陳哲，梁宏，黃靜，趙佳

（山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心，山西太原030031）

解淀粉芽孢桿菌CM3培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化

陳哲，梁宏，黃靜，趙佳

（山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心，山西太原030031）

為了提高解淀粉芽孢桿菌CM3的抑菌活性，對菌株的培養(yǎng)基組分和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化研究。采用單因素試驗對菌株菌CM3的所需碳源、氮源、無機鹽、培養(yǎng)基初始pH、接種量、培養(yǎng)時間和培養(yǎng)溫度進行了篩選，并用正交設計試驗對培養(yǎng)基組成以及培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。結果表明，最終優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分為：玉米粉2%，豆粕0.5%，魚粉0.5%，NaCl 0.1%；最佳發(fā)酵條件：pH值7.0，接種量5%，培養(yǎng)時間48 h，培養(yǎng)溫度31℃；在優(yōu)化后，拮抗細菌CM3的發(fā)酵液抑菌圈直徑可達到37.58 mm，比優(yōu)化前提高了22.7%。

解淀粉芽孢桿菌；培養(yǎng)基優(yōu)化；正交設計

目前，采用微生物防治是治理由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）引發(fā)的黃萎病最有潛力的方法之一[1-6]。解淀粉芽孢桿菌是目前生物防治中比較具有代表性的芽孢桿菌[7]，它具有較強的次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生能力[8]，能產(chǎn)生多種抑菌物質，可以廣泛地抑制真菌和細菌的活性[9-11]，因而，其成為具有生物農(nóng)藥開發(fā)潛力的微生物[12-14]。

山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心微生物課題組在研究草莓灰霉病時，從發(fā)病植株根際的土壤樣品中篩選到了1株拮抗菌，經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌，命名為CM3，該菌株具有較強的抑菌活性和較寬的抑菌譜，尤其是其發(fā)酵產(chǎn)生的抑菌物質具有很好的穩(wěn)定性[15]，具有良好的生防產(chǎn)品應用開發(fā)前景。

根據(jù)研究目的不同，不同菌株所需的最適培養(yǎng)基也不同[16-17]，本研究兼顧提高抗菌活性和降低生產(chǎn)成本2個方面，將大麗輪枝菌作為病原指示菌，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌CM3的培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件，研究培養(yǎng)基的碳氮源、無機鹽、初始pH、溫度、發(fā)酵時間及接種量對CM3抑菌活性的影響，以探索菌株CM3抑菌活性達到最大時的最適宜生產(chǎn)發(fā)酵條件，旨在為該菌株進行生防菌劑的開發(fā)應用提供重要的基礎理論數(shù)據(jù)[18]。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株解淀粉芽孢桿菌CM3由山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心微生物課題組從土壤中篩選提供。病原菌大麗輪枝菌株由山西省農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所保存。

1.1.2 培養(yǎng)基參見沈萍等[19]的《微生物學實驗》。PDA固體培養(yǎng)基配方（g/L）：馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂8-20）；PD液體培養(yǎng)基配方（g/L）：馬鈴薯200，葡萄糖20；LB培養(yǎng)基配方（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，用5 mol/L NaOH調pH值至7.0。其中，PDA培養(yǎng)基作為抑菌試驗使用的培養(yǎng)基，PD培養(yǎng)基作為指示菌的培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基作為拮抗菌的基礎培養(yǎng)基，拮抗菌的發(fā)酵培養(yǎng)基根據(jù)試驗結果自行選擇。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng)配制PD培養(yǎng)基，濕熱滅菌，121℃，20 min。從平板上用接種環(huán)取單菌落接種于裝有培養(yǎng)基的三角瓶中，振蕩均勻制成菌懸液。200 r/min，30℃，搖床培養(yǎng)18 h，備用。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)將配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基裝入150 mL三角瓶中，裝瓶量為50 mL，調pH值至7.2，濕熱滅菌，121℃，20 min。用滅菌的移液管將培養(yǎng)好的液體菌種按2%的接種量接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中。振蕩均勻制成菌懸液。200 r/min，30℃，搖床培養(yǎng)48 h，備用。

1.2.3 抑菌試驗測定方法從病原菌的平板上用接種環(huán)刮取菌絲，接種于PD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h，備用。根據(jù)需要放置好牛津杯。將菌懸液倒入恒溫于50℃左右的滅菌PDA培養(yǎng)基（含有0.8%的瓊脂），混勻后倒入放置好牛津杯的平皿中，制成含有病原菌的PDA培養(yǎng)平板。將CM3發(fā)酵72 h后的發(fā)酵液于4 000 r/min離心25 min，收集上清液并用0.45 μm微孔濾膜過濾。取200 μL過濾后的發(fā)酵液注入小孔內。培養(yǎng)2 d后，測量抑菌圈直徑，并記錄試驗結果。

1.2.4 菌株CM3的培養(yǎng)基組分優(yōu)化按照1.2.2中的方法進行發(fā)酵，并測定發(fā)酵液的抑菌活性。

1.2.4.1 最適碳源的測定配制7種不同碳源的發(fā)酵液，分別以1%的可溶性淀粉、土豆淀粉、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、玉米粉、紅糖作為發(fā)酵液的不同碳源；1%的胰蛋白胨作為氮源。

1.2.4.2 最適氮源的測定配制8種不同氮源的發(fā)酵液，分別以1%的尿素、豆粕粉、魚粉、大豆蛋白胨、魚蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、牛肉浸膏作為發(fā)酵液的不同氮源，碳源為1.2.4.1試驗中測出的最適碳源，濃度為1%。

1.2.4.3 最適無機鹽的測定配制6種不同無機鹽的發(fā)酵液，分別以FeSO4·7H2O，NaCl，MgSO4· 7H2O，KCl，CuSO4·5H2O，CaCl2作為發(fā)酵液的不同無機鹽，其中，NaCl，MgSO4·7H2O，KCl的質量濃度為1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O，CuSO4·5H2O，CaCl2的質量濃度為0.1 g/L。1.2.4.1和1.2.4.2測定出的最適碳源和氮源濃度分別為1%。

1.2.4.4 單因素的最佳濃度確定試驗篩選的最佳碳源、氮源和無機鹽設定不同濃度配制成不同濃度碳源、氮源和無機鹽培養(yǎng)基進行發(fā)酵，測定不同濃度碳源、氮源和無機鹽發(fā)酵液的抑菌活性。碳源質量濃度為5，10，20，30，40 g/L；氮源質量濃度豆粕粉為2，5，10，15，20 g/L，魚粉為1.0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 g/L；無機鹽濃度為0.5，1，5，10，15 g/L。每個試驗重復3次，測定發(fā)酵液的抑菌圈。

1.2.4.5 培養(yǎng)基濃度正交試驗采用L9（34）對碳、氮源和無機鹽濃度的組合進行優(yōu)化。每個試驗重復3次，測定發(fā)酵液的抑菌圈。

1.2.5 菌株CM3的培養(yǎng)條件優(yōu)化對于菌株CM3，培養(yǎng)條件主要考察培養(yǎng)基的初始pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、接種量4個因素。

培養(yǎng)基的初始pH值：3，4，5，6，7，7.5，8，9，10；培養(yǎng)溫度：接種后分別在22，25，28，31，34，37，42℃條件下發(fā)酵；菌株CM3菌液接種后分別發(fā)酵12，24，36，48，60，72，84，96，108 h；接種量：將菌株CM3菌液按照1%，2%，5%，7%，10%和15%6個接種量接種。以上試驗均重復3次，測定發(fā)酵液的抑菌圈大小，根據(jù)結果在每種因素中選擇4個水平進行L16（44）正交試驗對培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，找出菌株CM3培養(yǎng)條件的最佳組合。

1.2.6 優(yōu)化結果的比較測定以最適碳源、氮源、無機鹽配制發(fā)酵培養(yǎng)基，在1.2.5中確定下來的最適培養(yǎng)條件下，對拮抗菌株CM3進行液體發(fā)酵培養(yǎng)，測定發(fā)酵液的抑菌活性，判斷優(yōu)化后的培養(yǎng)基對菌株CM3抑菌活性的影響。

2 結果與分析

2.1 CM3菌株的生長曲線測定

解淀粉芽孢桿菌CM3的生長曲線如圖1所示。由圖1可知，在接種后0～6 h為生長的延滯期；6～18 h進入對數(shù)期，菌體數(shù)量呈對數(shù)增長；20 h以后為菌株CM3的生長穩(wěn)定期。因此，通過該研究結果可以確定種齡18 h的培養(yǎng)液可作為種子液。此時發(fā)酵液有較高的菌體濃度，同時擁有旺盛的增殖能力，并且菌體生長狀態(tài)基本一致。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)基組分優(yōu)化

2.2.1 碳源的確定本試驗中初始發(fā)酵培養(yǎng)基為PD培養(yǎng)基，在單因素試驗中將其作為對照。

從圖2可以看出，當碳源是可溶性淀粉和玉米粉時，菌株CM3在培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)抗真菌活性物質的能力更強。相對其他碳源，玉米粉是一種復合碳源，不僅含有玉米淀粉，還含有少量氮源和其他生長因子，能夠促進抗真菌活性物質的產(chǎn)生；此外，玉米粉相對廉價易得，具有大量發(fā)酵的潛力，所以，選擇玉米淀粉作為最佳碳源。

2.2.2 氮源的確定從圖3可以看出，當大豆蛋白胨和尿素作為氮源時，菌株CM3產(chǎn)生抑菌物質的能力較弱；當魚蛋白胨作為氮源時，菌株CM3的抑菌圈最大；而菌株CM3在其余幾種氮源的培養(yǎng)基中，抑菌能力相似，相比較而言，豆粕粉的成本較低，是生產(chǎn)中較為常見的氮源。但是考慮到要盡可能提高菌株CM3的抑菌能力，可以在發(fā)酵液中適當添加一些其他氮源，例如可以添加適量的魚粉用來提高抑菌能力。

2.2.3 無機鹽選擇不同種類的無機鹽對菌株CM3的抑菌活性影響不大，基本都與對照（發(fā)酵液采用玉米粉、豆粕粉和魚粉作為碳源和氮源）一致（圖4）。綜合考慮，可以選擇鈉離子作為無機鹽添加到菌株CM3的發(fā)酵液中。

2.2.4 碳源、氮源和無機鹽的最佳濃度確定從圖5，6，7，8可以看出，玉米粉采用1%，2%，3%（10，20，30 g/L）3個水平進行正交試驗，豆粕粉選擇0.5%，1%，1.5%（5，10，15 g/L）3個水平進行正交試驗，魚粉采用0.25%，0.5%，0.75%（2.5，5，7.5 g/L）3個水平進行正交試驗，鈉鹽選取0.1%，0.5%，1%（1，5，10 g/L）3個水平進行正交試驗比較合理。

2.2.5 培養(yǎng)基濃度正交試驗本試驗采用正交試驗法來找出不同成分的最佳組合，從而確定培養(yǎng)菌株CM3的最佳培養(yǎng)基（表1）。

通過極差分析可知，RB＞RA＞RC＞RD，4種營養(yǎng)成分改變對抗菌物質產(chǎn)量的影響大小依次為豆粕粉＞玉米粉＞魚粉＞鈉鹽，即豆粕粉的含量變化對菌株CM3產(chǎn)生抗菌物質的影響較大，而無機鹽含量變化對產(chǎn)抗菌物質的影響相對較小。從表1可以看出，A2B1C2D1為最佳搭配，即玉米粉2%，豆粕粉0.5%，魚粉0.5%，鈉鹽0.1%。方差分析結果顯示，豆粕粉對于菌株活性的影響顯著（表2）。

表1 L9（34）正交試驗設計結果

表2 L9（34）正交試驗結果方差分析

按照最佳搭配A2B1C2D1進行發(fā)酵液抑菌試驗，選取正交試驗中抑菌圈最大的2個組合一起進行比較，結果如表3所示。由表3可知，盡管最優(yōu)組合的抑菌圈大小較其他處理提高的比例很小，但是最優(yōu)組合A2B1C2D1確實比其他2個組合A2B1C2D3和A1B1C1D1的抑菌活性大；比PD培養(yǎng)基的抑菌圈提高了20.3%。

表3 菌株CM3在不同組合培養(yǎng)基中的抑菌活性

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)基初始pH培養(yǎng)基不同初始pH對菌株CM3的抑菌活性影響較大。從圖9可以看出，在pH值6.5～8.0時抑菌活性較好，抑菌圈大小基本在27～30 mm，表明該pH值范圍最適合菌株CM3抑菌活性物質的產(chǎn)生。因此，選擇pH值6.5，7.0，7.5，8.0進行正交試驗。

2.3.2 培養(yǎng)溫度從圖10可以看出，溫度對于菌株CM3抑菌活性的影響不大，綜合考慮，選擇25，28，31，34℃這4個溫度進行正交試驗。

2.3.3 培養(yǎng)時間由圖11可知，菌株CM3的培養(yǎng)時間到24 h后，即進入穩(wěn)定生長期（20 h）4 h后開始出現(xiàn)明顯的抑菌圈，在24～48 h內，發(fā)酵液的抑菌活性逐漸上升，當培養(yǎng)時間在48～84 h時，抑菌活性達到最大并保持穩(wěn)定，超過84 h后抑菌活性開始明顯下降。所以，結合菌株CM3的生長曲線，選取48，60，72，84 h這4個水平進行正交試驗。

2.3.4 接種量從圖12可以看出，當接種量為2%時，菌株CM3的抑菌活性就能達到最大值，之后隨著接種量的增加，菌株的抑菌活性并沒有提高，基本保持穩(wěn)定；當接種量達到15%，抑菌活性開始降低，抑菌圈大小開始下降。因此，接種量選擇2%， 5%，7%，10%這4個水平進行正交試驗。

2.3.5 培養(yǎng)基濃度正交試驗本試驗使用正交試驗法以找出菌株CM3培養(yǎng)條件的最佳組合，從而確定培養(yǎng)菌株CM3抑菌活性最好的生長條件（表4）。

表4 L16（44）正交試驗設計及結果

通過極差分析可知，RD＞RC＞RB＞RA，4個培養(yǎng)條件中，對抑菌活性影響最大的是接種量，其次依次是培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間，培養(yǎng)基初始pH的影響最小。從表4可以看出，A2B1C3D2為最佳搭配，即菌株CM3的最佳培養(yǎng)條件為：初始pH值7，培養(yǎng)時間48 h，培養(yǎng)溫度為31℃，接種量為5%。方差分析結果顯示，4個培養(yǎng)條件對于抑菌活性的影響都顯著，接種量的影響最大（表5）。

表5 L16（44）正交試驗方差分析

2.3.6 優(yōu)化結果的比較測定優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方為：玉米粉2%，豆粕粉0.5%，魚粉0.5%，鈉鹽0.1%；培養(yǎng)條件為：初始pH值7，培養(yǎng)時間48 h，培養(yǎng)溫度31℃，接種量5%。由表6可知，菌株CM3的抑菌活性在優(yōu)化后的培養(yǎng)基（命名為YDY培養(yǎng)基）中確實得到了提高，抑菌圈比PD培養(yǎng)基提高了22.7%；YDY抑菌圈遠遠大于常規(guī)培養(yǎng)基，比NB培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基分別提高了33.1%和94.5%。

表6 菌株CM3在不同培養(yǎng)基中的抑菌活性

3 討論

有研究表明，不同的培養(yǎng)條件、不同的碳源、氮源和無機鹽以及組分之間的不同配比，都會對拮抗菌的抑菌活性造成較大的影響[20-24]。本試驗通過搖瓶發(fā)酵對菌株CM3的培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件進行了初步研究，采用牛津杯抑菌法對菌株的抑菌活性進行檢測。先通過單因素試驗確定了菌株CM3的最佳碳源、氮源和無機鹽，在選擇碳、氮源時，已經(jīng)考慮到未來生產(chǎn)成本問題，經(jīng)過綜合考量，選擇了玉米粉、豆粕粉和魚粉、鈉鹽，最后得到的最佳培養(yǎng)基成分為：玉米粉2%，豆粕粉0.5%，魚粉0.5%，鈉鹽0.1%，其中，只有豆粕粉的含量變化對菌株CM3抑菌活性影響顯著，說明菌株CM3更加需要遲效碳源，這與張冬冬等[25]和孔少元等[26]的研究結果類似。更重要的玉米粉和豆粕粉這2種天然原料的選擇符合了降低生產(chǎn)成本的需要，而魚粉也是飼料中常用的一種成分，可以說菌株CM3培養(yǎng)基組分的成本較低，具備了進行規(guī)模生產(chǎn)的要素。

同樣，選擇培養(yǎng)基的初始pH、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、接種量4個因素對菌株CM3的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，得到了最優(yōu)培養(yǎng)條件：初始pH為7，培養(yǎng)時間為48 h，培養(yǎng)溫度為31℃，接種量為5%，這4個因素對菌株CM3抑菌活性影響均為顯著，其中影響最大的是接種量，說明菌株CM3的培養(yǎng)條件對其分泌產(chǎn)生抑菌物質更為關鍵。pH值為7說明菌株CM3更適合中性的培養(yǎng)基，偏酸或者偏堿都會對抑菌活性造成影響，更加適合在土壤中定殖[27-28]。從培養(yǎng)時間上分析發(fā)現(xiàn)，菌株CM3發(fā)揮抑菌作用的時間較短，與其他菌株相比這是一個較大的優(yōu)勢，可以更早地發(fā)揮功能[29]。一般來說，微生物在土壤表層以下10～20 cm處生存力旺盛，越到表層由于溫度越高越不易存活，菌株CM3的最優(yōu)溫度比一般細菌要高些，說明其在土壤中的存活能力更強，存活的范圍更加廣泛，適應能力更好些。

優(yōu)化后的培養(yǎng)基（YDY培養(yǎng)基）確實提高了菌株CM3的抑菌活性，抑菌圈增加到了37.58 mm，較之前提高了22.7%，并且與其他常規(guī)培養(yǎng)基相比，提高效果十分顯著，為利用菌株CM3進行生物防治奠定了堅實的基礎[30]。

菌株CM3是一株生長穩(wěn)定、抑菌活性良好的拮抗菌，希望能夠將其開發(fā)成微生物制劑推廣到生產(chǎn)實踐中，探索其大規(guī)模生產(chǎn)的條件就是下一步的重點。本研究已經(jīng)考慮到了生產(chǎn)成本的問題，但若是要實際生產(chǎn)還需要進行大量的研究，得到更優(yōu)和更廉價的發(fā)酵條件，才能降低成本、便于更好地推廣應用。

4 結論

本研究結果表明，菌株CM3對大麗輪枝菌有良好的抑制作用。經(jīng)過優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分為：玉米粉2%，豆粕0.5%，魚粉0.5%，NaCl 0.1%；最佳發(fā)酵條件為：pH值7.0，接種量5%，培養(yǎng)時間48 h，培養(yǎng)溫度31℃。在優(yōu)化后，拮抗細菌CM3的發(fā)酵液抑菌圈直徑可達到37.58 mm，較優(yōu)化前提高了22.7%。

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Optimization of Medium and Fermentation Condition for Bacillus amyloliquefaciens CM3

CHENZhe，LIANGHong，HUANGJing，ZHAOJia

（Research Center of Biotechnology，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

The study aims to optimize the fermentation conditions of Bacillus amyloliquefaciens CM3 and determine the suitable fermentation medium composition.The strain CM3 could inhibit the activity of Verticillium dahliae,so the inhibition zone diameter was used as index.The suitable carbon source,nitrogen source,inorganic salts,medium initial pH,inoculum,incubation time and culture temperature were screened by single factor test.Then medium composition and culture conditions were optimized by orthogonal design experiment.The results showed that the optimal fermentation conditions were as follows:corn flour 2%,soybean 0.5%,powder of fish 0.5%,NaCl 0.1%,pH 7.0,inoculum 5%,culture time 48 h,culture temperature 31℃.Under these conditions,the inhibition zone diameter of bacterial CM3 increased to37.58 mm,which was improved by22.7%.

Bacillus amyloliquefaciens;medium optimization;orthogonal design

S476

A

1002-2481（2016）11-1577-07

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.11.01

2016-06-29

山西省科技自主創(chuàng)新能力提升項目（2015zzcx-22）；山西省農(nóng)業(yè)科學院科技攻關項目（YGG1414）

陳哲（1984-），女，山西太原人，助理研究員，碩士，主要從事拮抗菌抑菌物質的研究工作。