李 博，姚曉陽(yáng)

（上海第七人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200137）

血漿同型半胱氨酸水平及其代謝酶基因多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性研究

李 博，姚曉陽(yáng)

（上海第七人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200137）

目的通過(guò)探討同型半胱氨酸（homocysteinemia，Hcy）及其主要代謝酶突變基因與腦梗死的關(guān)系，明確遺傳因素與腦梗死發(fā)病的關(guān)聯(lián)性，為指導(dǎo)臨床提供理論依據(jù)。方法選擇腦梗死患者與正常健康者各60例分別為腦梗死組、正常對(duì)照組。采用高效液相色譜法（high-performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定血漿 Hcy水平，并應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)分析技術(shù)（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）測(cè)定基因表型。結(jié)果正常對(duì)照組與腦梗死組比較，Hcy水平明顯偏高（P＜0.01），患者組有無(wú)高血壓病史、高血脂病史、糖尿病病史，Hcy水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）。腦梗死組亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetralydrofolate，MTHFR）基因TT基因型與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），T等位基因頻率明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01）。MTHFR C677T基因型和等位基因頻率分布與正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。MTHFR基因C677T純合子基因型Hcy水平顯著高于野生型（P＜0.01）。絲氨酸在胱硫醚 β合成酶（cystathionineβ-synthase，CBS）基因 T27796C純合子基因型血漿 Hcy水平與雜合子基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），顯著高于野生型（P＜0.01）。Logistic回歸分析腦梗死血漿 Hcy水平和 MTHFR C677T純合子基因型關(guān)系密切。結(jié)論Hcy水平與腦梗死的發(fā)病有一定關(guān)聯(lián)性，可能是該病發(fā)生的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。MTHFR基因 C677T位點(diǎn)純合子突變、CBS基因T27796C位點(diǎn)純合子突變均可致血漿 Hcy水平增高，可能是腦梗死發(fā)生的遺傳因素。

腦梗死； 同型半胱氨酸； 基因多態(tài)性； 遺傳

腦梗死是一種臨床常見(jiàn)的腦血管疾病，目前已給中老年人的生命健康帶來(lái)嚴(yán)重的威脅，動(dòng)脈粥樣硬化是腦梗死發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)與蛋白質(zhì)代謝紊亂等都參與到動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，其中血漿 Hcy水平增高已被認(rèn)為是心腦血管疾病發(fā)生的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，目前已越來(lái)越受到廣大學(xué)者的廣泛關(guān)注。Hcy主要代謝酶不同基因可以通過(guò)影響酶活性來(lái)影響血漿 Hcy水平。本次臨床研究主要選擇 Hcy主要基因突變位點(diǎn)為研究對(duì)象，來(lái)觀察遺傳因素對(duì) Hcy水平的影響，及血漿Hcy基因多態(tài)性與腦梗死的關(guān)系［1-5］。

材料和方法

1 病例采集

2015年 1月至 2016年 6月入住我院的腦梗死患者60例，其中男41例，女19例，年齡 38～72歲，平均年齡49±12歲；選取同期到本院作體檢的健康者60例作正常對(duì)照組，男37例，女23例，年齡35～69歲，平均年齡47±16歲。兩組年齡、性別之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01），具有可比性。

2 病例采集標(biāo)準(zhǔn)

①急性腦梗死患者，起病 1周內(nèi)就診；②據(jù)全國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議制訂的腦梗死診斷要點(diǎn)，頭顱 CT／MRI診斷為腦梗死；③除外惡性腫瘤、肝腎疾病、甲狀腺功能減退、惡性貧血、藥物影響等。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 血漿總 Hcy水平測(cè)定 空腹 12h，取外周血3mL，加入到含0.5mL2%EDTA抗凝劑的試管中，3000r／min離心10min，取血漿，采用高壓液相色譜分析法測(cè)定血漿 Hcy水平。

3.2 基因分析 ①標(biāo)本采集：EDTA抗凝，提取DNA；②聚合酶鏈反應(yīng)（PCR），Taq酶1 U，具體如下［6-7］：MTH FR C677T引 物 序 列：上游 引 物：′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′；下游引物：5′-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′；CBST27796C引物序列：上游引物：5′-ACAATCAGCGGCATT TAGTA-3′；下游引物：5′-ACAGAGACACAAAGTCGA TC-3′；MSA2756G引物序列：上游引物：5′-CA TGGAAGAA TATGAAGATATTAGAC-3；下游引物：5′-GAACTAGA AGACAGAAATTCTCTA-3′；PCR反應(yīng)體系為25μL，反應(yīng)條件：MT HFR：93℃變性 46s，62℃退火 46s，72℃延伸 50s；CBS：94℃變性 45s，55℃退火 45s，72℃延伸90s；MS：94℃變性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，均為40個(gè)循環(huán)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 腦梗死組與正常對(duì)照組血漿Hcy水平

腦梗死組血漿Hcy水平與正常對(duì)照組比較，明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 血漿總 Hcy水平比較結(jié)果（±s）

表1 血漿總 Hcy水平比較結(jié)果（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01

組別 例數(shù) 血漿總Hcy水平（μmol／L） P值＜0.01正常對(duì)照組腦梗死組 60 22.0±5.8*60 12.0±1.7

2 有無(wú)高血壓病史對(duì)血漿總Hcy水平的影響

有高血壓病史患者組與無(wú)高血壓病史患者組血漿總 Hcy水平比較，差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01），具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 有無(wú)高血壓病史對(duì)血漿總 Hcy水平的影響

3 有無(wú)高血脂病史對(duì)血漿Hcy水平的影響

有高血脂病史患者組與無(wú)高血脂病史患者組血漿總 Hcy水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 有無(wú)高血脂病史對(duì)血漿總 Hcy水平的影響

4 有無(wú)糖尿病病史對(duì)血漿Hcy水平的影響

有糖尿病病史患者組與無(wú)糖尿病病史患者組血漿總 Hcy水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01），具體結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 有無(wú)高血糖病史對(duì)血漿總 Hcy水平的影響

5 各組基因型及等位基因頻率分布

MTHFR、CBS和MS基因具體類型如表5～7，基因型頻率分布符合 Hardy-Weinberg平衡。MTHFR C677T基因型間 Hcy水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），TT（23±12）μmol／L與 CC（16±4）μmol／L血漿Hcy水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），CT（13±2）μmol／L與CC（13±3）μmol／L血漿Hcy水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01），CT與TT間血漿 Hcy水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）。CBS T27796C各基因型血漿Hcy水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），CC（23±11）μmol／L與 TC（15±6）μmol／L血漿 Hcy水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），CC與 TT（15±5）μmol／L血漿Hcy水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），TC與 TT血漿 Hcy水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）。MS A2756G各基因型血漿Hcy水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01），AG（17±5）μmol／L與 AA（16±4）μmol／L血漿 Hcy水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）。

各組MTHFR、CBS和MS基因及等位基因頻率分布見(jiàn)表5～7。腦梗死組 CC、CT和 TT基因型頻率分別為10%、35%、55%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。腦梗死組T等位基因頻率（61%）也顯著高于對(duì)照組（29%）（P＜0.01）。CBS與 MS腦梗死組與正常對(duì)照組之間基因型的頻率分布，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。等位基因頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）。

表5 MTHFR基因型及等位基因頻率分布（%）

表6 CBS基因型及等位基因頻率分布（%）

表7 基因型 MS及等位基因頻率分布（%）

討 論

腦梗死是由多因素引起的疾病，高血壓、高血脂、糖尿病等與其發(fā)生有著密切的關(guān)聯(lián)，有研究發(fā)現(xiàn)高Hcy水平與動(dòng)脈粥樣硬化以及腦梗死的發(fā)生均關(guān)系密切，是重要的危險(xiǎn)因素之一。Hcy能誘發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，使血管平滑肌細(xì)胞增生、遷移，進(jìn)而使血小板粘附和聚集，激活血液調(diào)節(jié)因子、凝血因子，并可使機(jī)體纖溶活性下降，促進(jìn)氧化低密度脂蛋白的形成，最終促使脂質(zhì)沉積于動(dòng)脈壁等［9］。

Hcy在體內(nèi)的代謝途徑主要有兩條，一條經(jīng)胱硫醚縮合酶作用于絲氨酸縮合為胱硫醚，這條途徑需要維生素 B6作為輔因子；第二條是經(jīng)甲硫氨酸合成酶催化再甲基化為甲硫氨酸，這條途徑需要維生素B12作為輔因子［10］。高 Hcy血癥主要是代謝障礙所致，主要涉及遺傳的關(guān)鍵酶 MTHFR、CBS和 MS基因突變和環(huán)境營(yíng)養(yǎng)即葉酸、維生素 B6、B12缺乏。

同型半胱氨酸水平在不同地域、不同人種間有所差異［11］，本研究是對(duì)上海第七人民醫(yī)院 2015年 1月至2016年6月入住我院神經(jīng)內(nèi)科的腦梗死患者60例和健康體檢者60例作為相關(guān)研究對(duì)象，腦梗死組Hcy水平顯著高于正常對(duì)照組（P＜0.01），患者組有無(wú)高血壓病史、高血脂病史、糖尿病病史對(duì)Hcy水平無(wú)顯著影響（P＞0.01）。研究結(jié)果表明血漿Hcy水平與腦梗死的發(fā)病有一定關(guān)聯(lián)性，可能是該病發(fā)生的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。MTHFR基因C677T位點(diǎn)純合子突變、CBS基因 T27796C位點(diǎn)純合子突變均可致血漿Hcy水平增高，可能是腦梗死發(fā)生的遺傳因素。本次研究由于樣本量有限缺乏一定的說(shuō)服力，但對(duì)指導(dǎo)臨床及科學(xué)研究具有一定的指導(dǎo)作用。

［1］陳健，張金枝，程龍獻(xiàn).高同型半胱氨酸血癥：心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子.心血管病學(xué)學(xué)進(jìn)展，2000，21（2）：75-78.

［2］李保華，毛利忠，王克義，等.腦梗死與高同型半胱氨酸血癥的相關(guān)性研究.中國(guó)實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2006，9（1）：8-10.

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（潘子昂編輯）

Correlation of Plasma Homocysteine Levels and Metabolic Enzyme Gene Polymorphisms with Cerebral Infarction

LI Bo，YAO Xiao-yang
（Clinical Laboratory Shanghai Seventh People′s Hospital，Shanghai 200137，China）

ObjectiveTo explore the relationship between the Hcy and its main metabolic enzymes and cerebral infarction，to clarify the association between genetic factors and cerebral infarction in order to provide theoretical basis for clinical guidance.MethodsWe enrolled 60 patients with cerebral infarction and normal patients as cerebral infarction group and normal control group.Plasma Hcy levels were determined by HPLC，and the gene phenotype was determined by PCR-RFLP.ResultsHcy level was significantly higher（P＜0.01）.There were no significant differences when compared history of hypertension，hyperlipidemia and diabetes mellitus（P＞0.01）between two groups.MTHFR genotype of TT gene in the cerebral infarction group was significantly different（P＜0.01）when compared with the control group.The frequency of T allele was significantly higher than that of the control group（P＜0.01）.There were significant differences in the frequency distribution of C677T MTHFR genotype and allele（P＜0.01）.The level of C677T homozygous genotype MTHFR in Hcy gene was significantly higher than that in wild type（P＜0.01）.There was a significant difference on plasma Hcy levels between CBS gene T27796C homozygous genotype and heterozygous genotype（P＜0.01），which was significantly higher than that of wild type（P＜0.01）.Logistic regression analysis showed a close relationship between plasma Hcy levels and C677T MTHFR homozygous genotype in patients with cerebral infarction.ConclusionThe level of Hcy is related to theincidence of cerebral infarction，which may be an independent risk factor for the occurrence of cerebral infarction.Homozygous mutations of MTHFR C677T locus and T27796C mutation in CBS gene may lead to increased plasma CY H level，which may be a genetic factor in the occurrence of cerebral infarction.

Cerebral infarction； Homocysteine； Gene polymorphism； Inheritance

10.11748／bjmy.issn.1006-1703.2016.12.017

2016-09-27；

2016-10-25