合缺失以及AZFa單獨微缺失的概率較低，其余類型的缺失組合則未在本組中發(fā)現(xiàn)。

我們的研究同時發(fā)現(xiàn)在本組1 163例不育男性中絕大多數(shù)未檢測到AZF基因任何區(qū)域的微缺失，提示AZF基因微缺失不是導(dǎo)致無精癥和少、弱精癥乃至男性不育的唯一致病因素，隱睪、睪丸扭轉(zhuǎn)、精索靜脈曲張、鞘膜積液、免疫失穩(wěn)、病原體逆行感染等也會影響睪丸的正常生精功能進(jìn)而導(dǎo)致不育[14-15]。伴隨著一系列輔助生殖技術(shù)的發(fā)展成熟，使得某些不育患者重拾了生育的信心，但考慮到各類AZF微缺失類型患者的不同生育結(jié)果以及AZF微缺失可能發(fā)生垂直傳遞的特點，對不育群體進(jìn)行AZF檢測、分型是十分必要的。

總而言之，Y染色體AZF基因微缺失檢測幫助我們在分子生物學(xué)基因?qū)用嫔狭私饬瞬糠帜行圆挥陌l(fā)病原因，AZF微缺失給人們生育帶來的困擾也逐漸被認(rèn)知。AZF基因微缺失檢測具有重要的理論與臨床實踐意義，有利于明確部分男性不育患者的病因并指導(dǎo)治療方案的選擇。

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Azoospermia factor microdeletions on Y chromosome from 1163 male infertility patients in Anhui province

LIU Wen,HE Guoping,SONG Yaxian,et al

(ReproductiveMedicineCenter,TheAffiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniversity，Hefei,Anhui230001,China)

Objective To analyze the frequency and characteristics of azoospermia factor(AZF)microdeletions on Y chromosome from 1 163 infertile men in Anhui province and to discuss the diagnostic value of AZF microdeletions detection in male infertility.Methods Multiple polymerase chain reaction(PCR)techniques combined with agarose gel electrophoresis were applied to analyze 15 sequence tagged sites(STS)of the azoospermia factor(AZF)microdeletions among 1 163 male infertility patients with azoospermia or oligozoosperm in Anhui province.Results Among all the 1 163 infertile men,130(11.18%)cases were detected to have AZF microdeletions.As for combined types of AZF microdeletions,there were 97 cases(8.34%,97/1163)of AZFc+AZFd deletions,21 cases(1.81%,21/1 163)of AZFb+AZFc+AZFd deletions,6 cases(0.52%,6/1 163)of AZFa+AZFb+AZFc+AZFd deletions,and 6 cases(0.52%,6/1163)of AZFa deletions.Conclusions AZF microdeletion is one of the most important causes for sperm abnormality and subsequent male infertility.AZF microdeletion screening for infertile men with sperm abnormality is necessary to facilitate accurate diagnosis and optimal therapy.

Male infertility;Azoospermia;Oligozoosperm;Azoospermia factor;Y chromosome microdeletions

國家自然科學(xué)基金面上項目(81370749)

何國平，男，副主任醫(yī)師，研究方向：產(chǎn)前診斷及男性不育癥的診治，E-mail:13865943124@126.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.11.018

2016-07-31，

2016-09-18)