■朱利民 林 鵬 張 劍

（武漢輕工大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北武漢 430023）

棉酚是一種多酚類黃色化合物，存在于棉花植物及其加工制品中。棉殼、棉粕、棉仁、棉油等都含有該類物質(zhì)。棉酚按其存在的形式可分為游離棉酚和結(jié)合棉酚兩種。結(jié)合棉酚由于其活性基團(tuán)醛基被封閉，在動物的消化道內(nèi)不被吸收，無毒。游離棉酚分子結(jié)構(gòu)中的活性基團(tuán)醛基未被其它物質(zhì)“封閉”，在動物體內(nèi)能與Fe2+、各種功能蛋白質(zhì)、酶結(jié)合，導(dǎo)致動物生理功能紊亂，引起雄性動物不育，甚至死亡。游離棉酚含量大小直接關(guān)系到棉油品質(zhì)及配合飼料的質(zhì)量。

游離棉酚的測定方法有紫外分光光度法[1-2]、苯胺法[3]、間苯三酚法[4-5]、高效液相色譜法[6]等。由于天然產(chǎn)物成分復(fù)雜，許多化合物在紫外區(qū)對游離棉酚測定有干擾，使紫外分光光度法測定結(jié)果偏高。苯胺法、間苯三酚法基于游離棉酚與苯胺、間苯三酚作用形成一種新化合物在可見光區(qū)有較強(qiáng)吸收，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對游離棉酚定量。可見分光光度法測得的結(jié)果實(shí)質(zhì)為游離棉酚及其衍生物總量，其選擇性明顯高于紫外分光光度法。高效液相色譜法基于物質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)不同將各物質(zhì)分離，然后通過檢測器定量。該法能反映出樣品中游離棉酚的真實(shí)質(zhì)量，該法測得的游離棉酚結(jié)果要低于紫外、可見分光光度法。事實(shí)上，游離棉酚的衍生物也具有毒性。因此，可見分光光度法能真實(shí)的反映出游離棉酚的毒性及其含量。

本文比較了間苯三酚法和苯胺法對棉粕和棉油樣品中的游離棉酚定量結(jié)果，通過標(biāo)準(zhǔn)加入法計算兩種分析方法的回收率，并探討了兩種分析方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

試劑：98%醋酸棉酚（AR,西安玉泉生物科技有限公司）；苯胺（AR，天津天力化學(xué)試劑有限公司），使用前用鋅粉充分振蕩，回流，收集180℃餾分，置于棕色瓶中保存；3-氨基-1-丙醇（CP,上海遠(yuǎn)帆助劑廠）；異丙醇（AR,天津大茂化學(xué)試劑廠）；正己烷（AR,天津科密歐化學(xué)試劑）；二水間苯三酚（AR，英國進(jìn)口分裝）；丙酮（AR）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

儀器：7200分光光度計(UNIC公司)、恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）、電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 間苯三酚法

原理：在6.6 mol/l的HCl介質(zhì)中，芳香醛與間苯三酚作用生成紫紅色化合物，在550 nm處有最大吸收，其顏色深淺與芳香醛含量呈正比，據(jù)此定量。

1 mg/ml游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.028 5 g醋酸棉酚，用70%的丙酮水溶液溶解，定容至25 ml。即為母液。

0.02 mg/ml游離棉酚工作液：準(zhǔn)確移取母液1 ml，用70%丙酮水溶液稀釋，定容至50 ml，即為工作液。

顯色劑：將二水間苯三酚1 g，溶于16.6 ml濃鹽酸，用95%乙醇定容至100 ml，混勻。轉(zhuǎn)入棕色瓶，置于4℃冰箱保存，備用。

游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確吸取游離棉酚工作液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 ml，依次用70%丙酮水溶液定容至1.00 ml，加顯色劑2 ml，搖勻。于55℃恒溫水浴中5 min，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入1 cm比色皿，以未加游離棉酚試樣為空白，于550 nm處測吸光度（見表1）。以吸光度對游離棉酚質(zhì)量作圖（見圖1），其線性回歸方程為：y=0.018 8x-0.015 5，R2=0.995 3。樣品測定，按鄭清梅等[4]的優(yōu)化方法進(jìn)行。

表1 不同濃度棉游離酚標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度

棉粕樣品：準(zhǔn)確稱取經(jīng)機(jī)械粉碎后且過100目篩的棉粕樣品1 g（精確到0.1 mg），置于具塞錐形瓶中，加入50 ml 70%丙酮水溶液，蓋上瓶塞，置于36℃的恒溫振蕩器中振蕩2 h。以中速濾紙過濾。取濾液1 ml，加入2 ml顯色劑，混勻，于55℃恒溫水浴中5 min，然后比色測定。每組樣品重復(fù)試驗(yàn)3次，取平均值。根據(jù)游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出棉粕樣品中游離棉酚含量。

圖1 游離棉酚質(zhì)量與吸光度的關(guān)系

棉油樣品：準(zhǔn)確移取5 ml棉油，加入45 ml 70%丙酮水溶液，后續(xù)操作同棉粕樣品。

標(biāo)準(zhǔn)加入法：分別取棉油樣品提取液1.00、0.96、0.92 ml,用含400 μg/ml游離棉酚的70%丙酮溶液補(bǔ)齊至1.00 ml,加入2 ml顯色劑，混勻。后續(xù)操作與樣品測定方法相同。

1.2.2 苯胺法

原理：在3-氨基-1-丙醇存在下，用異丙醇與正己烷混合溶劑（6∶4，v/v）提取游離棉酚，游離棉酚與苯胺作用生成苯胺棉酚，該化合物在440 nm處有最大吸收，其顏色深淺與游離棉酚含量呈正比，據(jù)此定量。

1 mg/ml游離棉酚儲備液：準(zhǔn)確稱取醋酸棉酚0.028 5 g，用溶劑A（470 ml混合溶劑、1 ml 3-氨基-1-丙醇、4 ml冰醋酸、25 ml超純水）溶解，并定容至25 ml。

100 μg/ml游離棉酚工作液：取5.00 ml游離棉酚儲備液，用溶劑A定容至50.00 ml。

游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確吸取100 μg/ml游離棉酚工作液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40 ml各2份，用溶劑A定容至5.00 ml。其中一份加入經(jīng)鋅粉還原并新蒸餾得到的苯胺餾分1 ml，沸水浴30 min后，冷卻至室溫，用混合溶劑（異丙醇∶正己烷=6∶4）定容至12.5 ml，靜置1 h；另一份直接用混合溶劑定容至12.5 ml，充當(dāng)相應(yīng)參比溶液。用1 cm比色皿在440 nm處測定各自吸光度(表2)。以吸光度對游離棉酚質(zhì)量作圖（見圖2），其線性回歸方程為：y=80.112x+0.035 9；R2=0.999 4。

樣品測定，按GB 13086—91方法，略作改動，具體操作如下：

表2 不同濃度游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度值

棉粕樣品：準(zhǔn)確稱取經(jīng)機(jī)械粉碎后且過100目篩的棉粕樣品1 g（精確到0.1 mg），置于具塞錐形瓶中，加入50 ml溶劑A，蓋上瓶塞，置于振蕩器中振蕩1 h，以提取棉粕中的游離棉酚。以中速濾紙過濾，取濾液5 ml兩份，后續(xù)操作同游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個樣品平行試驗(yàn)3次，取平均值。根據(jù)線性回歸方程計算出棉粕樣品中游離棉酚含量。

圖2 吸光度與游離棉酚質(zhì)量關(guān)系

棉油樣品：準(zhǔn)確移取10.00 ml棉油，用40 ml溶劑A提取，提取方法以及后續(xù)操作與棉粕樣品相同。

棉粕樣品中游離棉酚的計算公式如下：

式中：X——棉粕或棉油中游離棉酚含量(mg/kg)；

A——吸光度；

ms——稱取試樣的質(zhì)量(g)；

a——質(zhì)量吸光系數(shù)，本試驗(yàn)為80.112 L/(cm·g)，與GB 13086—1991中的62.5 L/(cm·g)有別；

b——比色皿的厚度(1 cm)；

c——游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)曲線中的截距，本試驗(yàn)為0.035 9；

V1——提取棉粕樣品中游離棉酚所用溶液總體積，本試驗(yàn)為50 ml；

V2——測定游離棉酚所取濾液的體積，本試驗(yàn)為5 ml；

V3——樣品測定時最后定容體積，本試驗(yàn)為12.5 ml；

106——將單位g/g換算為mg/kg。

對于棉油樣品，其所含游離棉酚的計算式與棉粕樣品基本相同，只是將稱取試樣質(zhì)量ms換成移取試樣體積V；游離棉酚含量的單位X：mg/kg轉(zhuǎn)換成mg/l；106：將單位g/ml換算為mg/l。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品中游離棉酚的兩種分析方法結(jié)果(見表3)

表3 不同樣品兩種方法的游離棉酚測定結(jié)果

表3列出了各種樣品的苯胺法和間苯三酚法測定結(jié)果。對于同一樣品，間苯三酚法測得的游離棉酚結(jié)果普遍高于苯胺法。以江西棉粕分析結(jié)果為例，苯胺法為863.0 μg/g，間苯三酚法為1 006.5 μg/g。這可能與提取樣品中游離棉酚所用溶劑及提取時間有關(guān)。美國油脂化學(xué)家協(xié)會（AOCS）明確規(guī)定“凡能被70%丙酮水溶液提取的棉酚及其衍生物統(tǒng)稱游離棉酚”?？梢姡?0%丙酮提取樣品中游離棉酚較為徹底，而使用異丙醇和正己烷為溶劑提取樣品中游離棉酚的效果要差一些。此外，苯胺法（GB 13086—1991）提取樣品中游離棉酚的時間偏少，也是游離棉酚溶解不完全，導(dǎo)致測定結(jié)果偏低的原因之一。

通過表3還能得到如下結(jié)論：棉油中的游離棉酚含量遠(yuǎn)低于棉粕；江西生產(chǎn)的棉粕中游離棉酚含量明顯高于湖北棉粕。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)加入法對間苯三酚法測定結(jié)果的影響(見表4)

表4描述了標(biāo)準(zhǔn)加入法對間苯三酚法測定結(jié)果的影響。無論是棉粕樣品，還是棉油樣品，采用間苯三酚法測定樣品中的游離棉酚回收率均在100%～108.8%之間，都能較好地反映樣品中游離棉酚的實(shí)際含量。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)加入法對苯胺法測定結(jié)果的影響（見表5）

由表5可知，苯胺法測定游離棉酚含量時，標(biāo)準(zhǔn)加入量的回收率與原樣品中游離棉酚含量有關(guān)。當(dāng)棉粕樣品中游離棉酚含量在800～900 μg/g時，標(biāo)準(zhǔn)加入量的回收率為77.12%～82.32%；對于游離棉酚含量較低（13.75 μg/ml）的棉油樣品，標(biāo)準(zhǔn)加入量的回收率與上述樣品相近；當(dāng)棉粕樣品中游離棉酚含量在400～600 μg/g時，標(biāo)準(zhǔn)加入量的回收率為93.39%～104.04%?？梢?，苯胺法測定樣品中游離棉酚時，游離棉酚含量在400～600 μg/g，回收率才與真實(shí)值更接近，分析誤差??；而樣品游離棉酚含量過高或過低，均會導(dǎo)致測量結(jié)果偏低。

表4 標(biāo)準(zhǔn)加入法對間苯三酚法測定結(jié)果的影響

表5 標(biāo)準(zhǔn)加入法對苯胺法測定結(jié)果的影響

2.4 兩種測定方法的比較

試劑的穩(wěn)定性。苯胺易氧化變質(zhì)。采用苯胺法開展試驗(yàn)時，應(yīng)先檢驗(yàn)顯色劑苯胺是否變質(zhì)，檢驗(yàn)過程費(fèi)時。使用剛純化的苯胺開展試驗(yàn)，試劑誤差小（A=0.009），放置時間過長，試劑誤差越來越大。當(dāng)吸光度≥0.022，苯胺應(yīng)作純化處理。即先經(jīng)鋅粉還原，再回流蒸餾，收集180℃餾分。每純化一次苯胺，即使置于棕色瓶中4℃冰箱保存，使用時間也不宜超過3 d。間苯三酚試劑也極易變質(zhì)，一般現(xiàn)配現(xiàn)用。

試劑的消耗與操作。每完成一個樣品測定，苯胺法均需在相同條件下準(zhǔn)備一份不加苯胺的對照樣品，操作繁瑣，且沸水浴完成后均需要用混合溶劑將待測樣品定容至12.5 ml或25.0 ml，試劑消耗量大；間苯三酚法，樣品測定時，只需準(zhǔn)備空白樣品一份，待測液也只需要1 ml，試劑消耗量小，且操作比苯胺法簡單。

反應(yīng)條件與時間。間苯三酚法的反應(yīng)條件溫和，待測液只需在55℃作用5 min，即可測樣，勿需漫長時間的等待；苯胺法，需在沸水浴加熱30 min，待反應(yīng)液冷卻后，還需定容和長時間的靜置。整個試驗(yàn)操作下來，間苯三酚法比苯胺法耗時少。

測定結(jié)果與回收率。對于相同樣品，間苯三酚法得到的結(jié)果比苯胺法高。這是因?yàn)楸崛悠分械挠坞x棉酚比正己烷和異丙醇更完全。另外，棉粕或棉油樣品中也有一些其他的芳醛化合物與間苯三酚作用，導(dǎo)致間苯三酚法測定結(jié)果偏高。采用苯胺法測樣時，每份樣品均需設(shè)置一個參比，可以有效地排除不同加入量的試劑對測定吸光度的影響。

就回收率而言，苯胺法只有在樣品提取液中游離棉酚含量在一定劑量范圍內(nèi)才能獲得理想的回收率；而間苯三酚法對所有含游離棉酚樣品的回收率均在試驗(yàn)誤差范圍內(nèi)。

3 結(jié)論

綜上所述，無論從試劑用量、操作時間，還是從標(biāo)準(zhǔn)加入量的回收率來看，間苯三酚法均優(yōu)于苯胺法。因此，測定棉粕或棉油樣品中的游離棉酚，選用間苯三酚法不失為一種簡便且十分可行的分析方法。