成彥,顧寧,陳偉,方丹君
(1.南京醫(yī)科大學(xué),江蘇 南京 210029;2.南京市中醫(yī)院,江蘇 南京 210001;3.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院,江蘇 蘇州 215009)
?
高效液相色譜法測定穩(wěn)心律合劑中4種丹參類成分含量
成彥1,2,顧寧2,陳偉3,方丹君1
(1.南京醫(yī)科大學(xué),江蘇 南京 210029;2.南京市中醫(yī)院,江蘇 南京 210001;3.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院,江蘇 蘇州 215009)
目的 建立高效液相色譜法(HPLC)測定穩(wěn)心律合劑中4種丹參類成分的含量。方法 采用Agilent Zorbax SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫35 ℃,流動相A為乙腈,流動相B為0.03 mol·L-1乙酸銨(甲酸調(diào)pH至2.4),進(jìn)行梯度洗脫,流速1.0 mL·min-1,檢測波長280 nm。結(jié)果 4種丹參類成分(丹參素鈉在15.41~154.1 mg·L-1;原兒茶醛在4.79~47.9 mg·L-1;丹酚酸B在7.37~73.7 mg·L-1;丹參酮Ⅱa在4.22~42.2 mg·L-1濃度范圍內(nèi))均呈良好線性關(guān)系(r=0.999 9);平均回收率為95.79%~97.48%;RSD均小于3.0%。結(jié)論 該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好、具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性,可用于穩(wěn)心律合劑的質(zhì)量控制。
丹參;穩(wěn)心律合劑;高效液相色譜法;含量測定
穩(wěn)心律合劑為南京市中醫(yī)院心內(nèi)科常用制劑,具有通心陽,益心氣,補(bǔ)陰血,安神定悸的作用;已在臨床使用多年,對心悸胸悶、頭昏不適、快速房顫、室上速、竇性心律失常有顯著的療效。該藥主要由桂枝、丹參、炙甘草、麥冬、瓜蔞、生龍骨、黃連、牡蠣、苦參等組成。穩(wěn)心律合劑組方藥味較多,成分比較復(fù)雜,目前對該制劑尚未制定快速有效的質(zhì)量控制方法,丹參作為該制劑中的君藥,為唇形科植物丹參(salviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根莖[1-3],是我國常用傳統(tǒng)中藥,味苦,性微寒,歸心、肝經(jīng),具有祛瘀止痛,活血通經(jīng),清心除煩等功效。臨床廣泛用于心腦血管疾患[4-5],丹參含有多種化學(xué)成分并具有廣泛的生物活性,其傳統(tǒng)藥理以擴(kuò)血管,活血化瘀,改善微循環(huán)為主[6-7]?,F(xiàn)代藥理研究表明,丹參尚具有抗腫瘤,抗菌消炎,抗雄性激素,抑制皮脂腺增生,抗肝硬化,抗纖維化,促進(jìn)組織修復(fù)和再生等多種藥理活性[8]。
高效液相色譜法(HPLC)作為現(xiàn)代化的檢測技術(shù)[9-10],已經(jīng)比較成熟的運(yùn)用在了藥檢中,本文運(yùn)用HPLC對穩(wěn)心律合劑中君藥丹參中的四種成分進(jìn)行檢測,建立了快速穩(wěn)定的質(zhì)量檢查方法。
1.1 儀器 高效液相色譜儀(Waters e2695-2998,PDA檢測器,Empower 3色譜工作站);Agilent Zorbax SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);電子天平(Sartorius, BP115D,d=0.1 mg);高速離心機(jī)(Thermo,Biofuge primo R);電熱恒溫水浴鍋(HH S11-6S,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。
1.2 試藥及試劑 甲醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純);乙腈(Sigma-Aldrich,色譜純);乙酸銨(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純);去離子水(Milli-Q超純水機(jī)制備,美國Millipore公司生產(chǎn))。
丹參素鈉對照品(批號:201412,純度:99.5%),原兒茶醛對照品(批號:201007,純度:98.2%),丹酚酸B對照品(批號:201313,純度:97.0%),丹參酮IIa對照品(批號:200619,純度:100%),均購自中國藥品生物制品檢定研究院。
10批穩(wěn)心律合劑,批號為150119、150209、150311、150421、150529,150626、150713、150822、150918、151014均由南京市中醫(yī)醫(yī)院制劑部生產(chǎn)。
2.1 色譜條件 采用Agilent Zorbax SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫為35 ℃,流動相A為乙腈,流動相B為0.03 mol·L-1乙酸銨(甲酸調(diào)pH至2.4),梯度洗脫,程序見表1,流速為1.0 mL·min-1,檢測波長為280 nm,進(jìn)樣量為10 μL。
表1 梯度洗脫程序
2.2 溶液的制備
2.2.1 混合對照品溶液 分別取丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、丹參酮IIa對照品適量,精密稱定,加甲醇制成每1 mL分別含丹參素鈉0.15 mg、原兒茶醛0.05 mg、丹酚酸B 0.07 mg、丹參酮IIa 0.04 mg的混合溶液,即得對照品儲備液。
2.2.2 供試品溶液 精密量取批號8150529穩(wěn)心律合劑10 mL,水浴蒸干,用適量甲醇溶解,定容至10 mL量瓶中,離心,取上清液,即得。
2.2.3 空白溶液 以相應(yīng)的溶劑作為空白溶液,即得。
2.3 系統(tǒng)適用性試驗 取混合對照品溶液、供試品溶液及空白溶液各10 μL,按“2.1”項下條件進(jìn)行檢測,4種丹參類成分色譜峰分離度良好,空白無干擾,色譜圖見圖1。原兒茶醛對照品峰的理論板數(shù)為24 174,主峰和雜質(zhì)分離良好,分離度為15.1,拖尾因子1.03。
2.4 線性關(guān)系 精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL于2 mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,進(jìn)樣10 μL,按“2.1”項下條件進(jìn)樣,測定峰面積。分別以4種丹參成分的濃度(mg·L-1)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算回歸方程。將上述對照品溶液再稀釋后進(jìn)樣,根據(jù)峰高以信噪比S/N=3確定檢出下限,S/N=10確定定量下限。結(jié)果見表2。
2.5 精密度試驗 取批號150529樣品的供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,計算4種成分進(jìn)樣精密度,丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、丹參酮IIa RSD分別為1.76%、1.22%、0.89%、1.04%,說明儀器精密度良好。
2.6 穩(wěn)定性試驗 取批號150529樣品的供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件分別于0、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣,測定峰面積,計算4種成分的穩(wěn)定性,丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、丹參酮IIa RSD分別為1.01%、1.66%、1.32%、0.65%,說明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
注:1.丹參素鈉;2.原兒茶醛;3.丹酚酸B;4.丹參酮IIa。
圖1 HPLC色譜圖
2.7 重復(fù)性試驗 精密量取批號150529樣品6份,每份25ml,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件測定峰面積,計算4種成分含量,其RSD在0.79%~1.87%之間,說明方法重復(fù)性良好。
2.8 加樣回收率試驗 精密量取已測得含量的批號150529樣品6份,各10 mL,精密加入“2.2.1”項下混合對照品溶液0.5 mL,水浴蒸干,加甲醇適量,定容至10 mL,按“2.1”項下色譜條件測定峰面積,計算回收率和RSD,結(jié)果見表3。
表3 4種重樓皂苷加樣回收率(n=6)
2.9 樣品測定 取穩(wěn)心律合劑10批,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件測定4種成分含量,結(jié)果見表4。
表4 樣品含量測定/mg·L-1
穩(wěn)心率合劑為筆者所在醫(yī)院的臨床常用藥,主要由丹參,龍骨等中藥組方而成。目前尚未制定對該制劑快速有效的質(zhì)量控制方法。丹參是穩(wěn)心率合劑中主要藥物,選定丹參中的4種主要成分進(jìn)行含量測定并建立穩(wěn)定可靠的質(zhì)量控制方法比較符合制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究思路。
由于中藥復(fù)方中成分眾多,等度洗脫難以充分分離,所以采用梯度洗脫的方法。選用Agilent Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,采用梯度洗脫方法,比較了不同流動相系統(tǒng)乙腈-乙酸銨溶液、甲醇-水、乙腈-醋酸水溶液。結(jié)果表明,乙腈-乙酸銨溶液(0.03 mol·L-1)系統(tǒng)優(yōu)于其他流動相系統(tǒng),故選乙腈-乙酸銨溶液流動相系統(tǒng)作為本制劑指紋圖譜流動相系統(tǒng)。
對樣品處理方法進(jìn)行比較。采用甲醇與水超聲提取,比較了甲醇的不同體積分?jǐn)?shù)(20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%);比較了不同提取方法(超聲、加熱回流、浸漬等)、不同超聲時間(5、10、15、20、30、40、50和60 min)。結(jié)果表明,甲醇優(yōu)于水;對不同提取方法比較,結(jié)果表明,超聲提取峰面積大、時間短;對不同超聲時間比較,結(jié)果表明,甲醇超聲30 min以后,丹參中4種成分各個峰的面積不增加。綜合上述各因素,選擇體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇、超聲30 min。
對不同柱溫與流速進(jìn)行比較,柱溫超過或低于35 ℃,色譜峰分離度??;流速高于或低于1.0 mL·min-1,色譜峰分離度差。因此選擇便于控制的柱溫35 ℃與流速1.0 mL·min-1。
本文建立了丹參4種成分含量測定方法,精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均符合要求。上述方法為制定穩(wěn)心率合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)。
[1] 國家藥典委員會. 中國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2015:76.
[2] 王道平,周欣,梁光義,等.不同產(chǎn)地丹參中有效成分的含量比較[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2005,17(1):70-72.
[3] 劉慧,開金龍.丹參的現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].甘肅中醫(yī),2010,23(2):70-72.
[4] 岳宗拄,朱玉森.復(fù)方丹參滴丸聯(lián)合拉米夫定治療活動性肝硬化的療效觀察[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2007,10(1):642-651.
[5] 陳少軍,陳宏降,郭章華.丹參中抗血栓活性成分的虛擬篩選[J].中藥藥理與臨床,2013,29(6):103-106.
[6] 馬炳祥,董寵凱.丹參的藥理作用研究新進(jìn)展[J].中國藥房,2014,25(7):663-665.
[7] 王署東,周軍.丹參藥理研究及臨床應(yīng)用概況[J].中醫(yī)藥信息,2000,7(2):9-11.
[8] 鐘曉鳳.丹參和百花丹參葉的化學(xué)成分藥理研究及臨床應(yīng)用[J].中醫(yī)臨床研究,2014,6(3):135-136.
[9] 曾令杰,林文雄,梁暉,等.丹參中活性成分的同時定量分析及其相關(guān)性研究[J].中成藥,2008,30(6):892-896.
[10] 劉梅,夏鑫華,俞桂新,等.丹參藥材超高效液相色譜指紋圖譜研究[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2009,26(6):559-564.
Content determination of 4 components of salvia in wenxinlv mixture by HPLC
CHEN Yan1,2,GU Ning2,CHEN Wei3,et al
(1.NanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu210029,China;2.NanjingMunicipalHospitalofTCM,Nanjing,Jiangsu210001,China;3.SuzhouHospitalofTraditionalChineseMedicine,Suzhou,Jiangsu215009,China)
Objective To establish an HPLC method for simultaneously determining the contents of 4 chemical components of salvia in wenxinlv mixture.Methods HPLC system consisted of Agilent Zorbax SB C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm),gradiently eluted with acetonitrile-water solution(0.03 mol·L-1ammonium acetate).The flow rate of mobile phase was 1.0 mL·min-1,UV detection wavelength was set at 280 nm and column temperature was maintained at 35℃.Results The four components showed good linearity within the tested concentration scope(r=0.999 9);the method was validated and the recoveries were 95.79%~97.48%.RSD was lower than 3.0%.Conclusion This method is simple,accurate and reproducible,which can be used for the quality control for wenxinlv mixture.
Danshen;Wenxinlv mixture;HPLC;Content determination
江蘇省中醫(yī)藥局科技項目(YB2015059);南京市2015年度科技發(fā)展計劃資助項目(2015YX009);南京市中醫(yī)院科研項目(YJLC201605)
方丹君,女,副教授,碩士生導(dǎo)師,研究方向:單細(xì)胞分析,E-mail:djf@njmu.edu.cn
10.3969/j.issn.1009-6469.2016.11.011
2016-07-26,
2016-09-05)