王海燕， 許靜雅， 李 睿， 熊定奎， 曾 秀， 谷山林， 王介平， 周 嬋， 王小燕， 姚 洪

(重慶市畜牧科學院，重慶 402460)

研究與技術

響應面優(yōu)化桑葉槲皮素提取物脫色工藝

王海燕， 許靜雅， 李 睿， 熊定奎， 曾 秀， 谷山林， 王介平， 周 嬋， 王小燕， 姚 洪

(重慶市畜牧科學院，重慶 402460)

為了減少色素等雜質(zhì)對桑葉槲皮素提取物分離純化的干擾，采用活性炭對其進行脫色處理，并對工藝進行優(yōu)化。以桑葉槲皮素提取物脫色率為評價指標，通過響應面法對影響活性炭脫色效果的3個因素進行優(yōu)化，分別為活性炭質(zhì)量濃度、脫色時間和脫色溫度。結(jié)果表明，桑葉槲皮素提取物活性炭最佳脫色工藝為：活性炭質(zhì)量濃度5 g/L、脫色時間9 min、脫色溫度79.04 ℃，桑葉槲皮素提取物的脫色率達94.65%±1.65%，與模型預測值94.30%基本相符。結(jié)果顯示，試驗所得脫色工藝簡單易操作且脫色效果較好，對桑葉槲皮素提取物后續(xù)純化具有一定意義。

桑葉；槲皮素；醇提物；響應面；活性炭；脫色

桑葉是藥食兩用植物[1]，自古以來都有將桑葉作為中藥或食物進行使用。研究表明，桑葉所具有的抗氧化、抗菌、降血糖、防治動脈硬化等生理作用，與其含有的黃酮、多糖、生物堿等物質(zhì)息息相關[2-7]。為了提高桑葉經(jīng)濟價值，多元化開發(fā)利用是重要的途徑。目前，桑葉作為藥物提取原料的研究主要集中在桑葉粗提物及功能作用方面，對桑葉中單體的分析純化研究報道較少。槲皮素是桑葉黃酮中一種重要的苷元物質(zhì)，活性作用強，具有極大開發(fā)潛力[8-11]。根據(jù)文獻報道，桑葉中槲皮素的提取法主要為乙醇提取，多采用超聲波輔、微波、加熱回流等進行輔助提取[12-20]。然而乙醇提取桑葉槲皮素的同時，大量色素等雜質(zhì)也一并被提取，色素對桑葉槲皮素進一步分離純化造成嚴重干擾。為了減少色素對桑葉槲皮素分離純化的干擾，本試驗擬采取較廣泛應用的活性碳脫色方法進行處理，同時根據(jù)響應曲面法對活性炭脫色工藝進行優(yōu)化，以期為桑葉槲皮素分離純化提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葉(重慶市畜牧科學院蠶業(yè)研究所)；無水乙醇、活性炭(粉狀)，以及其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純(成都市科龍化工試劑廠)。

1.2 儀器與設備

FA2004 B電子天平(上海越平科學儀器有限公司)；XMTD-4000電熱數(shù)顯恒溫水槽(上海比朗儀器有限公司)；THC-10B數(shù)控超聲波提取機(濟寧天華超聲電子儀器有限公司)；SHZ-D Ⅲ循環(huán)水式真空泵，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-2000B(鞏義市予華儀器有限責任公司)；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(普析通用儀器有限責任公司)。

1.3 方 法

1.3.1 桑葉槲皮素提取方法

稱取干桑葉粉38 g，按照乙醇質(zhì)量分數(shù)50%、料液比1︰26、溫度70 ℃提取30 min，提取2次，3 000 r/min離心10 min，過濾，合并濾液，真空減壓濃縮，回收乙醇，去離子水定容至100 mL，獲得桑葉槲皮素提液原液備用[21]。吸取桑葉槲皮素提取物原液10 mL，去離子水定容至1 000 mL，作為桑葉醇槲皮素提取稀釋液用于脫色處理。

1.3.2 脫色處理及計算方法

取250 mL燒杯，分別加入50 mL桑葉槲皮素提取稀釋液及適量的活性炭，在設定的溫度下攪拌脫色至相應的時間。用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計通過全波長掃描，確定最佳吸收波長，在該波長下測定吸光度，去離子水作空白試樣。再按下式計算脫色率：

其中主要使用的定理為，已知集合U={u1,u2,…,un}，V={u1,u2,…,um},能夠發(fā)現(xiàn)其中對于確定的模糊影射f：U→F(V)，u1→f(u1)=r=(ri1,ri2…rin)其中r∈F(V),m=1,2,···,n,能夠發(fā)現(xiàn)，其中惟一確定模糊關系矩陣為

(1)

式中：Y為脫色率，A0為脫色前吸光度值，A1為脫色后吸光度值。

1.3.3 單因素試驗

1)活性炭質(zhì)量濃度對桑葉槲皮素提取液脫色效果的影響

在7個250 mL錐形瓶中分別量取桑葉槲皮素稀釋液50 mL，再分別加入質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10、12、14 g/L的活性炭，在70 ℃溫度下脫色10 min，脫色處理后過濾，在最佳吸收波長下測定吸光度。

2)脫色時間對桑葉槲皮素提取液脫色效果的影響

在7個250 mL錐形瓶中分別量取桑葉槲皮素稀釋液50 mL，加入12 g/L活性炭，在70 ℃條件下分別脫色處理4、5、6、7、8、9、10 min，脫色處理后過濾，在最佳吸收波長下測定吸光度。

在7個250 mL錐形瓶中分別量取桑葉槲皮素稀釋液50 mL，加入12 g/L活性炭，分別在55、60、65、70、75 ℃條件下脫色處理10 min，脫色處理后過濾，在最佳吸收波長下測定吸光度。

1.3.4 Box-Behnken試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選取活性炭質(zhì)量濃度、脫色時間和脫色溫度自變量，脫色率(Y)為響應值，根據(jù)Box-Behnken design(BBD)試驗設計原理，進行3因素3水平的響應面分析試驗，如表1所示。通過Design-Expert 7.1.6軟件(STAT-EASE Inc., Minneapolis, USA)對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，試驗結(jié)果通過多元回歸分析方法來擬合多元二次方程。

表2 試驗因素與水平
Tab.2 Experimental factors and levels

水平編碼活性炭質(zhì)量濃度/(g·L-1)脫色時間/min脫色溫度/℃-1 10．05．060012．57．570115．010．0 80

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 15數(shù)據(jù)處理軟件，各組數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值±SD(n=3)表示，并進行方差分析，LSD法多重比較，p<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉槲皮素提取物澄清度與色度測定波長的確定

圖1為桑葉槲皮素提取物的波長與吸光度的關系曲線。

圖1 桑葉槲皮素提取物的波長與吸光度的關系Fig.1 Relation curve between the wavelength and absorbance of quercetin extracted from mulberry leaves

由圖1可知，在190～400 nm的波長范圍內(nèi)桑葉槲皮素提取物有兩個明顯的吸收峰330 nm和210 nm。脫色率是根據(jù)比色法評價，透光率越大，顯示澄清效果越好。提取液在330 nm處測的透光率最小，背景吸收較小，相對誤差小。為了更科學地反映桑葉槲皮素提取物在脫色前后在紫外區(qū)域的顏色變化，本試驗選擇330 nm波長處作為測定波長[22-24]。

2.2 單因素試驗分析

圖2為活性炭質(zhì)量濃度、脫色時間和脫色溫度對桑葉槲皮素提取物脫色率的影響。

圖2 活性炭質(zhì)量濃度、脫色時間和脫色溫度對桑葉槲皮素提取物脫色率的影響Fig.2 Effects of mass concentration of activated carbon, decolorization time and decolorization temperature on decolorization rates of quercetin extracted from mulberry leaves

從圖2(a)可以看出，活性炭質(zhì)量濃度在2.00～14.00 g/L時，脫色率先隨活性炭質(zhì)量濃度增加而增加，在2.00 g/L時，脫色率最低，為4.69%?；钚蕴抠|(zhì)量濃度在12.00 g/L之后，脫色率增加趨勢變緩，穩(wěn)定在98.69%～98.70%。結(jié)果表明，活性炭質(zhì)量濃度的較佳水平為12.00 g/L。

從圖2(b)可以看出，脫色時間在4.00～10.00 min，脫色率隨著時間的增加而小幅增加，脫色率達到97.86%。當脫色時間為4.00 min時，脫色率為95.13%，之后逐漸趨于平緩并維持在98.50%左右。綜合考慮為節(jié)約能耗，脫色時間為8.00 min時已能達到較好脫色效果。

從圖2(c)可以看出，脫色溫度在55.00～75.00 ℃時，脫色率隨溫度緩慢上升，溫度在55.00 ℃時，脫色率為最低值77.45%。溫度在70.00 ℃，脫色率為94.65%，75.00 ℃脫色率在96.80%?？紤]節(jié)約能耗的問題，選擇脫色溫度為70.00 ℃。

2.3 響應面優(yōu)化桑葉槲皮素提取物脫色率工藝參數(shù)

2.3.1 數(shù)學模型的建立與檢驗

本試驗利用Design-Expert 7.1.6軟件中的Box-Benhnken中心組合試驗設計，可獲得桑葉槲皮素提取物脫色率(Y)的三因素三水平試驗設計及結(jié)果(表2)，并獲得二次回歸方程：

表2 響應面分析方案及試驗結(jié)果
Tab.2 Experimental designs and results of response surface analysis

試驗序號A活性炭質(zhì)量濃度/(g·L-1)B脫色時間/minC脫色溫度/℃脫色率/%110．07．58092．68215．05．07093．15312．57．57093．56412．55．06092．01510．07．56092．05612．57．57093．57710．010．0 7092．98812．55．08092．49915．010．0 7094．061012．57．57093．571112．510．0 6092．971215．07．58094．061312．510．0 8093．961412．57．57093．541512．57．57093．491610．05．07091．211715．07．56093．32

Y/%=(93.93+3.32A+0.83B-0.076C-2.04AB+0.68AC+0.38BC-1.80A2-0.53B2+0.44C2)×100

(2)

試驗結(jié)果方差分析見表3。由表3可知，影響提取物脫色率的因素A，B，AB和A2均表現(xiàn)出了顯著水平，二次回歸方程整體模型極顯著，該回歸模型與實測值能較好地擬合。進一步對該回歸模型進行顯著性檢驗發(fā)現(xiàn)，提取物脫色率二次回歸模的決定系數(shù)R2為96.78%，提取物脫色率二次回歸模的校正決定系數(shù)RAdj2為92.65%，均≥90%，說明模型相關度很好，p<0.0001，回歸模型極顯著。

表3 桑葉槲皮素提取物脫色率回歸方程的方差分析
Tab.3 Variance analysis of decolorization rate regression equation of quercetin extracted from mulberry leaves

變異源平方和自由度均方F值P>F顯著性模型125．24 913．92 20．270．0003??A活性炭質(zhì)量濃度/(g·L-1)80．01 180．01 116．57 <0．0001 ??B脫色時間/min3．9813．98 5．790．0470?C脫色溫度/℃0．01310．013 0．0190．8500AB16．56 116．56 24．130．0017?AC4．0014．00 5．830．0465?BC1．5911．59 2．310．1721A218．25 118．25 26．590．0013??B20．2510．25 0．360．5678C20．681．000．68 1．000．3515殘差Residual4．8070．69失擬LackofFit1．4830．4914．920．1230純誤PureError0．1440．035R2 0．9678R2adj 0．9265

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。

3.3.2 響應面分析和優(yōu)化參數(shù)的優(yōu)化與驗證

為了考察活性炭質(zhì)量濃度、脫色時間和脫色溫度交互項對桑葉槲皮素提取物脫色率的影響，在其他因素條件固定為0水平時，考察交互項對桑葉槲皮素提取物脫色率的影響，對模型進行降維分析。經(jīng)Design-Expert 7.1.6軟件分析，所得的響應面圖見圖3。

由圖3可知，活性炭質(zhì)量濃度(A)與脫色時間(B)、活性炭質(zhì)量濃度(A)與脫色溫度(C)的響應曲面圖坡度較陡，AB、AC交互較顯著。脫色時間(B)與脫色溫度(C)響應曲面圖坡度較緩，顯示BC交互作用不顯著。響應曲面圖與回歸模型的方差分析結(jié)果相吻合。

圖3 活性炭質(zhì)量濃度、脫色時間和脫色溫度對澄清度的影響三維響應面Fig.3 Response surface for the effect of cross-interaction among mass concentration of activated carbon, decolorization time and decolorization temperature

2.4 桑葉醇提取脫色率工藝參數(shù)的優(yōu)化和驗證

為了進一步確定回歸方程式(2)模擬的最佳試驗點，對所得的回歸方程取一階偏導等于零并整理得：A=1.000，B=0.735，C=1.000。換算成實際試驗條件：活性炭質(zhì)量濃度15.00 g/L、脫色時間9.00 min、脫色溫度79.04 ℃，桑葉醇提液脫色率為94.30%。

通過試驗進一步檢驗方程的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進行澄清試驗，測得桑葉醇提取脫色率為94.65%±1.65%(n=3)，與方程模擬值基本接近，進一步驗證了模型可靠性。

表4 桑葉槲皮素提取脫色率的優(yōu)化結(jié)果
Tab.4 The optimal results of decolorization rate of quercetin extracted from mulberry leaves

比較項目A活性炭質(zhì)量濃度/(g·L-1)B脫色時間/minC脫色溫度/℃澄清度/%理論值159．080．094．30實驗值159．080．0(94．65±1．65)

3 結(jié) 論

通過桑葉乙醇提取、濃縮、單因素脫色、響應曲面優(yōu)化、驗證等步驟，對于由70.00%乙醇提取桑葉粉得出的桑葉槲皮素提取液的脫色工藝而言，經(jīng)過響應曲面方法優(yōu)化后，其脫色最佳工藝條件為：活性炭質(zhì)量濃度15.00 g/L、脫色時間9.00 min、脫色溫度80.00 ℃。按照最佳脫色工藝進行脫色的樣液，脫色率達到94.65%±1.65%。因此，本次試驗得出的脫色工藝簡單易操作且脫色效果極好，對桑葉槲皮素后續(xù)分離純化研究具有重要意義。

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Optimization of decolorization process of quercetin extracted from mulberry leaves by response surface methodology

WANG Haiyan, XU Jingya, LI Rui, XIONG Dingkui, ZENG Xiu, GU Shanlin, WANG Jieping,ZHOU Chan, WANG Xiaoyan, YAO Hong

(Chongqing Academy of Animal Sciences, Chongqing 402460, China)

In order to reduce the effects of pigments on isolating and purifying of quercetin extracted mulberry leaves, activated carbon was used to decolor it and the process was optimized. By taking the decolorization rate as a comprehensive evaluation index, the 3 process parameters (mass concentration of activated carbon, decolorization time and decolorization temperature) were optimized by response surface methodology. The results show that the best decolorization process (of activated carbon of quercetin extracted from mulberry leaves) is as follows: mass concentration of activated carbon 5 g/L, decolorization time 9 min and decolorization temperature 79.04 ℃. The decolourization ratio of the extract was 94.65%±1.65%, which was basically consistent with the predicted value (94.30%). The results show that the obtained decolorization process was easy to operate and its effect was better. The results have certain significance for subsequent purification of the extract.

mulberry leaves; quercetin; ethanol extract; response surface methodology; activated carbon; decolorization process

10.3969/j.issn.1001-7003.2016.12.003

2016-05-31;

2016-11-04 基金項目: 重慶市科委應用開發(fā)計劃項目(cstc2014 yykfA80014)；重慶市2015年農(nóng)發(fā)資金項目(15403) 作者簡介: 王海燕(1986_)，女，助理研究員，主要從事天然活性成分、蠶桑資源綜合利用及食品安全與質(zhì)量控制的研究。通信作者：曾秀，研究員，whydetian@163.com。

TS190.924

A

1001-7003(2016)12-0012-06 引用頁碼: 121102