周 英，李 敏，孫黔云

(1.貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室藥理與生物活性研究中心，貴州 貴陽 550002;2.貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科，貴州 貴陽 550002)

綠原酸、咖啡酸和阿魏酸對補體旁路激活致內(nèi)皮細胞炎癥相關(guān)分子表達的干預

周 英1，李 敏2，孫黔云1

(1.貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室藥理與生物活性研究中心，貴州 貴陽 550002;2.貴州省人民醫(yī)院干醫(yī)科，貴州 貴陽 550002)

目的 研究綠原酸及其代謝產(chǎn)物咖啡酸和阿魏酸對補體旁路激活導致人微血管內(nèi)皮細胞炎癥反應相關(guān)分子表達的干預作用。方法 采用眼鏡蛇毒因子激活人血清補體旁路，將補體旁路激活產(chǎn)物作用于人微血管內(nèi)皮細胞，分別取不同時間點的細胞培養(yǎng)上清，采用ELISA方法檢測ICAM-1、IL-6、IL-8、t-PA、PAI-1的含量；采用不同濃度的綠原酸、咖啡酸、阿魏酸預處理內(nèi)皮細胞，然后將細胞暴露于補體旁路激活產(chǎn)物，檢測不同時間點細胞培養(yǎng)上清中ICAM-1、IL-6、IL-8、t-PA、PAI-1的含量變化。結(jié)果 補體旁路激活產(chǎn)物作用于人微血管內(nèi)皮細胞后，引起ICAM-1、IL-6、IL-8、t-PA、PAI-1的表達上調(diào)。50、100、250 μmol·L-1的綠原酸、咖啡酸、阿魏酸對ICAM-1、IL-6、IL-8、t-PA、PAI-1的上調(diào)表達均有干預作用，其中對ICAM-1和IL-8的干預作用最明顯?？Х人岜憩F(xiàn)出最好的干預作用，其次為阿魏酸。結(jié)論 一定濃度的綠原酸、咖啡酸、阿魏酸能有效抑制補體旁路激活引起的人微血管內(nèi)皮細胞表達ICAM-1、IL-6、IL-8、t-PA、PAI-1的上調(diào)，提示綠原酸、咖啡酸、阿魏酸對微血管內(nèi)皮細胞的炎癥反應有一定的干預作用。

補體；補體旁路激活；微血管內(nèi)皮細胞；炎癥反應；綠原酸；咖啡酸；阿魏酸

微血管內(nèi)皮細胞具有多種重要的生理功能，其功能失調(diào)和損傷在諸多病征中扮演了重要角色[1-2]。許多因素會導致內(nèi)皮細胞損傷，其中補體旁路的過度激活會引起微血管內(nèi)皮細胞的炎癥反應，上調(diào)黏附分子、炎癥介質(zhì)等表達，進而介導炎癥和組織損傷[3-5]。綠原酸是中藥民族藥中常見的成分，具有抗炎等多種活性，除本身具有藥理活性外，其代謝產(chǎn)物咖啡酸、阿魏酸也是其發(fā)揮藥理活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[6]。目前尚不清楚綠原酸及其代謝產(chǎn)物咖啡酸、阿魏酸對補體旁路激活導致的微血管內(nèi)皮細胞炎癥反應是否有干預作用。本文基于代謝組學角度研究了綠原酸及其代謝產(chǎn)物咖啡酸、阿魏酸對補體旁路激活引起的微血管內(nèi)皮細胞炎癥反應的干預作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人微血管內(nèi)皮細胞株(HMEC)由本實驗室傳代培養(yǎng)，RPMI 1640培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品，胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；人ICAM-1 (intracellular adhesion molecular-1)、 IL-6 (interleukin-6)、IL-8 (interleukin-8) ELISA檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；人t-PA(tissue plasminogen activator)、PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1)檢測試劑盒購自美國Assaypro公司；綠原酸(chlorogenic acid，CGA)、咖啡酸(caffeic acid，CA)、阿魏酸(ferulic acid，F(xiàn)A)購自美國Sigma公司；眼鏡蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)由本實驗室制備，其分離純化和檢測方法參照文獻[7]；正常人血清(normal human serum，NHS)由本實驗室健康志愿者獻血制備，混合血清分裝后于-80℃凍存，經(jīng)補體活性檢測，備用；滅活人血清(inactive normal human serum，INHS)由NHS于56 ℃水浴滅活30 min制備；其余試劑均為符合實驗要求的分析純。

1.2 主要儀器 Forma 3111 CO2培養(yǎng)箱和Revco超低溫冰箱(美國Thermo公司)；Nikon TS100倒置相差顯微鏡(日本Nikon公司)；Molecular Devices Spectra MAX-190連續(xù)波長酶標儀(美國MD公司)；5810R冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；Elix 純水系統(tǒng)和Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 人微血管內(nèi)皮細胞株HMEC由本實驗室傳代培養(yǎng)，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃，5% CO2和飽和濕度培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3.2 補體旁路激活產(chǎn)物的制備 參照文獻[7]方法，將CVF(6.5×104U·L-1)與NHS等比例混合，37℃水浴30 min，制備NHS的CVF激活產(chǎn)物(CVF-activated complement，CAC)。實驗同時制備CVF與INHS的混合孵育物作為對照。

1.3.3 CAC對HMEC表達黏附分子的影響 將HMEC以1×104cells·well-1接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄上清，加入140 μL無血清RPMI1640培養(yǎng)基，再加入60μL CAC至200 μL，分別取1、6、12、24 h孵育上清離心后，按照試劑盒說明書測定ICAM-1。實驗設(shè)置CVF與INHS的混合孵育物作為對照。

1.3.4 CAC對HMEC表達炎癥因子的影響 將HMEC以1×105cells·well-1接種于24孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄上清，后續(xù)操作同1.3.3，分別孵育12、24、48 h,取上清離心后，按試劑盒說明書步驟測定IL-6、IL-8。

1.3.5 CAC對HMEC表達纖溶相關(guān)蛋白分子的影響 將HMEC以1×104cells·well-1接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄上清，后續(xù)操作同1.3.3，取1、6、12、24 h上清離心后，按照試劑盒說明書測定t-PA、PAI-1。

1.3.6 CGA、CA和FA對CAC刺激HMEC表達ICAM-1、t-PA、PAI-1的影響 將HMEC以1×104cells·well-1接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄上清，加入不同濃度CGA、CA、FA的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基140 μL預處理細胞1 h，再加入60 μL CAC，孵育不同時間，取6h時間組的培養(yǎng)上清用于檢測ICAM-1，取12 h時間組的上清檢測t-PA和PAI-1。

1.3.7 CGA、CA和FA對CAC刺激HMEC表達IL-6、IL-8的影響 將HMEC以1×105cells·well-1，接種于24孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后棄上清，后續(xù)操作同1.3.6，孵育48 h取上清離心后測定IL-6、IL-8。

2 結(jié)果

2.1 CAC對HMEC表達黏附分子、炎癥介質(zhì)、纖溶功能分子的影響 CAC作用于HMEC后導致了ICAM-1的表達上調(diào)，在6 h時間點檢測到表達的高峰，與之前的結(jié)果類似[7]；IL-6濃度隨作用時間延長逐漸升高，在48 h時間點其濃度明顯升高(P<0.01)；而IL-8的濃度在24h時間點檢測到明顯的升高(P<0.05)，到48 h時，與對照組相比，其表達進一步上調(diào)(P<0.01)；纖溶功能分子t-PA、PAI-1的表達均持續(xù)上調(diào)(P<0.05或P<0.01)，其中在1h時間點的t-PA/PAI-1比值有一個明顯的上調(diào)，與之前的結(jié)果類似[8]。上述結(jié)果表明本研究成功復制了CAC誘導的HMEC炎癥反應模型。

2.2 CGA、CA和FA對HMEC表達黏附分子、炎癥介質(zhì)及纖溶功能分子的影響

2.2.1 CGA、CA和FA對HMEC表達ICAM-1的影響 結(jié)果顯示，50、100和250 μmol·L-1的CGA、CA和FA均能有效抑制ICAM-1的表達，與模型組相比差異有顯著性(P<0.05或P<0.01),Fig 1。

Fig 1 Effect of CGA, CA, and FA with different concentrations on ICAM-1 expression of HMEC induced by CAC for 6 h(n=3)

**P<0.01vscontrol；#P<0.05,##P<0.01vsmodel

2.2.2 CGA、CA和FA對HMEC表達IL-6的影響 結(jié)果表明，50、100和250 μmol·L-1的CGA、FA預處理內(nèi)皮細胞后，可降低IL-6的表達，其中250 μmol·L-1時，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，而不同濃度的CA對IL-6的表達均有明顯的抑制作用(P<0.01), 見Fig 2。

Fig 2 Effect of CGA, CA, and FA with different concentrations on IL-6 expression of HMEC induced by CAC for 48 h(n=3)

**P<0.01，*P<0.05vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vsmodel

2.2.3 CGA、CA和FA對HMEC表達IL-8的影響 結(jié)果表明，HMEC經(jīng)50、100和250 μmol·L-1的CGA、CA和FA預處理后，其IL-8的表達明顯下調(diào)，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，見Fig 3。

2.2.4 CGA、CA和FA對HMEC表達t-PA的影響 結(jié)果顯示，50、100和250 μmol·L-1的CGA、CA和FA對t-PA的表達有抑制作用，其中，CA的作用相對較明顯，見Fig 4。

Fig 3 Effect of CGA, CA, and FA with different concentrations on IL-8 expression of HMEC induced by CAC for 48 h(n=3)

**P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vsmodel

2.2.5 CGA、CA和FA對HMEC表達PAI-1的影響 不同濃度的CGA、CA和FA對PAI-1的表達均有抑制作用，其中，在50、100 μmol·L-1時，與模型組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，見Fig 5。3 討論

補體旁路途徑在機體天然防御系統(tǒng)中具有重要的生理功能，但在諸多病理情況下，補體旁路的過度 激活會引發(fā)炎癥和損傷，其中補體旁路激活誘導的微血管內(nèi)皮細胞炎癥反應在炎癥啟動和放大的環(huán)節(jié)中扮演了重要角色。CGA作為一種在食材和藥材中較為常見的多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化等多種藥理活性[6]。其代謝產(chǎn)物CA、FA等也是其發(fā)揮藥理活性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，本文從代謝組學的角度，研究了CGA、CA和FA對補體旁路激活誘導微血管內(nèi)皮細胞炎癥反應的干預作用，以期從新的角度認識和挖掘CGA及其代謝產(chǎn)物CA、FA的藥理藥效作用。

Fig 4 Effect of CGA, CA, and FA with different concentrations on t-PA expression of HMEC induced by CAC for 12 h(n=4)

*P<0.05，**P<0.01vscontrol，#P≤0.05vsmodel

Fig 5 Effect of CGA, CA, and FA with different concentrations on PAI-1 expression of HMEC induced by CAC for 12 h(n=4)

**P<0.01vscontrol，#P<0.05，##P<0.01vsmodel

CAC的刺激會導致HMEC出現(xiàn)活化和后續(xù)的炎癥反應[7-9]。在本研究中可以看到，HMEC受到CAC刺激后，ICAM-1、IL-6、IL-8、t-PA和PAI-1的表達均出現(xiàn)上調(diào)。其中，ICAM-1在6 h時達到峰值，IL-8和IL-6的上調(diào)分別在24h和48h檢測點出現(xiàn)明顯變化，而衡量纖溶功能的t-PA/PAI-1比值在1 h時有明顯上調(diào)。ICAM-1是介導中性粒細胞和內(nèi)皮細胞黏附、聚集、浸潤的重要黏附分子，IL-6和IL-8 則是重要的炎癥介質(zhì)，而t-PA和PAI-1以及t-PA/PAI-1比值的變化則與炎癥中的纖溶凝血功能異常密切相關(guān)。它們在炎癥的發(fā)展中扮演了重要角色。上述分子的表達上調(diào)提示了HMEC在受到CAC刺激后，出現(xiàn)了炎性反應狀態(tài)。

采用CGA、CA和FA對上述炎癥反應的干預實驗表明，50、100、250 μmol·L-1的CGA、CA、FA對ICAM-1、IL-6、IL-8、t-PA和PAI-1的上調(diào)表達具有不同程度的抑制作用。其中，CGA、CA、FA對ICAM-1和IL-8的抑制作用最為明顯。而綜合各指標來看，CA的干預作用最好，其次為FA。本研究表明了CGA、CA、FA對補體旁路激活導致的HMEC炎癥反應有一定的干預作用，而它們在干預作用上的差別則為進一步開展機制研究提供了線索和依據(jù)。CGA、CA、FA具有多樣的生物學活性，本研究的結(jié)果進一步豐富和拓展了對CGA、CA、FA藥理藥效作用的認識和理解。

本研究表明了天然活性分子綠原酸、咖啡酸和阿魏酸對補體旁路激活導致的微血管內(nèi)皮細胞炎癥反應有一定的干預作用，為進一步深入挖掘綠原酸、咖啡酸和阿魏酸的藥理藥效作用及調(diào)控機制提供了參考依據(jù)。

(致謝：本文實驗是在貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室藥理與生物活性研究中心孫黔云研究員實驗室完成。)

[1] Rajendran P, Rengarajan T, Thangavel J, et al. The vascular endothelium and human diseases[J].IntJBiolSci, 2013, 9(10)：1057-69.

[2] Ramli J, CalderonArtero P, Block RC, Mousa SA. Novel therapeutic targets for preserving a healthy endothelium: strategies for reducing the risk of vascular and cardiovascular disease[J].CardiolJ, 2011, 18(4): 352-63.

[3] 孫黔云. 眼鏡蛇毒因子在生命科學中的應用[J]. 生命科學, 2016, 28(1): 22-6.

[3] Sun Q Y. Application of cobra venom factor in life sciences[J].ChinBullLifeSci, 2016, 28(1): 22-6.

[4] Bosmann M, Ward PA. Role of C3, C5 and anaphylatoxin receptors in acute lung injury and in sepsis[J].AdvExpMedBiol, 2012, 946: 147-59.

[5] Takano T, Elimam H, Cybulsky AV. Complement-mediated cellular injury[J].SeminNephrol, 2013, 33(6): 586-601.

[6] Wu C, Luan H, Zhang X, et al. Chlorogenic acid protects against atherosclerosis in ApoE-/-mice and promotes cholesterol efflux from RAW264.7 macrophages [J].PLoSOne, 2014, 9(9): e95452.

[7] 孫黔云, 李 敏, 葉巧玲, 李紅玲. 補體旁路激活導致內(nèi)皮細胞的活化和損傷[J]. 中國藥理學通報, 2012, 28(7): 925-9.

[7] Sun Q Y, Li M, Ye Q L, Li H L. Endothelial cell activation and injury induced by complement alternative pathway[J].ChinPharmaBull, 2012, 28(7): 925-9.

[8] 路青瑜，李 敏，孫黔云. 補體旁路激活致內(nèi)皮細胞纖溶凝血相關(guān)分子表達變化及干預研究[J]. 中國藥理學通報, 2015, 31(8): 1142-6.

[8] Lu Q Y, Li M, Sun Q Y. Expression of coagulation-and fibrinolysis-related molecules of endothelial cells induced by activated complement alternative pathway and intervention[J].ChinPharmacolBull, 2015, 31(8): 1142-6.

[9] 李紅玲, 孫黔云,李 敏, 石京山. 補體旁路激活產(chǎn)物刺激內(nèi)皮細胞NF-κB、p38MAPK、JAK2通路活化及抑制劑的干預研究[J].中國細胞生物學學報,2013, 35(6): 836-41.

[9] Li H L, Sun Q Y, Li M, Shi J S. Activation of NF-κB, p38MAPK, and JAK2 in endothelial cells induced by activated complement alternative pathway and intervention by inhibitors[J].ChinJCellBiol, 2013, 35(6): 836-41.

Effect of chlorogenic acid, caffeic acid, and ferulic acid on inhibition of inflammatory response of HMECs induced by activated complement alternative pathway

ZHOU Ying1, Li Min2, SUN Qian-yun1

(1.CenterforPharmacologyandBioactivityResearch,theKeyLaboratoryofChemistryforNaturalProducts,GuizhouProvinceandChineseAcademyofSciences,Guiyang550002,China; 2.GeneralWard,GuizhouProvincialPeople’sHospital,Guiyang550002,China)

Aim To investigate the effect of chlorogenic acid, caffeic acid, and ferulic acid on expression of molecules related with inflammatory response of HMECs induced by activated complement alternative pathway. Methods CVF was used to activate the alternative pathway of serum complement. After exposure of HMECs to activate complement for various times, supernatant of cell culture was removed and assayed for content of ICAM-1, IL-6, IL-8, t-PA, and PAI-1 using ELISA kits. The expression of the above molecules induced by activated complement was measured after HMECs were pre-treated with 50, 100, 250 μmol·L-1of CGA, CA, and FA. Results After HMECs were exposed to the product of the activated complement alternative pathway, the expression of ICAM-1, IL-6, IL-8, t-PA, and PAI-1 was up-regulated. The expression of ICAM-1, IL-6, IL-8, t-PA, and PAI-1 was down-regulated by various concentrations of CGA, CA, and FA. ICAM-1 and IL-8 were inhibited most significantly in all molecules mentioned above. CA exhibited the best intervention effect, followed by FA. Conclusion Certain concentration of CGA, CA, and FA can inhibit the expression of ICAM-1, IL-6, IL-8, t-PA, and PAI-1 in HMECs induced by the activation of the alternative complement pathway, indicating that CGA, CA, and FA can inhibit inflammatory response of HMECs.

complement; activation of the complement alternative pathway; microvascular endothelial cells; inflammation; chlorogenic acid; caffeic acid; ferulic acid

時間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.034.html

2016-07-22,

2016-09-27

國家自然科學基金資助項目(No 81260494)；貴州省百層次創(chuàng)新型人才培養(yǎng)項目[No 黔科合人才(2016)4018號]；貴州省科技創(chuàng)新人才團隊項目[No 黔科合平臺人才(2016)5625號]

周 英(1989- )，女，碩士生，研究方向：天然藥物生理活性，E-mail：zy423083@163.com； 李 敏(1967-)，女，主任醫(yī)師，研究方向：微血管內(nèi)皮損傷及保護，通訊作者，E-mail：limin_67@hotmail.com; 孫黔云(1968- )，男，博士，研究員，碩士生導師，研究方向：心血管藥理與新藥發(fā)現(xiàn)，通訊作者，Tel：0851-83805095，F(xiàn)ax：0851-83805081，E-mail：sunqy@hotmail.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.017

A

1001-1978(2016)12-1723-06

R284.1；R322.12；R392.11；R392.12；R364.5