李雪珂，劉 秋，許治良，周 軍，曹 亮，丁 崗，王振中，蕭 偉1,

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000；2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司；3.中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001)

銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液通過(guò)抑制p38/p53通路保護(hù)氧糖剝奪SY5Y細(xì)胞的機(jī)制

李雪珂1,3，劉 秋2,3，許治良2,3，周 軍2,3，曹 亮2,3，丁 崗2,3，王振中2,3，蕭 偉1,2,3

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000；2. 江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司；3.中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001)

目的 探討銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液(diterpene ginkgolides meglumine injection, DGMI)對(duì)缺糖/缺氧損傷(oxygen-glucose deprivation，OGD)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SY5Y)保護(hù)的作用及可能的機(jī)制。方法 SY5Y細(xì)胞OGD損傷4 h后，予藥物復(fù)氧1 h，然后測(cè)定細(xì)胞存活率(CCK-8法)、凋亡壞死比率、線(xiàn)粒體膜電位(ΔΨm)；蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞中p-p38、p-p53、Bcl-2、Bax和cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白量的變化。結(jié)果 DGMI能明顯提高OGD損傷的SY5Y細(xì)胞的存活率，降低細(xì)胞凋亡比率，挽救下降的線(xiàn)粒體膜電位(ΔΨm)。下調(diào)p-p38、p-p53、Bax/Bcl-2、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3等蛋白量，抑制p38和p53活性，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。結(jié)論 DGMI對(duì)OGD損傷的SY5Y細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)p38/p53/Bcl-2/caspase-9/caspase-3 信號(hào)通路的抑制有關(guān)。

銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液；氧糖剝奪；細(xì)胞凋亡；p38； p53；Bax/Bcl-2

腦卒中俗稱(chēng)中風(fēng)，其中缺血性卒中約占85%，是危害人類(lèi)生存健康的高危疾病。缺血性卒中系由局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞缺血/缺氧性病變凋亡和壞死，進(jìn)而產(chǎn)生臨床上對(duì)應(yīng)的神經(jīng)功能缺失表現(xiàn)，因此保護(hù)腦缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)細(xì)胞是其治療的關(guān)鍵因素之一。銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液(diterpene ginkgolides meglumine injection, DGMI)是含銀杏內(nèi)酯B(GB，60%)、銀杏內(nèi)酯A(GA，35%)、銀杏內(nèi)酯K(GK，2%)、銀杏內(nèi)酯C(GC，2%)的5類(lèi)新藥，用于腦卒中的治療。研究表明，各單體除作為血小板活化因子(PAF)受體拮抗劑[1]外，還可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、線(xiàn)粒體凋亡和氧化應(yīng)激等[2-5]途徑保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)室已有研究表明，DGMI可通過(guò)激活PI3K/Akt和PKA通路，促進(jìn)Bad(Ser 136)和Bad(Ser 112)磷酸化，抑制氧糖剝奪SY5Y細(xì)胞線(xiàn)粒體途徑凋亡[6]。p38 MAPK是有絲分裂原激活蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK)的重要成員，激活后發(fā)生核轉(zhuǎn)位，對(duì)許多蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子具有磷酸化激活的作用，參與體內(nèi)多種過(guò)程，不僅在炎癥反應(yīng)中，也在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用[7-8]。p53是體內(nèi)的一種檢測(cè)基因組完整性，調(diào)控凋亡的蛋白，在腦缺血神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮重要作用，其活性受磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等翻譯修飾后調(diào)控，特別是Ser15位點(diǎn)磷酸化能抑制泛素化降解，增強(qiáng)其穩(wěn)定性活性。本研究選用人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SY5Y)缺糖/缺氧(oxygen-glucose deprivation，OGD)模型模擬缺血性腦卒中，研究DGMI對(duì)OGD損傷細(xì)胞凋亡的抑制作用及抑制p38/p53信號(hào)通路治療腦卒中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 SY5Y購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；青鏈霉素混合液購(gòu)自 Biotopped公司；胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自上海貝博公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；羅丹明123購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；p-p38(Thr 180/Tyr 182) antibody、p-p53(Ser 15) antibody、Bcl-2 antibody、cleaved caspase-3 antibody、GAPDH antibody、tublin antibody、HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司；Bax antibody、caspase-3 antibody購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；caspase-9 antibody購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；三氣培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)BINDER公司；微板檢測(cè)系統(tǒng)Flex Station 3購(gòu)自美國(guó)MD公司；ChemiDoc XRS系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio Rad公司；銀杏二萜內(nèi)酯葡胺注射液(DGMI)為江蘇康緣藥業(yè)生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)為141201；金納多注射液(JND)產(chǎn)品批號(hào)為H4040。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、OGD模型和給藥 SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，100 kU·L-1青霉素，100 mg·L-1鏈霉素)中，置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將SY5Y細(xì)胞接種至細(xì)胞板中培養(yǎng)24 h，以無(wú)糖RPMI 1640完全置換RPMI 1640培養(yǎng)基，置于三氣培養(yǎng)箱中，控制95% N2和5% CO2混合氣體條件，待氧氣濃度降為0.2%時(shí)計(jì)時(shí)，培養(yǎng)4 h后，取出細(xì)胞板置于含氧細(xì)胞培養(yǎng)箱中，給一定濃度DGMI和JND藥物，復(fù)氧1 h。然后進(jìn)行細(xì)胞活力、凋亡和相關(guān)激酶蛋白的測(cè)定。

1.2.2 細(xì)胞活力的測(cè)定 將SY5Y細(xì)胞以每孔2×104的密度接種至96孔板，OGD 4 h后加入終濃度為6.25、12.5、25、50 mg·L-1的DGMI，一起復(fù)氧1 h，采用CCK-8試劑盒，按說(shuō)明書(shū)每孔加入底物10 μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2.5 h后，于450 nm處測(cè)定各組吸光度值OD450 nm，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力。

1.2.3 Annexin V-FITC檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將SY5Y細(xì)胞以每孔5×105的密度接種至6孔板，OGD 4 h后加入終濃度為25 mg·L-1的藥物，一起復(fù)氧1 h，應(yīng)用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，參考說(shuō)明書(shū)，測(cè)定細(xì)胞凋亡比率。將細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一滅菌離心管內(nèi)，胰酶消化收集，合并液體，1 000×g離心5 min，棄上清，PBS重懸計(jì)數(shù)，取10萬(wàn)重懸細(xì)胞至1.5 mL離心管內(nèi)。1 000×g離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液，輕輕重懸，加入5 μL Annexin V-FITC，再加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min，隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。獲取散點(diǎn)圖后，調(diào)節(jié)四分象限，計(jì)算各組細(xì)胞凋亡比率。

1.2.4 羅丹明123染色 將SY5Y細(xì)胞以每孔2×104的密度接種至96孔板，OGD 4 h后加入終濃度為25 mg·L-1的藥物，一起復(fù)氧1 h，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加PBS洗滌1次，加入100 μL的Rhodamine123染色液，輕輕混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中避光孵育15 min，PBS洗滌2次，于熒光倒置顯微鏡下拍照觀(guān)察。1.2.5 Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì)水平 將SY5Y細(xì)胞以每孔5×106的密度接種于100 mm培養(yǎng)皿中，收集各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取總蛋白，應(yīng)用BCA法，測(cè)定蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜，封閉，加入1 ∶1 000稀釋的兔抗人的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，回溫2 h，TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(1 ∶1 500)溶液室溫 孵育2 h后洗滌膜，ECL法顯影，應(yīng)用ChemiDoc XRS系統(tǒng)拍照，采用Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行顯影條帶灰度值分析。

Fig 1 DGMI improves viabilities of

##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

A

B

DetectionerrorLateapoptoticanddeadcells/%Livingcells%Earlyapoptoticcells/%Control1.091.1196.301.50Model1.858.8265.3324.00DGMI0.172.0484.1313.66JND0.132.8074.7522.32

Fig 2 Effect of DGMI on OGD-induced apoptosis of SY5Y cells

A：Preventive effects of DGMI and JND on OGD-induced apoptosis. The cells were stained by Annexin V-FITC/PI and detected by flow cytometry.B：The diagram describes the percentage of cells in each quadrant.

2 結(jié)果

2.1 DGMI明顯提高OGD的SY5Y細(xì)胞的存活率 應(yīng)用CCK-8試劑盒測(cè)定不同給藥濃度的SY5Y細(xì)胞活力，結(jié)果顯示(Fig 1)，與Control組相比，OGD 4 h組細(xì)胞存活率降低至54.80%，DGMI終濃度為6.25、12.5、25、50 mg·L-1時(shí)，細(xì)胞活力分別升至65.18%、66.26%、71.57%和74.45%，且呈濃度依賴(lài)性，選取25 mg·L-1作為后續(xù)試驗(yàn)藥物濃度。

2.2 DGMI抑制OGD誘導(dǎo)的SY5Y細(xì)胞的凋亡 為了明確DGMI對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，本研究檢測(cè)了細(xì)胞凋亡比率和線(xiàn)粒體膜電位(ΔΨm)。Annexin V-FITC實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(Fig 2)，與對(duì)照組相比，SY5Y細(xì)胞OGD損傷后，細(xì)胞凋亡比率明顯升高至34.24%，復(fù)氧給藥DGMI后降至15.68%， JND組下降至24.26%。線(xiàn)粒體膜電位實(shí)驗(yàn)熒光結(jié)果顯示(Fig 3)，氧糖剝奪后細(xì)胞綠色熒光減弱，膜電位(ΔΨm)明顯下降，孵育藥物后熒光增強(qiáng)，膜電位(ΔΨm)升高。說(shuō)明DGMI能保護(hù)線(xiàn)粒體，抑制細(xì)胞凋亡。

Fig 3 Effect of DGMI on loss of MMP in SY5Y cells

A:Control;B:Model;C:DGMI;D:JND.The cells were stained by Rhodamine123 and photographed at 100×

2.3 DGMI抑制SY5Y細(xì)胞OGD激活的p38/p53活性 本研究檢測(cè)了DGMI對(duì)p38/p53通路信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。蛋白質(zhì)分析結(jié)果顯示(Fig 4)，缺糖/缺氧損傷后，與OGD組相比，DGMI組p38 (Thr 180/Tyr 182)和p53(Ser 15)磷酸化明顯下降(P<0.01)，抑制了SY5Y細(xì)胞中OGD誘導(dǎo)的p38/p53活性。

Fig 4 p-p38(Thr 180/Tyr 182) and p-p53(Ser 15) levels of OGD-induced SY5Y cells treated with ±s，n=3)

A:Protein levels of p-p38(Thr180/Tyr182) and p-p53(Ser15);B～C: The protein levels quantified by band gray value ration to GAPDH;B:p-p38, C:p-p53.##P<0.01vscontrol group.**P<0.01vsmodel group

2.4 DGMI降低OGD誘導(dǎo)的SY5Y細(xì)胞中的Bax/Bcl-2比率、caspase-9和caspase-3的活性 本研究檢測(cè)了DGMI對(duì)Bcl-2家族蛋白表達(dá)的影響。蛋白分析結(jié)果顯示(Fig 5, 6)，缺糖/缺氧損傷后，與OGD組相比，DGMI組Bax含量減少，Bcl-2含量增加，Bax/Bcl-2表達(dá)明顯下降(P<0.01)，procaspase- 3含量明顯下降(P<0.05)，活化caspase-9和caspase-3水平明顯下降(P<0.01)，可見(jiàn)其抑制了SY5Y細(xì)胞中OGD誘導(dǎo)的p53調(diào)控線(xiàn)粒體途徑的細(xì)胞凋亡。

Fig 5 Bax/Bcl-2 ratio of OGD-induced SY5Y cells treated with ±s,n=3)

A:Protein levels of Bcl-2 and Bax; B-D: The protein levels quantified by band gray value ration to β-tublin; B: Bcl-2;C:Bax; D:Bax/Bcl-2 ratio.#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsmodel group

3 討論

缺血性腦卒中是常見(jiàn)多發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，約占腦卒中的85%[9]，是世界范圍內(nèi)危害人類(lèi)健康的重要疾病之一，體外氧糖剝奪SY5Y細(xì)胞模擬這一病征，是研究缺血性腦卒中損傷機(jī)制及相關(guān)藥效機(jī)制的重要手段。本研究表明，缺血性卒中發(fā)生后，DGMI可濃度依賴(lài)性地提高OGD損傷SY5Y細(xì)胞活性，減少凋亡比率，且在抑制p38和p53磷酸活化方面，優(yōu)于含銀杏黃酮類(lèi)的JND。

大量研究結(jié)果表明，線(xiàn)粒體在腦缺血神經(jīng)元凋亡中起著十分重要的作用，被認(rèn)為是中樞調(diào)控者。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生缺血損傷時(shí)，至少有3種因素誘導(dǎo)線(xiàn)粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開(kāi)放：線(xiàn)粒體內(nèi)鈣離子超載、自由基對(duì)線(xiàn)粒體膜的氧化性損傷和產(chǎn)生的能量水平下降[10]。引起細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，與Adaf-1羧基端的WD-40重復(fù)序列結(jié)合，激活后者氨基末端的caspase募集區(qū)，剪切活化酶原caspase-9，再激活caspase-3引發(fā)凋亡[11]。除剪切活化外，腦缺血也可引起caspase-3 mRNA升高，增加表達(dá)[12]。在線(xiàn)粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔結(jié)構(gòu)改變中，Bcl-2、Bax等Bcl-2家族成員起著至關(guān)重要的作用[13-15]，兩者比例影響細(xì)胞受刺激后是否凋亡。當(dāng)Bax 高表達(dá)時(shí)，可形成Bax-Bax 同源二聚體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；當(dāng)Bcl-2 高表達(dá)時(shí)，可競(jìng)爭(zhēng)形成更穩(wěn)定的Bax-Bcl-2 異源二聚體，封閉Bax 形成孔道的活性，抑制細(xì)胞凋亡[16]。

p38/p53通路是機(jī)體內(nèi)調(diào)控凋亡的重要信號(hào)通路。研究報(bào)道活化的p38能促進(jìn)p53在Ser 15位磷酸化[17.18]，從而抑制p53泛素化降解，促進(jìn)其激活和積累。活化的p53可直接作用于Bax啟動(dòng)子，也可減少Bcl-2的mRNA含量，上調(diào)Bax/Bcl-2比率，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19-20]。由本研究結(jié)果看出，DGMI可抑制OGD損傷SY5Y細(xì)胞p38激酶磷酸化，降低p53的Ser 15位點(diǎn)活化，下調(diào)氧糖剝奪引起的Bax/Bcl-2升高，調(diào)控線(xiàn)粒體凋亡途徑促進(jìn)在氧糖剝 奪SY5Y細(xì)胞的存活?？梢?jiàn)，抑制p38/p53通路是DGMI抑制氧糖剝奪SY5Y細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。

A:Protein levels of cleaved caspase-9 and cleaved caspase-3;B～E:The protein levels quantified by band gray value ration to β-tublin;B:cleaved caspase-9; C:eleaved caspase-3;D:procaspase-3;E:cleaved caspase-3/procaspase-3.##P<0.01vscontrol group;*P<0.05,**P<0.01vsmodel group

(致謝: 本實(shí)驗(yàn)全部在江蘇康緣藥業(yè)藥理毒理所許治良老師課題組獨(dú)立完成，感謝我的導(dǎo)師蕭偉老師、許治良老師及劉秋研究員在實(shí)驗(yàn)思路設(shè)計(jì)上提出的建議和意見(jiàn)及實(shí)驗(yàn)技術(shù)上給予的指導(dǎo)！)

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Involvement of p38-p53 signal pathway in neuroprotective effects of DGMI on SH-SY5Y cells damaged by oxygen-glucose deprivation

LI Xue-ke1,2,LIU Qiu2,3,XU Zhi-liang2,3,ZHOU Jun2,3, CAO Liang2,3, DING Gang2,3,WANG Zhen-zhong2,3, XIAO Wei1,2,3

(1.NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210000,China;2.JiangsuKanionPharmaceuticalCo.Ltd,LianyungangJiangsu222001,China;3.StateKeyLaboratoryofNew-techforChineseMedicinePharmaceuticalProcess,LianyungangJiangsu222001,China)

Aim To investigate the protective effects of Diterpene Ginkgolides Meglumine Injection(DGMI) on SY5Y cells damaged by oxygen-glucose deprivation and its functional mechanisms.Methods After 4 h of OGD, the cells were treated with 25 mg·L-1drugs for 1 h. Subsequently, cell viabilities were measured by cell counting kit-8(CCK-8 kit) and cell apoptosis was measured by flow cytometric analysis. Furthermore, the mitochondrial membrane potential was detected by rhodamine123 staining. The levels of phospho-p38， phospho-p53， Bcl-2， Bax and cleaved caspase-9/3 were evaluated by western blot.Results DGMI significantly increased the cell viabilities of SY5Y cells damaged by OGD, and reduced OGD-elicited dissipation of mitochondrial membrane potential and cell apoptosis. Furthermore, DGMI also reduced p-p38,p-p53,Bax/Bcl-2 ratio,cleaved caspase-9 and cleaved caspase-3.Conclusion DGMI shows good neuroprotective effects on SY5Y cells after oxygen-glucose deprivation. The underlying mechanisms may be associated with the suppression of p38/p53/Bcl-2 /caspase-9/caspase-3 signaling pathway.

DGMI; oxygen-glucose deprivation; apoptosis; p38; p53; Bax/Bcl-2

時(shí)間：2016-12-5 15:14

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161205.1514.026.html

2016-07-22,

2016-08-29

國(guó)家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)資助項(xiàng)目(No 2013ZX09402203)

李雪珂(1993-)，女，碩士生，研究方向：藥物分子藥理學(xué)，E-mail: xkl9347@163.com； 蕭 偉(1959-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥新劑型的研究與開(kāi)發(fā)，通訊作者，E-mail: wzhzh-nj@163.net

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.12.013

A

1001-1978(2016)12-1699-06

R282.71；R329.25；R341；R743.31；R845.22