成彥，顧寧，陳偉，方丹君

(1.南京醫(yī)科大學(xué),江蘇 南京 210029；2.南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210001；3.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009)

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高效液相色譜法測(cè)定穩(wěn)心律合劑中4種丹參類成分含量

成彥1，2，顧寧2，陳偉3，方丹君1

(1.南京醫(yī)科大學(xué),江蘇 南京 210029；2.南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210001；3.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009)

目的 建立高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定穩(wěn)心律合劑中4種丹參類成分的含量。方法 采用Agilent Zorbax SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.03 mol·L-1乙酸銨(甲酸調(diào)pH至2.4)，進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。結(jié)果 4種丹參類成分(丹參素鈉在15.41～154.1 mg·L-1；原兒茶醛在4.79～47.9 mg·L-1；丹酚酸B在7.37～73.7 mg·L-1；丹參酮Ⅱa在4.22～42.2 mg·L-1濃度范圍內(nèi))均呈良好線性關(guān)系(r=0.999 9)；平均回收率為95.79%～97.48%；RSD均小于3.0%。結(jié)論 該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好、具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可用于穩(wěn)心律合劑的質(zhì)量控制。

丹參;穩(wěn)心律合劑;高效液相色譜法;含量測(cè)定

穩(wěn)心律合劑為南京市中醫(yī)院心內(nèi)科常用制劑，具有通心陽(yáng)，益心氣，補(bǔ)陰血，安神定悸的作用；已在臨床使用多年，對(duì)心悸胸悶、頭昏不適、快速房顫、室上速、竇性心律失常有顯著的療效。該藥主要由桂枝、丹參、炙甘草、麥冬、瓜蔞、生龍骨、黃連、牡蠣、苦參等組成。穩(wěn)心律合劑組方藥味較多，成分比較復(fù)雜，目前對(duì)該制劑尚未制定快速有效的質(zhì)量控制方法，丹參作為該制劑中的君藥，為唇形科植物丹參(salviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根莖[1-3]，是我國(guó)常用傳統(tǒng)中藥，味苦，性微寒，歸心、肝經(jīng)，具有祛瘀止痛，活血通經(jīng)，清心除煩等功效。臨床廣泛用于心腦血管疾患[4-5]，丹參含有多種化學(xué)成分并具有廣泛的生物活性，其傳統(tǒng)藥理以擴(kuò)血管，活血化瘀，改善微循環(huán)為主[6-7]。現(xiàn)代藥理研究表明，丹參尚具有抗腫瘤，抗菌消炎，抗雄性激素，抑制皮脂腺增生，抗肝硬化，抗纖維化，促進(jìn)組織修復(fù)和再生等多種藥理活性[8]。

高效液相色譜法(HPLC)作為現(xiàn)代化的檢測(cè)技術(shù)[9-10]，已經(jīng)比較成熟的運(yùn)用在了藥檢中，本文運(yùn)用HPLC對(duì)穩(wěn)心律合劑中君藥丹參中的四種成分進(jìn)行檢測(cè)，建立了快速穩(wěn)定的質(zhì)量檢查方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Waters e2695-2998，PDA檢測(cè)器，Empower 3色譜工作站)；Agilent Zorbax SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；電子天平(Sartorius， BP115D，d=0.1 mg)；高速離心機(jī)(Thermo，Biofuge primo R)；電熱恒溫水浴鍋(HH S11-6S，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)。

1.2 試藥及試劑 甲醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)；乙腈(Sigma-Aldrich，色譜純)；乙酸銨(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)；去離子水(Milli-Q超純水機(jī)制備，美國(guó)Millipore公司生產(chǎn))。

丹參素鈉對(duì)照品(批號(hào)：201412，純度：99.5%)，原兒茶醛對(duì)照品(批號(hào)：201007，純度：98.2%)，丹酚酸B對(duì)照品(批號(hào)：201313，純度：97.0%)，丹參酮IIa對(duì)照品(批號(hào)：200619，純度：100%)，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定研究院。

10批穩(wěn)心律合劑，批號(hào)為150119、150209、150311、150421、150529，150626、150713、150822、150918、151014均由南京市中醫(yī)醫(yī)院制劑部生產(chǎn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Agilent Zorbax SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為35 ℃，流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.03 mol·L-1乙酸銨(甲酸調(diào)pH至2.4)，梯度洗脫，程序見(jiàn)表1，流速為1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，進(jìn)樣量為10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別取丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、丹參酮IIa對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL分別含丹參素鈉0.15 mg、原兒茶醛0.05 mg、丹酚酸B 0.07 mg、丹參酮IIa 0.04 mg的混合溶液，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取批號(hào)8150529穩(wěn)心律合劑10 mL，水浴蒸干，用適量甲醇溶解，定容至10 mL量瓶中，離心，取上清液，即得。

2.2.3 空白溶液 以相應(yīng)的溶劑作為空白溶液，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行檢測(cè)，4種丹參類成分色譜峰分離度良好，空白無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖1。原兒茶醛對(duì)照品峰的理論板數(shù)為24 174，主峰和雜質(zhì)分離良好，分離度為15.1，拖尾因子1.03。

2.4 線性關(guān)系 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mL于2 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，進(jìn)樣10 μL，按“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。分別以4種丹參成分的濃度(mg·L-1)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。將上述對(duì)照品溶液再稀釋后進(jìn)樣，根據(jù)峰高以信噪比S/N=3確定檢出下限，S/N=10確定定量下限。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 精密度試驗(yàn) 取批號(hào)150529樣品的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算4種成分進(jìn)樣精密度，丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、丹參酮IIa RSD分別為1.76%、1.22%、0.89%、1.04%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)150529樣品的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算4種成分的穩(wěn)定性，丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B、丹參酮IIa RSD分別為1.01%、1.66%、1.32%、0.65%，說(shuō)明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

注：1.丹參素鈉；2.原兒茶醛；3.丹酚酸B；4.丹參酮IIa。

圖1 HPLC色譜圖

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取批號(hào)150529樣品6份，每份25ml，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算4種成分含量，其RSD在0.79%～1.87%之間，說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已測(cè)得含量的批號(hào)150529樣品6份，各10 mL，精密加入“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5 mL，水浴蒸干，加甲醇適量，定容至10 mL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 4種重樓皂苷加樣回收率(n=6)

2.9 樣品測(cè)定 取穩(wěn)心律合劑10批，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定4種成分含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定/mg·L-1

3 討論

穩(wěn)心率合劑為筆者所在醫(yī)院的臨床常用藥，主要由丹參，龍骨等中藥組方而成。目前尚未制定對(duì)該制劑快速有效的質(zhì)量控制方法。丹參是穩(wěn)心率合劑中主要藥物，選定丹參中的4種主要成分進(jìn)行含量測(cè)定并建立穩(wěn)定可靠的質(zhì)量控制方法比較符合制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究思路。

由于中藥復(fù)方中成分眾多，等度洗脫難以充分分離，所以采用梯度洗脫的方法。選用Agilent Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，采用梯度洗脫方法，比較了不同流動(dòng)相系統(tǒng)乙腈-乙酸銨溶液、甲醇-水、乙腈-醋酸水溶液。結(jié)果表明，乙腈-乙酸銨溶液(0.03 mol·L-1)系統(tǒng)優(yōu)于其他流動(dòng)相系統(tǒng)，故選乙腈-乙酸銨溶液流動(dòng)相系統(tǒng)作為本制劑指紋圖譜流動(dòng)相系統(tǒng)。

對(duì)樣品處理方法進(jìn)行比較。采用甲醇與水超聲提取，比較了甲醇的不同體積分?jǐn)?shù)(20%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%)；比較了不同提取方法(超聲、加熱回流、浸漬等)、不同超聲時(shí)間(5、10、15、20、30、40、50和60 min)。結(jié)果表明，甲醇優(yōu)于水；對(duì)不同提取方法比較，結(jié)果表明，超聲提取峰面積大、時(shí)間短；對(duì)不同超聲時(shí)間比較，結(jié)果表明，甲醇超聲30 min以后，丹參中4種成分各個(gè)峰的面積不增加。綜合上述各因素，選擇體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇、超聲30 min。

對(duì)不同柱溫與流速進(jìn)行比較，柱溫超過(guò)或低于35 ℃，色譜峰分離度??；流速高于或低于1.0 mL·min-1，色譜峰分離度差。因此選擇便于控制的柱溫35 ℃與流速1.0 mL·min-1。

本文建立了丹參4種成分含量測(cè)定方法，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均符合要求。上述方法為制定穩(wěn)心率合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)。

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Content determination of 4 components of salvia in wenxinlv mixture by HPLC

CHEN Yan1,2,GU Ning2,CHEN Wei3,et al

(1.NanjingMedicalUniversity,Nanjing,Jiangsu210029,China;2.NanjingMunicipalHospitalofTCM,Nanjing,Jiangsu210001,China;3.SuzhouHospitalofTraditionalChineseMedicine,Suzhou,Jiangsu215009,China)

Objective To establish an HPLC method for simultaneously determining the contents of 4 chemical components of salvia in wenxinlv mixture.Methods HPLC system consisted of Agilent Zorbax SB C18column(250 mm×4.6 mm，5 μm),gradiently eluted with acetonitrile-water solution(0.03 mol·L-1ammonium acetate).The flow rate of mobile phase was 1.0 mL·min-1,UV detection wavelength was set at 280 nm and column temperature was maintained at 35℃.Results The four components showed good linearity within the tested concentration scope(r=0.999 9);the method was validated and the recoveries were 95.79%～97.48%.RSD was lower than 3.0%.Conclusion This method is simple,accurate and reproducible,which can be used for the quality control for wenxinlv mixture.

Danshen;Wenxinlv mixture;HPLC;Content determination

江蘇省中醫(yī)藥局科技項(xiàng)目(YB2015059)；南京市2015年度科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(2015YX009)；南京市中醫(yī)院科研項(xiàng)目(YJLC201605)

方丹君，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：?jiǎn)渭?xì)胞分析，E-mail：djf@njmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.11.011

2016-07-26，

2016-09-05)