李春梅，童鳳琴，馬 怡，錢(qián) 凱，張?bào)搛В瑖?yán) 俊，陳興國(guó)（.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科 南京市第一醫(yī)院，江蘇 南京 0006；.南京市浦口區(qū)中心醫(yī)院，江蘇 南京 800）

CD11b單核苷酸多態(tài)性與中國(guó)漢族系統(tǒng)性紅斑狼瘡的研究

李春梅1，童鳳琴2，馬 怡1，錢(qián) 凱1，張?bào)搛?，嚴(yán) 俊1，陳興國(guó)1
（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科 南京市第一醫(yī)院，江蘇 南京 210006；2.南京市浦口區(qū)中心醫(yī)院，江蘇 南京 211800）

目的分析 CD11b基因 rs1143679的單核苷酸多態(tài)性（SNP）在中國(guó)漢族系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者中的表達(dá)，并闡明該SNP與 SLE臨床表型的相關(guān)性。方法采用病例對(duì)照的研究方法，應(yīng)用PCR-PFLP以及直接測(cè)序技術(shù)對(duì)中國(guó)漢族人群中584例系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和624例健康對(duì)照者進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，分析基因型和等位基因頻率的分布差異，并與臨床表型進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果（1）SLE患者中 CD11b rs1143679 GA基因型頻率為1.89%，大大低于歐美國(guó)家的基因型頻率，與香港及泰國(guó)地區(qū)接近。（2）CD11b rs1143679 GA基因型與狼瘡腎炎有相關(guān)性（P＝0.01），而與發(fā)病時(shí)間、關(guān)節(jié)炎、血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)損害沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。結(jié)論CD11b rs1143679 SNP與中國(guó)漢族人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性有關(guān)，并可能參與了狼瘡腎炎的發(fā)生發(fā)展。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡； CD11b； rs1143679； 狼瘡腎炎

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是典型的自身免疫性疾病，全國(guó)患病總?cè)藬?shù)高達(dá)近一百萬(wàn)，與遺傳密切相關(guān)，最近國(guó)際上多個(gè)研究小組通過(guò)病例對(duì)照研究，發(fā)現(xiàn)整合素ITGAM（又稱為CD11b）外顯子3中的單核苷酸位點(diǎn)（rs1143679）基因型與多種人群中的 SLE易感性密切相關(guān)［1-2］，該突變體使得 77位的氨基酸由正常的精氨酸變?yōu)榻M氨酸（R77H），導(dǎo)致有CD11b突變的與沒(méi)有突變的SLE病人相比，其腎臟損害、盤(pán)狀紅斑、免疫學(xué)指標(biāo)更加嚴(yán)重，體內(nèi)有更多的自身抗體［3］。CD11b為整合素家族的細(xì)胞膜分子，參與了天然免疫、適應(yīng)性免疫以及炎性反應(yīng)，在調(diào)節(jié)免疫耐受中具有重要的作用［4-6］。前期我們小組采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CD11b通過(guò)負(fù)向調(diào)控 BCR信號(hào)通路，介導(dǎo)了自身反應(yīng)性B細(xì)胞的免疫耐受，而CD11b R77H突變通過(guò)阻礙BCR信號(hào)通路中CD22-CD11b直接鏈接，影響了負(fù)向調(diào)控信號(hào)的傳遞，促進(jìn)了自身反應(yīng)性B細(xì)胞過(guò)度活化，持續(xù)分泌過(guò)量的自身抗體，從而產(chǎn)生病理?yè)p害，導(dǎo)致免疫病的發(fā)生發(fā)展，有關(guān)文章發(fā)表在國(guó)際著名雜志《nature comunications》上［7］。然而，迄今為止，尚缺乏中國(guó)的 CD11b單核苷酸位點(diǎn)（rs1143679）基因型頻率數(shù)據(jù)，也未見(jiàn)該基因型與臨床表型之間的相關(guān)性報(bào)道。本研究擬采用病例對(duì)照研究的方法，利用 PCR-RFLP和直接測(cè)序技術(shù)進(jìn)行基因分型，分析CD11b SNP與 SLE的易感性和臨床表型的相關(guān)性，闡明 CD11b基因突變?cè)谥袊?guó) SLE患者中的意義，為開(kāi)發(fā)以CD11b為靶點(diǎn)的免疫干預(yù)藥物奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

對(duì)象與方法

1 研究對(duì)象

收集南京市第一醫(yī)院、浦口區(qū)中心醫(yī)院 2012～2016年確診的的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者 584例，收集同期性別、年齡相匹配的健康對(duì)照人群 628例。所有的患者診斷均符合 1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)院修訂的 SLE分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)。SLE組：男性38例，女性546例；年齡16～58歲，平均37.1±12.4歲；SLE疾病活動(dòng)指數(shù)（SLEDAI）評(píng)分3～19，平均10±4。健康對(duì)照組：男性27例，女性601例；年齡 18～56歲，平均36.6±11.3歲。兩組性別構(gòu)成（P＝0.295）、年齡（P＝0.450）等差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有 SLE患者臨床資料均有專(zhuān)業(yè)的臨床醫(yī)生經(jīng)統(tǒng)一培訓(xùn)，按照 1997年美國(guó)風(fēng)濕學(xué)院修訂的 SLE分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)加以記錄，建立Excel數(shù)據(jù)庫(kù)。本研究獲學(xué)校倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

2 基因組DNA的提取

采集研究對(duì)象外周靜脈血2 mL，EDTA抗凝，操作按照OMEGA基因組DNA試劑盒說(shuō)明書(shū)，快速提取DNA基因組，溶于洗脫緩沖液EB，經(jīng)鑒定合格后-80℃保存。

3 測(cè)序

3.1 PCR-RFLP

參照GenBank CD11b rs 1143679序列primer5.0設(shè)計(jì)引物，由南京金斯瑞技術(shù)公司合成。rs1143679上游引物為5′CTGGTTTTTGTGTCATTCTTAGG 3′；下游引物為5′CAATCCCAGTCCCAGCCCG 3′。PCR反應(yīng)總體積25μL，其中模板1 μL，2 X Power Taq master Mix 12.5 μL，上下游引物各 1 μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)至25 μL。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，61℃退火30 s，68℃延伸30 s，循環(huán)35次，最后68℃延伸 5 min，4℃停止。PCR產(chǎn)物電泳得到長(zhǎng)度為350 bp的 DNA片段。PCR產(chǎn)物純化后以限制性內(nèi)切酶 AciⅠ37℃水浴酶切 2 h后 2.5%瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果判斷基因型。酶切反應(yīng)體系：16μL PCR產(chǎn)物，2 μL NEB AciⅠ，2 μL 10X NEB buffer。

3.2 直接測(cè)序

對(duì)于上述 PCR-RFLP檢測(cè)到的基因突變型，進(jìn)一步將基因 DNA送至上海英駿生物技術(shù)公司，采用直接測(cè)序的方法加以核定，并與健康對(duì)照比較。

4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel錄入數(shù)據(jù)建立數(shù)據(jù)庫(kù)，采用根據(jù) IBM SPSS statistics V.21軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。根據(jù)基因型計(jì)算等位基因頻率，檢驗(yàn)是否符合 Hardy-Wenberg平衡。健康對(duì)照組和 SLE組的等位基因和基因型頻率以及臨床表型和基因型的相關(guān)分析可以采用卡方檢驗(yàn)。OR值和置信區(qū)間 CI用來(lái)評(píng)估rs1143679突變與SLE易感性。定量資料采組間比較用 t檢驗(yàn)。所有均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CD11b基因rs1143679G／A酶切圖譜分析

CD11b基因在rs1143679位點(diǎn)上有三種基因型。GG基因型可以被AciⅠ酶切，產(chǎn)物是 305bp和45bp的片段，AA基因型不能被AciⅠ酶切，只有350bp片段，GA基因型可產(chǎn)生 350bp、305bp和 45bp三個(gè)片段（圖1）。G、A等位基因由上海英駿生物工程技術(shù)公司測(cè)序證實(shí)（圖2）。

2 SLE與CD11b基因rs1143679 G／A多態(tài)性分析

經(jīng)卡方檢驗(yàn)，SLE組與健康對(duì)照組 CD11b基因rs1143679 G／A等位基因頻率符合 Hardy-Weinberg-Haenszel定律，說(shuō)明其基因頻率已經(jīng)達(dá)到遺傳平衡（P＞0.05），樣本具有群體代表性。CD11b rs1142679基因型頻率，SLE組與健康對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝5.24，P＝0.02），其等位基因頻率也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝5.21，P＝0.02）。見(jiàn)表1。

表1 SLE與健康對(duì)照組 CD11b基因 rs1143679各基因型和等位基因頻率的比較

3 CD11b rs1143679 SNP與SLE臨床表現(xiàn)的相關(guān)性分析

CD11b基因型分布對(duì) SLE病情的影響：見(jiàn)表2。系統(tǒng)性紅斑狼瘡組中 rs1143679位點(diǎn)不同基因型患者中，SLE狼瘡腎炎的比例不同，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.01）。關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)、血液系統(tǒng)表現(xiàn)、神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)在不同基因型組間未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（見(jiàn)表2）。同樣的，我們發(fā)現(xiàn)腎功能指標(biāo)：24h尿蛋白、尿肌酐／微量白蛋白和血清胱抑素 C均有明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.002，P＝0.001，P＝0.001）（見(jiàn)表3）。

表2 SLE患者 CD11b rs1143679各基因型的臨床表型

表3 SLE患者 CD11b rs1143679野生型和突變型與腎功能指標(biāo)相關(guān)性

討 論

CD11b是一種重要的白細(xì)胞表面抗原，廣泛表達(dá)于多種免疫細(xì)胞亞群，如樹(shù)突狀細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、中性性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞和B細(xì)胞等，可與CD18形成白細(xì)胞黏附分子β2整合素 CD11b／CDl8（又稱Mac-1或 CR3）。已有研究證實(shí) CR3活化后與細(xì)胞粘附分子 ICAM-1，ICAM2，纖維蛋白原，C3bi，GPIbα等多種配體結(jié)合，調(diào)節(jié)白細(xì)胞的粘附、遷移，促進(jìn)中性粒細(xì)胞之間及與內(nèi)皮細(xì)胞間粘附，協(xié)助巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用，參與免疫復(fù)合物的清除［8-9］。最近，Mac-1也被發(fā)現(xiàn)參與多個(gè)免疫細(xì)胞信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)控，如參與抑制 t細(xì)胞的活化，負(fù)調(diào)節(jié) Th17細(xì)胞的分化，抑制樹(shù)突狀細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，負(fù)向調(diào)控 toll樣受體介導(dǎo)炎癥反應(yīng)［10-11］和抑制 BCR信號(hào)通路介導(dǎo) B細(xì)胞耐受。這些都提示 CD11b在自身免疫疾病中扮演著重要的角色，且已在動(dòng)物試驗(yàn)上得到驗(yàn)證［12］。

截至目前，已有多個(gè)研究結(jié)果提示CD11b基因與 SLE發(fā)病有關(guān)，也在不同人群種族中證實(shí)。2008年 Nath等證實(shí)非裔美國(guó)人群的 CD11b rs1143679在SLE和健康對(duì)照人群中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［1］。2009年HAN等在歐洲、西班牙裔美國(guó)、非洲裔美國(guó)、墨西哥和哥倫比亞人群中也證實(shí)具有相關(guān)性。香港和泰國(guó)的科學(xué)家們應(yīng)用GWAS技術(shù)研究發(fā)現(xiàn) CD11b與疾病具有關(guān)聯(lián)性。在本次研究中，我們分析了CD11b基因 rs1143679 SNP與中國(guó)漢族人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果顯示，相比 A等位基因在歐美 ＞10%的基因頻率分布［13］，中國(guó)大陸僅有 ＜2%的頻率分布，這與香港、泰國(guó)、日本人等亞洲人群已有的基因頻率報(bào)告相似，其結(jié)果的差異與不同人群中SLE遺傳的異質(zhì)性有關(guān)。雖然A等位基因頻率很低，但我們?nèi)钥砂l(fā)現(xiàn)等位基因 A與中國(guó)漢族人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病具有關(guān)聯(lián)（P＝0.02）。這種罕見(jiàn) SNP研究提示系統(tǒng)性紅斑狼瘡可能受多種因素影響，rs1143679 SNP不能作為單一的或主要的影響因素，而闡明真正的治病因素有待更深入的研究。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)在rs1143679 SNP中，SLE組與對(duì)照組均以 GG基因型為主，GA基因型在SLE組的分布頻率高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.02），提示 GA基因型與 SLE發(fā)病有關(guān)。本研究小組的個(gè)體中尚未發(fā)現(xiàn)基因型 AA，可能是由于 A等位基因在漢族人群的低突變頻率造成的。

至于CD11b基因rs1143679 SNP與SLE患者臨床表型的相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變與狼瘡腎具有很強(qiáng)的的關(guān)聯(lián)性（P＝0.01），而與發(fā)病時(shí)間、關(guān)節(jié)炎、血液系統(tǒng)受損和神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。特別是腎臟的損傷，我們發(fā)現(xiàn)雜合突變型R77H系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者臨床化驗(yàn)24h尿蛋白，尿肌酐／微量白蛋白和血清抑光素 C較野生型 GG均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示 CD11b rs1143679位點(diǎn)GA基因型的 SLE患者更易發(fā)展成狼瘡腎，且腎功能損傷更加嚴(yán)重。類(lèi)似的結(jié)果在小鼠實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)，Alexander JJ等發(fā)現(xiàn)CD11b（-／-）嵌合體誘導(dǎo)免疫復(fù)合物型腎小球腎炎更加嚴(yán)重，而且產(chǎn)生更多的M1巨噬細(xì)胞和 CD4＋T細(xì)胞，提示單個(gè)核細(xì)胞上的CD11b對(duì)免疫復(fù)合物型腎小球腎炎是一個(gè)保護(hù)因素，有抗炎效果［14］。我們參與的前期研究也發(fā)現(xiàn)CD11b缺陷的小鼠更易產(chǎn)生過(guò)量的自身抗體和引發(fā)腎臟免疫球蛋白的沉積［7］。因此針對(duì)突變患者，臨床上應(yīng)給予更加積極有效的治療。

本實(shí)驗(yàn)首次進(jìn)行 CD11b基因多態(tài)性在中國(guó)漢族人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中的表達(dá)研究，證實(shí)了CD11b rs1143679 SNP與中國(guó)漢族系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生及狼瘡腎炎有相關(guān)性，但鑒于 A等位基因在中國(guó)漢族人群的低基因頻率，本研究實(shí)驗(yàn)需要擴(kuò)大樣本量以增加結(jié)果可信度。后期，我們會(huì)進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞功能研究手段和蛋白分析技術(shù)，比較 CD11b基因突變和未突變狼瘡患者的B細(xì)胞功能和信號(hào)通路分子的變化，來(lái)闡明CD11b基因突變引起的 B細(xì)胞功能改變以及在狼瘡中的致病機(jī)制，從而為開(kāi)發(fā)以CD11b為靶點(diǎn)的基因工程藥物奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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（李 凌編輯）

Association of CD11b Single Nucleotide Polymorphism with Systemic Lupus Erythematosus in Chinese Han Population

LI Chun-mei1，TONG Feng-qin2，MA Yi1，QIAN Kai1，ZHANG Jun-yu1，YAN Jun1，CHEN Xing-guo1
（1.Department of Rheumatology and Immunology，Nanjing First Hospital，Nanjing Medical University，Nanjing 210006，China；2.Nanjing Pukou Central Hospital，Nanjing 211800，China）

ObjectiveTo investigate the single nucleotide polymorphism（SNP）expression of CD11b in Chinese Han patients with systemic lupus erythematosus（SLE），and to clarify the association of this SNP with SLE clinical manifestations.MethodsThe variant of CD11b，rs1143679 was examined in 584 patients with SLE and 628 healthy controls by a polymerase chain reaction-restriction fragments length polymorphism（PCR-RFLP）and direct sequencing to compare the frequencies distribution of genotype and allele，and to determine the correlation of CD11b genotypes and clinical manifestations.ResultsWe found that（1）the frequency of CD11b rs1143679 GA genotype in Chinese Han patients with SLE was 1.89%，which was much lower than the frequency of European and American，but close to the frequency in Hong Kong and Thailand.（2）CD11b rs1143679 SNP was associated with nephritis（P＝0.01），but not associated with age of onset，arthritis，hematological involvementand neurological impairment（P＞0.05）.ConclusionThe variant of CD11b rs1143679 SNP has risk for SLE in Chinese Han population，and it may play an important role in the development of lupus nephritis.

Systemic lupus erythematosus； CD11b； rs1143679； Lupus nephritis

10.11748／bjmy.issn.1006-1703.2016.12.001

2016-10-02；

2016-11-29

國(guó)家自然基金項(xiàng)目（編號(hào)81228018，名稱：CD11b基因突變引起的 B細(xì)胞功能改變以及在狼瘡中的致病機(jī)制研究）；南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展項(xiàng)目（編號(hào) YKK13207，名稱：SLE中免疫負(fù)調(diào)控基因 CD11b突變的表達(dá)研究）

陳興國(guó)，副主任醫(yī)師。E-mail：13851750676＠163.com