劉園，張華峰，宋青，戴博

(空軍總醫(yī)院，北京 100142)

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◇藥物分析◇

高效液相色譜法測定甲癬涂劑中水楊酸的含量

劉園，張華峰，宋青，戴博

(空軍總醫(yī)院，北京 100142)

目的 建立甲癬涂劑中水楊酸的含量測定方法。方法 色譜柱：Venusil XBP(L)C18柱(4.6 mm×100 mm,5 μm)為固定相，甲醇∶水(H3PO4調(diào)pH=3.0)=45∶55為流動相，檢測波長303 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫:20 ℃。進(jìn)樣量 20 μL。結(jié)果 水楊酸回歸方程為：A=5.14×104C-1.06×104(r=0.999 9)；線性范圍為：4.98～159.36 mg·L-1。平均回收率分別為98.0%、100.8%、100.5%。結(jié)論 該方法操作方便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可用于甲癬涂劑中水楊酸的含量測定。

高效液相色譜法；甲癬涂劑；水楊酸

甲癬涂劑[1-2]是由水楊酸、碘化鉀、冰醋酸等成分制成的涂劑，為真菌抑制劑，可治療手、足癬。水楊酸為甲癬涂劑的有效成分之一，起到溶解角質(zhì)，防腐殺菌的作用，為了更好的控制該制劑的質(zhì)量，提高本制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本研究參考中國藥典2010版二部，采用十八烷基硅膠鍵合色譜柱，建立了靈敏、專屬、可靠地高效液相色譜(HPLC)法測定甲癬涂劑中水楊酸的含量，經(jīng)試驗驗證，該方法保留時間適宜，可以準(zhǔn)確的測定樣品中水楊酸的含量，獲得了滿意的結(jié)果。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(島津LC-10AT液相色譜系統(tǒng)：島津LC-10AT.vp泵，SPD-10A檢測器，CTO-10A中央控制器，島津Class-vp工作站)；電子分析天平(Sartorius，型號：BS 110S)；紫外可見分光光度計(島津，型號：UV-2401PC)。精密pH計(上海雷磁儀器廠，型號：PHS-3B)。

1.2 試藥 水楊酸對照品(中國食品藥品檢定研究所，批號100106-201104)；其余原料均由空軍總醫(yī)院提供。甲醇為色譜純；硫代硫酸鈉和磷酸為分析純；水為重蒸水，其余試劑均為分析純。甲癬涂劑樣品(空軍總醫(yī)院提供，批號：20130801、20130802、20130803)。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測波長的選擇 由本品在流動相中的紫外吸收圖譜可知，水楊酸在303 nm波長處有最大吸收，因此本研究選擇303 nm波長作為水楊酸的測定波長，結(jié)果見圖1。

圖1 水楊酸對照品在流動相中紫外吸收圖譜

2.2 色譜條件 色譜柱：Venusil XBP(L)C18柱(4.6 mm×100 mm,5 μm，天津艾杰爾公司)；流動相：甲醇∶水(H3PO4調(diào)pH=3.0)=45∶55；檢測波長303 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫為20 ℃。進(jìn)樣體積 20 μL。

2.3 溶液的制備 對照品溶液的制備：精密稱取水楊酸對照品約10.00 mg于20 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，得對照品儲備液。精密吸取1 mL儲備液于10 mL量瓶中，甲醇稀釋并定容，即得對照品溶液。

硫代硫酸鈉溶液的制備：精密稱取約2.50 g硫代硫酸鈉(Na2S2O3·5H2O)于100 mL量瓶中，用新沸的冷水溶解并定容，搖勻，即得0.1 mol·L-1的硫代硫酸鈉溶液。

供試品溶液的制備：精密吸取本品2 mL，于100 mL量瓶中，精密加入硫代硫酸鈉溶液10 mL，用水稀釋并定容，搖勻，精密吸取上述稀釋溶液2 mL于100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.4 方法的專屬性 分別取對照品溶液和供試品溶液20 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。水楊酸的出峰時間為3.0 min，出峰前后沒有雜質(zhì)干擾，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)按水楊酸峰計算不低于3 000。結(jié)果表明，該色譜系統(tǒng)的適應(yīng)性良好。結(jié)果見圖2，3。

圖2 對照品溶液的HPLC圖譜

圖3 供試品溶液的HPLC圖譜

2.5 線性范圍的考察 精密量取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL對照品儲備液分別置10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別取各溶液20 μL注入色譜儀，記錄色譜圖和峰面積，由峰面積(A)對溶液濃度(C)作線性回歸，得回歸方程：A=5.14×104C-1.06×104，r=0.999 9。結(jié)果表明在4.98～159.36 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，本法的線性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 分別取水楊酸溶液于日內(nèi)(0、2、4、6、8、12 h)測定，結(jié)果峰面積分別為2572349、2568574、2567219、2571243、2565748、2562854，RSD為0.14%。結(jié)果表明，水楊酸溶液室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定，故在此時間內(nèi)對測定結(jié)果無影響。

2.7 耐用性試驗 實驗方法的正常檢測條件：Venusil XBP(L)C18柱(4.6 mm×100 mm,5 μm)；流動相：甲醇∶水(H3PO4調(diào)pH=3.0)=45∶55；檢測波長303 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫為20 ℃。

取本品，照2.3項下制備對照品溶液和供試品溶液，分別考察流動相中有機相比例變化±2%，pH值變化±0.1，柱溫變化±2℃，檢測波長變化±5 nm，流速變化±0.1 mL·min-1時，水楊酸含量的變化，并與正常檢測條件結(jié)果進(jìn)行比較，計算各條件下3次測定結(jié)果的RSD均小于5%，結(jié)果表明：在不同的變化條件下，水楊酸的含量沒有變化，表明水楊酸檢測法耐用性很好，檢測條件的變化對測定結(jié)果幾乎無影響。

2.8 重現(xiàn)性試驗 取本品，由不同操作人照2.3項下制備對照品溶液和供試品溶液，按相同的色譜條件測定。計算不同操作人測定的水楊酸的含量變化，3個不同操作人測得的水楊酸平均含量RSD小于2%，表明本法重現(xiàn)性良好。

2.9 回收率試驗 按照處方配制空白甲癬涂劑，精密加入一定量的水楊酸，得低、中、高不同濃度的溶液(相當(dāng)于樣品濃度的80%、100%、120%)，照2.3項下供試品溶液的制備方法制備，取制備好的樣品溶液20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，取峰面積帶入線性方程計算回收率，每個濃度平行測定3次?；厥章示弦螅Y(jié)果見表1。

表1 水楊酸回收率試驗結(jié)果

2.10 樣品的測定 精密吸取樣品2 mL，于100 mL量瓶中，精密加入硫代硫酸鈉溶液10 mL，重蒸水稀釋并定容，搖勻，精密吸取上述稀釋溶液2 mL于100 mL量瓶中，重蒸水稀釋至刻度，搖勻，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取水楊酸對照品溶液適量，同法測定。按外標(biāo)法以峰面積計算供試品中水楊酸的含量。結(jié)果20130801、20130802、20130803三批樣品水楊酸的含量分別為50.4、50.7、49.8 g·L-1。

3 討論

對于水楊酸的含量測定方法，文獻(xiàn)已報道有分光光度法[3]、離子色譜法[4]、化學(xué)發(fā)光法[5]以及HPLC法[6]等。結(jié)合水楊酸的結(jié)構(gòu)特點，且在紫外區(qū)有吸收，本研究參考中國藥典2010版二部，采用十八烷基硅膠鍵合色譜柱[7]，建立了靈敏、專屬、可靠地HPLC法測定甲癬涂劑中水楊酸的含量，經(jīng)試驗驗證，該方法可以準(zhǔn)確的測定樣品中水楊酸的含量。

甲癬涂劑的主要成分包括水楊酸、冰醋酸、碘、碘化鉀，其中碘在紫外吸收區(qū)也有吸收，干擾水楊酸的測定，如采用液液萃取法萃取水楊酸，試驗操作繁瑣、回收率低；為減少操作步驟和測定誤差，采用過量的硫代硫酸鈉將單質(zhì)碘還原為碘離子[8]，稀釋后直接注入HPLC分析。操作簡單，測量精準(zhǔn)，可獲得滿意研究結(jié)果。

本實驗分別對紫外分光光度法和HPLC法進(jìn)行了比較，HPLC法測定水楊酸出峰時間為3.0 min，出峰前后沒有雜質(zhì)干擾，分離度大于1.5，專屬性更強；且紫外分光光度法易受到環(huán)境、人為操作等因素的影響，所以HPLC法是穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度更高的方法。

[1] 中國人民解放軍總后勤部衛(wèi)生部.中國人民解放軍醫(yī)療機構(gòu)制劑規(guī)范[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2003：143-144.

[2] 王愛平，高露娟，席麗艷.足癬患者治療現(xiàn)狀調(diào)查[J].中國真菌學(xué)雜志，2014,9(6)：335-338.

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[5] 謝成根，李淮芬.流動注射化學(xué)發(fā)光法測定黑白癬藥水中的水楊酸[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2004,14(4):422-423.

[6] 黃潔，李鋒武，劉鵬鳴,等.反相高效液相色潽法測定復(fù)方水楊酸酊中水楊酸和苯甲酸含量[J].中國藥業(yè)，2012,21(20):39-40.

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[8] 李媛媛.用硫代硫酸鈉清除碘痕跡[J].中國誤診學(xué)雜志，2011,11(21):5137.

Determination of salicylic acid in paint for onychomycosis by HPLC

LIU Yuan，ZHANG Huafeng，SONG Qing，et al

(TheGeneralHospitalofAirForce,Beijing100142,China)

Objective To establish a method for determination of salicylic acid in paint for onychomycosis by HPLC.Methods The chromatographic analysis was carried out on a Venusil XBP-C18(L)column(4.6 mm×100 mm,5 μm)with methanol and water solution(the pH value was adjusted to 3.0 by phosphoric acid)as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The column temperature was 20℃ and sample size was 20 μL.The detection wavelength was 303 nm.Results Linear regression equation of salicylic acid wasA=5.14×104C-1.06×104(r=0.999 9),and it was obtained in the range of 4.98～159.36 mg·L-1.The average recoveries were 98.0%,100.8%,and 100.5%.Conclusions The HPLC method shows a good separation,reproducibility and accuracy,which can be used to determine salicylic acid.

HPLC;Paint for onychomycosis;Salicylic acid

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.11.009

2016-08-04，

2016-09-23)