韓淑芳，劉一飛，王國艷，王志宇，馬馨，梁佶宇，李希

（山西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

某奶牛場牛乳源金黃色葡萄球菌的分離鑒定與耐藥性調查

韓淑芳，劉一飛，王國艷，王志宇，馬馨，梁佶宇，李希

（山西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原030032）

從山西某奶牛場隨機采集25份奶樣，進行細菌分離培養(yǎng)、染色鏡檢、H2O2酶試驗鑒定，并對其進行了9種藥物的敏感性試驗。結果表明，從25份奶樣中分離出18株金黃色葡萄球菌；這18株金黃色葡萄球菌對多種藥物呈現(xiàn)出耐藥性，其中，對阿莫西林耐藥率最高，達77.8%，對卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、磷霉素、頭孢曲松的耐藥率介于11.1%～44.4%，對左氧氟沙星的耐藥率最低，為5.6%。說明金黃色葡萄球菌為該奶牛場奶牛乳房炎的主要致病菌，該場奶牛對9種抗生素產生了普遍的耐藥性，建議該奶牛場以體外藥物敏感試驗為參考，進一步擴大藥物的篩選范圍，選擇更多敏感藥物進行治療。

牛乳；金黃色葡萄球菌；分離鑒定；耐藥性

奶牛乳房炎是當前奶牛群中普遍流行的疾病，業(yè)已成為導致奶牛業(yè)嚴重損失的主要疾病之一。引起奶牛乳房炎的病原菌種類較為復雜，常因地域、季節(jié)及飼養(yǎng)管理水平的差異而呈現(xiàn)出不同種類、不同比例的病原菌感染。而金黃色葡萄球菌目前仍是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，甚至占到奶牛乳房炎中病原體的50%以上[1]。奶牛乳房感染金黃色葡萄球菌常導致奶牛產生急性、亞急性和慢性感染癥狀。據(jù)報道，在奶牛場中，臨床型乳房炎的發(fā)病率為2%～8%，隱性乳房炎的發(fā)病率更高，并且難以自愈[2-3]。該菌屬可侵害奶牛乳房上皮細胞引起嚴重的纖維性炎癥，并影響腺泡的分泌功能，使產奶量急劇下降；還可產生多種毒素污染乳汁，經(jīng)煮沸消毒仍不能將其滅活。飲用金黃色葡萄球菌污染的牛奶，會導致劇烈的嘔吐、腹瀉和發(fā)熱病癥。因此，該菌的傳播對奶牛健康和食品安全造成了嚴重威脅[3-9]。

目前，臨床治療金黃色葡萄球菌感染的主要措施仍是運用各類抗生素，但由于抗生素的超劑量和頻繁使用，使其耐藥譜不斷擴大，產生的多重耐藥情況越來越普遍，常使得臨床治療面臨無藥可用的困境，進而導致其將耐藥性由奶源傳遞給人類，給公共衛(wèi)生帶來嚴重隱患[5，10-14]。

本研究從山西省某奶牛場送檢的25份牛乳中，經(jīng)細菌培養(yǎng)和染色鏡檢初步分離出18株金黃色葡萄球菌，并對其進行了藥敏試驗，旨在了解該奶牛場流行菌株的耐藥情況，并為臨床治療奶牛乳房炎的抗生素篩選提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

乳樣：山西省某奶牛場送檢的分別從25頭疑患乳房炎的奶牛采集到的25份牛乳各5～10 mL。

菌株：質控菌株（金黃色葡萄球菌ATCC25923），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

培養(yǎng)基：普通瓊脂平板、營養(yǎng)肉湯，購自北京奧博星生物技術有限責任公司；血液瓊脂平板，購自鄭州安圖生物工程股份有限公司。

藥敏紙片：其包括環(huán)丙沙星、阿莫西林、氧氟沙星、卡那霉素、阿米卡星、磷霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星、慶大霉素共9種，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 乳樣細菌的分離培養(yǎng)和形態(tài)觀察無菌吸取0.5 mL各乳樣，分別加入5 mL的肉湯培養(yǎng)液中，于37℃溫箱培養(yǎng)18～24 h，觀察肉湯濁度。再用接種環(huán)蘸取菌液劃線接種于普通瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落顏色、形態(tài)。挑取疑似葡萄球菌的優(yōu)勢菌落再次劃線接種于血液瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察溶血情況并經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢。

1.2.2 過氧化氫酶試驗用接種環(huán)挑取染色鏡檢后的疑似菌落涂抹于載玻片上，在其上滴加2～3滴3%的H2O2，觀察有無氣泡產生。

1.2.3 金黃色葡萄球菌的藥物敏感試驗采用K-B紙片擴散法對環(huán)丙沙星、阿莫西林、氧氟沙星、卡那霉素、阿米卡星、磷霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星、慶大霉素等9種藥物進行藥敏試驗，37℃培養(yǎng)18～24 h后量取抑菌圈直徑，其結果根據(jù)美國臨床實驗室國家標準化委員會（NCCLS）制定標準判讀。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養(yǎng)結果

普通肉湯中呈現(xiàn)出明顯的渾濁，有沉淀，且在管壁形成菌環(huán)。普通瓊脂平板上生長的菌落呈圓形、濕潤、不透明、邊緣整齊、表面隆起光滑，顏色呈檸檬色或黃色（圖1）。將瓊脂平板上的優(yōu)勢菌落接種血液瓊脂平板后，未見形成明顯的β溶血環(huán)（圖2）。初步分離出18株金黃色葡萄球菌。

2.2 染色鏡檢結果

分離菌落經(jīng)染色鏡檢，可見不規(guī)則排列成葡萄串樣的革蘭氏陽性球菌（圖3）。

2.3 H2O2酶試驗結果

受試的18株菌落均產生氣泡，說明18株菌均為H2O2酶陽性。

2.4 藥物敏感試驗結果

表118 株金黃色葡萄球菌藥敏試驗結果

分別對18株金黃色葡萄球菌進行藥敏試驗，結果依據(jù)美國臨床實驗室標準委員會（NCCLS）制定的標準判斷，即抑菌圈直徑≥20 mm為高度敏感，16mm＜直徑＜20mm為中度敏感，直徑≤16 mm為耐藥。由表1可知，分離的18株金黃色葡萄球菌對環(huán)丙沙星、阿莫西林、氧氟沙星、卡那霉素、阿米卡星、磷霉素、頭孢曲松、左氧氟沙星、慶大霉素均呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性。其中，分離菌株對阿莫西林的耐藥率最高，達77.8%，對左氧氟沙星的耐藥率最低，為5.6%，對其余7種抗生素的耐藥性介于11.1%～44.4%。

3 討論與結論

本試驗通過細菌的分離培養(yǎng)、染色鏡檢、過氧化氫酶等試驗方法對25份奶樣中的金黃色葡萄球菌進行了初步分離鑒定。結合菌落在平板上的金黃色菌落、染色鏡檢呈陽性葡萄串樣、過氧化氫酶試驗陽性的結果，初步認定試驗分離出18株金黃色葡萄球菌，推測其是引起該場奶牛乳房炎的優(yōu)勢菌株。但分離菌株在血瓊脂平板培養(yǎng)后，并未形成明顯的β溶血環(huán)。由于大多數(shù)致病性金黃色葡萄球菌經(jīng)血瓊脂平板培養(yǎng)后均呈現(xiàn)β溶血環(huán)[15]，本試驗的分離菌株是否為致病性菌株還有待后續(xù)開展分離菌株的致病性試驗進一步檢測。

本試驗的藥敏結果顯示，分離出的18株金黃色葡萄球菌除對左氧氟沙星耐藥率最低（5.6%）外，對環(huán)丙沙星、阿莫西林、氧氟沙星、卡那霉素、阿米卡星、磷霉素、頭孢曲松、慶大霉素都呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性，其中，阿莫西林的耐藥率最高（77.8%）。這與王冰等[16]報道的呼和浩特地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌對阿莫西林產生耐藥性最多的結果相近。對卡那霉素、慶大霉素和阿米卡星的耐藥性居其次（44.4%，38.9%，33.3%），高于王桂琴等[17]報道的卡那霉素耐藥率（26%）和阿米卡星耐藥率（6%），高于錫林高娃等[18]報道的慶大霉素耐藥率（0），其余抗生素如環(huán)丙沙星、氧氟沙星、頭孢曲松的耐藥率在16.7%～22.2%，與王桂琴等[17]報道的環(huán)丙沙星、氧氟沙星、頭孢曲松耐藥率（12%，12%，14%）相近，但顯著高于錫林高娃[18]報道的環(huán)丙沙星、氧氟沙星耐藥率（0，4.2%），與高延玲等[19]報道的頭孢曲松耐藥率（13.4%）相近，但低于氧氟沙星耐藥率（25.6%）。此外，本試驗還選用了臨床上較少使用的磷霉素進行藥敏試驗，結果顯示，分離菌株對磷霉素也產生了一定的耐藥性，耐藥率為11.1%。本試驗中耐藥率最低的是左氧氟沙星，18株金黃色葡萄球菌分離株中僅有1株耐藥，耐藥率為5.6%，與賴金倫等[20]試驗結果較為一致。提示左氧氟沙星可作為治療該奶牛場奶牛乳房炎的備選藥物。

由于本試驗所分離菌株的數(shù)量相對較少，且與各相關報道中的受試菌株基數(shù)也不盡一致，導致金黃色葡萄球菌對各抗生素的耐藥率與相關報道存在一定的差異。因此，本試驗結果僅對受試奶牛場的病原流行病學、耐藥性調查和藥物選擇具有指導性，并不具有廣泛的通用性和代表性。山西省內更大范圍的奶牛乳房炎流行狀況及其病原菌金黃色葡萄球菌的耐藥情況還需不斷擴大病原菌的分離數(shù)量作進一步的試驗調查。

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Isolation，Identification and Drug Resistance Survey of Staphylococcus
aureus from Milk in a Dairy Farm

HANShufang，LIUYifei，WANGGuoyan，WANGZhiyu，MAXin，LIANGJiyu，LI Xi
（Institute of Animal Husbandry and Veterinary，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030032，China）

25 milk samples were collected from a dairy farm in Shanxi province,meanwhile some procedures such as isolation and cultivation of bacteria,staining and observation,H2O2enzyme test,and analysis of drug resistance to9 drugs were conducted respectively. A total of 18 S.aureus strains were identified successfully from 25 suspected colonies.The result showed that 18 S.aureus strains presented multidrug resistance strains.Resistance rate of all S.aureus strains to amoxicillin was the highest,up to 77.8%.Resistance rates were 11.1%-44.4%,to kanamycin,gentamicin,amikacin,ciprofloxacin,ofloxacin,fosfomycin and cefoxitin.Resistance rate of levofloxacin was the lowest,only 5.6%.The result indicated that S.aureus strains were the pathogenic bacteria of bovine mastitis in the dairy farm,and produced drug resistance to 9 drugs.Treatment should be carried based on the drug sensitivity test to selecte more sensitive drugs.

milk;Staphylococcus aureus;isolation and and identification;drug resistance

S858.23

A

1002-2481（2016）11-1696-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.11.28

2016-06-16

山西省農業(yè)科學院攻關項目（YGG1427）

韓淑芳（1979-），女，山西左云人，助理研究員，主要從事畜禽養(yǎng)殖技術研究工作。劉一飛為通信作者。