楊志明

（邯鄲市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 邯鄲 056000）

丙型肝炎病毒基因型分布及 HLA-Cw基因多態(tài)性的關(guān)聯(lián)性分析

楊志明

（邯鄲市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 邯鄲 056000）

目的對(duì)邯鄲不同 HCV基因型的分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)合 HLA-Cw的基因多態(tài)性，分析 HCV與 HLA-Cw的關(guān)聯(lián)性。方法采用熒光 PCR法進(jìn)行 HCV基因分型檢測(cè)，計(jì)算不同 HCV基因型的陽(yáng)性率，從而對(duì)該地區(qū)的丙肝病毒感染者進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查；采用病例-對(duì)照研究，對(duì)所有研究對(duì)象的基因組進(jìn)行HLA基因分型，統(tǒng)計(jì)HCV感染者和健康對(duì)照者之間 HLA-Cw基因頻率的差異和關(guān)聯(lián)度；對(duì)所有丙型肝炎病毒感染者，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析 HLA基因型別和血清中 HCVRNA的基因型別的關(guān)聯(lián)性，從而尋找與不同HCV基因型感染相關(guān)的 HLA-Cw基因型。結(jié)果邯鄲 HCV 1b亞型在人群中的分布最多，其次為混合型1b／2型；HLA-Cw*8與HCV的慢性感染有關(guān)，而其他7個(gè)基因位點(diǎn)經(jīng)研究關(guān)聯(lián)不大，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HLA-Cw*8基因與 HCV 1b亞型的易感性密切相關(guān)。結(jié)論HLA-Cw基因與HCV感染密切相關(guān)，可進(jìn)行易感人群分析，為控制 HCV的傳播提供可參考的理論依據(jù)。

丙型肝炎病毒； 基因分型； HLA-Cw； 多態(tài)性分析； 易感性分析

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染可引起丙型肝炎，可通過(guò)多種途徑進(jìn)行傳播，主要經(jīng)血液傳播，在全球范圍廣泛流行［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，全球近2億人口感染 HCV［2］；在中國(guó)，自然人群中的感染率約為0.9%～5.1%，且呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，而丙型肝炎慢性化率高達(dá)75%～85%，對(duì)人類的健康和生命造成極大的威脅［3］。HCV屬于單股正鏈 RNA病毒，具有極強(qiáng)的變異性，這種變異特性導(dǎo)致了HCV基因型在全球范圍內(nèi)呈區(qū)域性分布。而 HCV的不同基因型又與其感染者臨床癥狀的嚴(yán)重程度、疾病的轉(zhuǎn)歸、傳播途徑、地區(qū)分布情況等具有相關(guān)性［4］。

HCV的感染，往往體液免疫的抵抗作用較小，而CD4＋T淋巴細(xì)胞反應(yīng)起至關(guān)重要的作用［5-6］。人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）I類抗原是 由 人類 主 要 組 織 相容性復(fù) 合 體 （major histocompatibility complex，MHC）中 I類基因編碼的HLA蛋白分子，其主要功能是將外源性抗原肽遞呈給 CD4＋T淋巴細(xì)胞，在機(jī)體的免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵性的免疫識(shí)別和調(diào)節(jié)作用。HLA-Cw為HLA I類抗原中非常重要的一個(gè)分支型，大量研究集中在其各等位基因多態(tài)性與其他相似病毒感染的相關(guān)性上，提示其與 HCV病毒感染具有關(guān)聯(lián)性。

本研究首先采用病例-對(duì)照方法對(duì)邯鄲不同丙型肝炎病毒基因型的分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)合 HLACw的基因多態(tài)性，分析HCV與HLA-Cw的關(guān)聯(lián)性。

材料和方法

1 研究對(duì)象

選取邯鄲健康人群 160例（均為漢族、年齡48.2±13.1歲、男性75例、女性85例）、慢性 HCV感染患者327例（均為漢族、年齡 52.5±16.3歲、男性158例、女性 169例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～80歲，與組內(nèi)其他成員無(wú)血緣關(guān)系，無(wú)已知嚴(yán)重遺傳疾病，一個(gè)月內(nèi)未經(jīng)輸血治療且知情同意。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后入組調(diào)查。

感染者及健康對(duì)照清晨空腹時(shí)取外周血 5mL，制備血清進(jìn)行后續(xù)研究。

2 丙型肝炎病毒（HCV）基因型分布

首先，提取各感染者樣本的HCV RNA，應(yīng)用RTPCR方法將HCV RNA轉(zhuǎn)換為模板DNA。然后應(yīng)用相應(yīng)的cDNA進(jìn)行基因分型，按照Simmonds等設(shè)計(jì)的5′非編碼區(qū)（noncoding region，NCR）的特異性引物對(duì)HCV RNA的陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行分型，不同基因型會(huì)擴(kuò)增出不同長(zhǎng)度大小的基因片段［7-8］，核酸電泳鑒定得出分型結(jié)果，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 HLA-Cw基因多態(tài)性分析

提取患者組和對(duì)照組（健康組）血液樣本DNA，采用PCR-SSP反應(yīng)，利用已報(bào)道引物對(duì) HLA-Cw 8個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，分別為 HLA-Cw*1，HLA-Cw*2，HLA-Cw*3，HLA-Cw*4，HLA-Cw* 5，HLA-Cw*6，HLA-Cw*7，HLA-Cw*8。1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，得出HLA-Cw等位基因在患者組合對(duì)照組的陽(yáng)性率。

4 HLA-Cw基因與HCV感染的分布關(guān)系（關(guān)聯(lián)性）

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，綜合分析 HLA-Cw各基因型在HCV各亞型中的分布得出HLA-Cw與具體HCV亞型之間的關(guān)系。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 11.5進(jìn)行分析，兩組間比較應(yīng)用卡方檢驗(yàn)（χ2）與 t檢驗(yàn)，計(jì)算P值；Logistic回歸分析，計(jì)算OR及其95%CI，分析各因素對(duì)HCV易感性的影響意義。P＜0.05證明有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1 基因分型結(jié)果

對(duì)327例HCV RNA陽(yáng)性樣本進(jìn)行HCV分型檢測(cè)，結(jié)果顯示 1a型 6例（1.8%），1b型225例（68.8%），2型15例（4.5%），3型26例（7.9%），1b／2型43例（13.1%），1b／3型9例（2.7%），1a／1b型3例（0.9%）。HCV 1b亞型在人群中的分布最多，其次為混合型1b／2型。

2 HLA-Cw基因多態(tài)性分析

對(duì)所有樣本進(jìn)行檢測(cè)得出 HLA-Cw 8種等位基因的陽(yáng)性率，見(jiàn)表 1，其中 HLA-Cw*8基因頻率HCV感染患者組顯著高于對(duì)照組，OR值與 95%CI分別為2.09和1.27～3.43，提示HLA-Cw*8基因可增加HCV的易感性。而其他7種基因在兩組間的頻率無(wú)顯著性差異。

3 HLA-Cw基因與HCV感染的分布關(guān)系（關(guān)聯(lián)性）

對(duì)HLA-Cw各基因型在HCV各亞型患者中的分布情況，將 HCV感染組與對(duì)照組進(jìn)行比較，采用多因素Logistic回歸分析，分析HLA-Cw基因?qū)Ω骶唧wHCV亞型感染的關(guān)聯(lián)性。對(duì)HLA-Cw*8分析結(jié)果顯示，HCV 1b亞型的感染者中同時(shí)攜帶HLA-Cw *8基因的個(gè)體數(shù)存在顯著異常（P＜0.05），且 OR值與95%CI分別為1.76和1.00～3.12，提示HLA-Cw*8基因會(huì)對(duì) HCV 1b亞型的感染產(chǎn)生協(xié)助作用，即 HLA-Cw*8基因會(huì)增加個(gè)體對(duì) HCV 1b的易感性。其他HLA-Cw亞型的分布均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 HLA-Cw基因位點(diǎn)的陽(yáng)性率差異比較 ［n（%）］

表2 患者組各HCV亞型中HLA-Cw*8分布情況［n（%）］

討 論

HCV可通過(guò)多種方式傳播，但并不是所有暴露于 HCV的個(gè)體都會(huì)被感染，這其中存在明顯的個(gè)體差異，即個(gè)體間對(duì)于 HCV的易感性不同，感染者疾病進(jìn)程也不盡相同。HCV感染后轉(zhuǎn)化為丙型肝炎慢性感染的機(jī)率可高達(dá) 80%左右，即可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，更有甚者發(fā)展成肝硬化或者肝癌［3，9］。機(jī)體的免疫狀態(tài)是慢性 HCV感染的重要影響因素，HLA是人類的免疫相關(guān)基因，是人類主要免疫相容性復(fù)合物（MHC）基因的主要產(chǎn)物，也是已知的最為復(fù)雜和最具多態(tài)性的遺傳系統(tǒng)［10］，主要功能是與病原體特異性識(shí)別連接，傳遞給 T細(xì)胞，刺激產(chǎn)生細(xì)胞免疫過(guò)程，進(jìn)而達(dá)到消滅已感染的病原體的目的。HLA與各種病原體特異結(jié)合作用是建立在HLA基因的多樣性基礎(chǔ)上的，HLA基因的多樣性對(duì)應(yīng)著HLA多肽結(jié)合的高度多樣性，也證明了HLA基因是病原體易感性個(gè)體差異的主要決定著。本研究選取HLA基因的一個(gè)亞型 HLA-Cw作為研究對(duì)象，初步探索其與HCV具體亞型感染關(guān)聯(lián)性。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)感染 HCV人群數(shù)目龐大［11］，并呈上升趨勢(shì)，且具有區(qū)域差異性，出現(xiàn)多種混合型，基因型呈現(xiàn)多樣化趨勢(shì)［12］，很多地區(qū)已對(duì)當(dāng)?shù)氐?HCV感染的亞型分布進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，但邯鄲分型統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)還有所欠缺，并且，就HLA-Cw與HCV感染之間的關(guān)聯(lián)報(bào)道還很少。本研究以 327名慢性 HCV感染者和160名健康者作為研究對(duì)象，初步分析邯鄲各HCV亞型的感染情況，并運(yùn)用 PCR-SSP方法對(duì)HLA-Cw的8個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，分析其在感染組和健康組之間的差異情況，以及與 HCV各亞型之間的具體關(guān)系。研究結(jié)果顯示，HLA-Cw*8與HCV的慢性感染有關(guān)，而其他 7個(gè)基因位點(diǎn)經(jīng)研究關(guān)聯(lián)不大，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HLA-Cw*8基因與HCV 1b亞型的易感性密切相關(guān)。此前未見(jiàn)關(guān)于具體至HLA-Cw*8基因與HCV感染相關(guān)報(bào)道，但大量報(bào)道指出HLA-Cw基因與 HCV以及其他病原體引起的免疫反應(yīng)中，具有極強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。

由于實(shí)際條件的限制，本研究所收集的樣本量偏少，還應(yīng)該進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，驗(yàn)證研究中得出的結(jié)論，同時(shí)，應(yīng)該開(kāi)展進(jìn)一步的研究，預(yù)測(cè) HLA-Cw *8基因的作用機(jī)制，設(shè)計(jì)動(dòng)物模型和細(xì)胞模型，進(jìn)行驗(yàn)證，完善 HLA-Cw*8基因與HCV關(guān)聯(lián)性的研究。

本研究首次對(duì)體檢者中的HCV感染者和健康個(gè)體的HLA-Cw等位基因進(jìn)行大樣本的比較，探討沒(méi)有 HCV感染高危行為的個(gè)體感染該病毒的內(nèi)在因素，分析易感人群，為控制 HCV的傳播提供可參考的理論依據(jù)。同時(shí)本研究還著重分析了丙型肝炎感染者丙型肝炎病毒基因分型和自身 HLA-Cw的關(guān)聯(lián)性，可為個(gè)體化治療提供依據(jù)。

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（潘子昂編輯）

Study on Hepatitis C Virus Genotyping and the Association of Polymorphisms of HLA-Cw

YANG Zhi-ming
（Department of Laboratory，Handan Central Hospital，Handan 056000，China）

ObjectiveTo investigate the distribution of hepatitis C virus（HCV）genotypes in Handan and the relationshipto polymorphismsofHLA-Cw.MethodsThe HCV genotypesweredetermined by fluorescencepolymerase chain reaction（PCR）and the positive rate of different HCV genotypes was calculated.Typing of HLA-Cw alleles was performed by PCR with sequence-specific primers（PCR-SSP）.The differences of HLA-Cw gene frequency and the degree of association were calculated between HCV patients and health controls.The association of HLA-C alleles and HCV genotypes were analyzed using statistical method to assess different HCV genotype infection associated HLA-Cw.ResultsType 1b was the predominant HCV genotype in Handan and followed by mixed type 1b／2.HLA-Cw*8 was related to HCV chronic infection，while the relationship was not found with other HLA-Cw.Further study found that HLACw*8 was closely related to the susceptibility of HCV 1b.ConclusionHLA-Cw gene was closely associated with HCV infection.This finding could be used to analyze susceptible population and provide a theoretical basis for reference to control the spread of HCV.

HCV； Genotype； HLA-Cw； Polymorphisms； Susceptibility

10.11748／bjmy.issn.1006-1703.2016.12.010

2016-07-20；

2016-08-12

邯鄲市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（1323108129）