高娜，亢澤峰

人參皂苷對低氧誘導(dǎo)ARPE-19細胞表達VEGF的影響

高娜1，亢澤峰2

目的探討人參皂苷對低氧誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細胞（ARPE-19）表達血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的影響。方法體外培養(yǎng)ARPE-19細胞，分為正常組，缺氧模型組，人參皂苷組，并設(shè)立不同濃度及不同時間組。CCK-8法檢測不同時間、不同濃度的人參皂苷對細胞毒性、增殖的影響；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測各組細胞中VEGF的表達。結(jié)果缺氧模型組與正常組比較，ARPE-19細胞的增殖及VEGF的表達高于正常組，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；缺氧后人參皂苷組與模型組比較，ARPE-19細胞的增殖及VEGF的表達低于模型組，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論人參皂苷可抑制缺氧損傷后ARPE-19細胞的增殖及VEGF的表達。

人參皂苷；視網(wǎng)膜色素上皮細胞；細胞增殖；血管內(nèi)皮生長因子

脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）形成過程具有復(fù)雜的病理生理機制，其發(fā)病機制尚不明確。研究表明人類疾病和動物模型的CNV細胞成分主要由RPE細胞、血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞等組成，其中RPE細胞由視網(wǎng)膜外層RPE增殖移行而來，在CNV形成的不同階段，起著不同的作用。在新生血管形成的起始期和活動期缺血缺氧、氧化應(yīng)激、衰老等因素可誘發(fā)RPE細胞分泌VEGF及其他促血管生長因子，進而促進內(nèi)皮細胞的活化、增生和移行，從而誘發(fā)CNV?？梢钥闯?，在CNV的各個階段中，RPE細胞及血管內(nèi)皮細胞都是病變的中心環(huán)節(jié)之一〔1〕。本實驗通過人視網(wǎng)膜色素上皮細胞（ARPE-19）缺氧細胞模型，觀察人參皂苷Rg3對低氧誘導(dǎo)后ARPE-19細胞的增殖及VEGF表達的影響，為臨床治療CNV提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物與主要試劑及儀器

人視網(wǎng)膜色素上皮細胞（ARPE-19細胞株，購自廣州吉妮歐生物科技有限公司，批號：ATCCCRL-2302）。人參皂苷Rg3（上海歷鼎生物技術(shù)有限公司，批號：130725，20 mg/支，標準品，純度≥98%）。MEM培養(yǎng)液（Hyclon公司）；胎牛血清（GIB鄄CO公司）；CoCl2（北京化工公司）；細胞增殖-細胞毒性檢測試劑盒cck-8（日本同仁化學(xué)研究所）；VEGF（h）ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）等。熒光倒置顯微鏡（Olympus，IX81）；5%CO2培養(yǎng)箱（Thermo electron corporation）；全自動酶標儀（Katyo）；離心機（Germany）等。

1.2細胞培養(yǎng)及分組

ARPE-19細胞培養(yǎng)方法：ARPE-19細胞按常規(guī)細胞培養(yǎng)法培養(yǎng)，取對數(shù)生長期良好的細胞用于實驗。實驗分為：正常組，缺氧模型組，人參皂苷組，并設(shè)立不同濃度及24、48、72 h三個時間組。

1.3CCK-8法檢測不同濃度的人參皂苷Rg3對細胞毒性的影響

取對數(shù)生長期良好的第8代細胞，0.25%胰酶消化并用臺盼藍染色計數(shù)，用含15%胎牛血清（FBS）的MEM制成3×104/mL的細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μL，分為正常組，不同濃度（25、50、100、200、400mg/L）人參皂苷Rg3組，置37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后棄培養(yǎng)液，加入不含胎牛血清的MEM繼續(xù)培養(yǎng)12 h，再次棄培養(yǎng)液，根據(jù)分組不同，分別加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)液。正常組每孔加入不含F(xiàn)BS的MEM培養(yǎng)液100μL，人參皂苷Rg3組按終濃度為25、50、100、200、400 mg/L加入，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，每孔100 μl，在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，各組分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，CCK-8每孔加入20 μL，繼續(xù)孵育4 h后置酶標儀上，測各孔450 nm光密度（OD）值。實驗重復(fù)3次。

1.4缺氧細胞模型的建立

在前期細胞實驗中已成功建立缺氧細胞模型，本實驗缺氧模型組均按CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)缺氧，濃度同前采用100 μmol/L CoCl2進行實驗〔2〕。

1.5CCK8法檢測CoCl2誘導(dǎo)后各組細胞增殖活性

接種細胞同前，分為正常組、缺氧模型組（100μmol/L）、人參皂苷組（50、100、200 mg/L）。37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后棄培養(yǎng)液，加入不含胎牛血清的MEM繼續(xù)培養(yǎng)12 h，再次棄培養(yǎng)液，根據(jù)分組不同，分別加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)液。正常組每孔加入不含F(xiàn)BS的MEM培養(yǎng)液100μL，缺氧模型組加入含100μmol/L的CoCl2培養(yǎng)液100μL，藥物組分別加入100 μmol/L濃度的CoCl2和各組不同藥物濃度的混合培養(yǎng)液100 μL。在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，各組分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入CCK-8 20 μL，繼續(xù)孵育4 h后置酶標儀上，測各孔450nm光密度（OD）值。實驗重復(fù)3次。

1.6ELISA法檢測培養(yǎng)液中VEGF的表達

取對數(shù)生長期良好的第8代細胞，0.25%胰酶消化并用臺盼藍染色計數(shù)，用含15%胎牛血清的MEM制成5×104/mL的細胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL，每組設(shè)5個復(fù)孔。分為正常組，缺氧模型組（100μmol/L），人參皂苷組（100mg/L、200mg/L）。細胞的培養(yǎng)、加藥方法同增殖實驗，收集細胞培養(yǎng)液上清于離心管內(nèi)，樣品檢測前存儲于-80℃?zhèn)溆?。按照人VEGF ELISA檢測試劑盒的說明進行操作。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1CCK-8法檢測不同濃度各組藥物對細胞毒性的影響

25、50、100、200、400 mg/L濃度的人參皂苷各組不同時間（24 h、48 h、72 h）的光密度（OD）值與正常組比較（表1），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 不同濃度人參皂苷對ARPE-19細胞毒性的影響（x±s）

2.2CCK8法檢測各組細胞的增殖能力

缺氧模型組（100 μoml/L CoCl2）24、48、72h光密度（OD）值與同時間正常組比較，均高于正常組（P＜0.05）；人參皂苷100、200 mg/L濃度組24、48、72 h光密度（OD）值與模型組比較，低于模型組（P＜0.05）；人參皂苷組50mg/L濃度組24、48、72 h光密度（OD）值與模型組比較，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

表2 人參皂苷對缺氧誘導(dǎo)的ARPE-19細胞增殖能力的影響

表2 人參皂苷對缺氧誘導(dǎo)的ARPE-19細胞增殖能力的影響

注：a與正常組比較P＜0.05；b與模型組比較P＜0.05。統(tǒng)計學(xué)方法：單因素方差分析。ARPE-19：人視網(wǎng)膜色素上皮細胞

組別樣本量OD值（24h）OD值（48h）OD值（72h）正常組模型組50 mg/L 100 mg/L 200 mg/L F值P值55555 0.924±0.115 1.403±0.245a1.321±0.151 0.981±0.050b1.190±0.184b14.867 0.000 1.060±0.213 1.498±0.015a1.346±0.249 1.042±0.260b1.181±0.184b4.494 0.009 1.146±0.109 1.657±0.139a1.513±0.092 1.323±0.093b1.370±0.041b18.591 0.000

2.3ELISA法檢測培養(yǎng)液中VEGF的表達

缺氧模型組VEGF的表達與正常組比較，24h、48h、72h光密度值（OD）顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；人參皂苷組（100、200 mg/L）24 h、48h、72hVEGF表達的光密度值（OD）與模型組比較，顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與正常組比較，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表3）

表3 ARPE-19細胞培養(yǎng)液上清中VEGF的含量（x±s，pg/ml）

3 討論

人參味甘微寒，具有大補元氣、復(fù)脈固脫、補脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智明目之功效。最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為五加科珍貴中藥材，有“百草之王”的美譽?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，人參皂苷和人參多糖是人參的主要藥效成分，特別是皂苷研究比較深入，其在調(diào)節(jié)免疫功能、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、改善心腦血管疾病、抗壓抗疲勞、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等方面有著很好的功效，具有廣闊的應(yīng)用前景〔3-4〕。

人參皂苷Rg3是從人參中提取出來的單體皂苷，屬原人參二醇型皂苷，存在兩種同分異構(gòu)體，作用機制具有多靶點、多環(huán)節(jié)、多效應(yīng)的特點。大量研究表明，其可作用于腫瘤發(fā)生、發(fā)展的多個環(huán)節(jié)。目前國內(nèi)外研究集中在抑制腫瘤細胞增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移、抑制新生血管生成、促進腫瘤細胞凋亡、影響腫瘤細胞信號傳導(dǎo)相關(guān)基因的表達和增強免疫能力等方面。人參皂苷Rg3無細胞毒作用，但具有明顯的抗大腸癌、肺癌和卵巢癌等多種腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用〔5-6〕。體內(nèi)外實驗已證實Rg3可通過抑制PI3K活性，抑制AKT的表達及HIF-1的活化，特別是能抑制VEGF和堿性成纖維因子的產(chǎn)生與表達，抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖及遷移能力，直接影響到血管生成，進而抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移〔7-8〕。研究表明人參皂苷Rg3還可以通過減少VEGF的表達而抑制角膜和視網(wǎng)膜新生血管的形成〔9-10〕。但對于脈絡(luò)膜新生血管形成的作用迄今尚未見研究報告。

眼科臨床使用的各種抗VEGF或作用于VEGF信號通路中不同環(huán)節(jié)的藥物，可抑制VEGF產(chǎn)生或與受體結(jié)合發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，從而抑制新生血管生長及血管滲漏，達到改善患者視力的目的〔11-12〕。本實驗通過體外培養(yǎng)ARPE-19細胞，采用CoCl2制造缺氧模型，觀察ARPE-19缺氧后細胞的增殖及VEGF的表達。在細胞增殖方面：缺氧模型組（100 μoml/L CoCl2）24、48、72 h光密度值（OD）與同時間正常組比較，高于正常組（P＜0.05）；人參皂苷100、200 mg/L濃度組24、48、72 h光密度（OD）值與模型組比較，低于模型組（P＜0.05）；而人參皂苷50 mg/L濃度組各時間點的光密度（OD）值與模型組比較，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；說明100、200 mg/L濃度的人參皂苷Rg3可抑制細胞的增殖，而低濃度的人參皂苷Rg3則達不到此作用。同樣在VEGF表達的實驗結(jié)果中顯示，缺氧模型組VEGF的表達與正常組比較，各時間點光密度值（OD）顯著高于正常組（P＜0.05）；人參皂苷組（100、200 mg/L）各時間點VEGF表達的光密度值（OD）與模型組比較，顯著低于模型組（P＜0.05）；與正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明濃度為100、200 mg/L的人參皂苷Rg3可抑制細胞中VEGF的表達。

本實驗初步探討了人參皂苷Rg3對細胞的增殖及VEGF表達的影響，為下一步的研究奠定了基礎(chǔ)，我們將進一步深入探討人參皂苷Rg3是如何調(diào)控VEGF的表達從而達到抑制CNV形成的。

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Effects of Ginseng Saponin on expression of VEGF in hypoxia induced ARPE-19 cells

GAO Na，KANG Zefeng.Xining No.2 People's Hospital，Xining 810003，China

OBJECTIVETo explore the effects of ginseng saponin on expression of VEGF in hypoxia induced ARPE-19 cells.METHODSThe ARPE-19 cells cultured in vitro were randomly divided into the normal control group，hypoxic model group and ginseng saponin groups.Ginseng saponin groups contained different concentration and duration subgroups.Effects of cytotoxicity and proliferation of ARPE-19 cells under various concentration and duration of ginseng saponin were detected by CCK-8 method，and the effect on VEGF expression was measured by ELISA.RESULTSBoth cell proliferation and VEGF expression of hypoxic model group were higher than normal control group，the difference between them had statistical significance（P＜0.05）.The cell proliferation and VEGF expression of every ginseng saponin group was lower than hypoxic model group.The differences had statistical sig鄄nificance（P＜0.05）.CONCLUSIONSGinseng saponin could inhibit the ARPE-19 cells proliferation and VEGF expression in hypoxic environment.

ginseng saponin；retinal pigment epithelium；cell proliferation；VEGF

R285.5

：A

：1002-4379（2016）05-0291-04

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2016.05.004

國家自然科學(xué)基金面上項目（81574032）

1青海省西寧市第二人民醫(yī)院眼科，西寧810003 2中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院，北京100040

亢澤峰，E-mail：zefeng2531@163.com