■郭文浚 楊世平 劉慧玲王成桂 孫成波

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江 524088）

墨吉明對蝦(Fenneropenaeus merguiensis)隸屬于十足目(Decapoda)、枝鰓亞目(Dendrobranchiata)、對蝦科(Penaeidae)、明對蝦屬(Fenneropenaeus)，遍布在亞洲和澳大利亞的熱帶及亞熱帶海域，在我國主要分布于東南沿海等海域。其食性較雜，生長周期較短，具有肉質(zhì)鮮美、個體較大、經(jīng)濟(jì)效益較高和生長迅速等特點，也是中國傳統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)對蝦品種[1]。21世紀(jì)70年代開始，一些機(jī)構(gòu)開展了墨吉明對蝦幼體培育、疾病防治等研究。但由于凡納濱對蝦引進(jìn)后迅速形成了規(guī)模化養(yǎng)殖，影響墨吉明對蝦的養(yǎng)殖規(guī)模和研究進(jìn)展。近年來，由于凡納濱對蝦養(yǎng)殖中病害的暴發(fā)，影響了對蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，墨吉明對蝦的研究再次被關(guān)注，包括養(yǎng)殖生態(tài)、病害防治、胚胎發(fā)育、幼體發(fā)育、代謝等研究[2-7]。

關(guān)于水生經(jīng)濟(jì)動物消化酶的研究較多，如中國龍蝦(Panulirus stimpsoni)[8]、凡納濱對蝦(Litopenaeus van?namei)[9-11]、中國明對蝦(P.chinensis)[12]、日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicus)[12]、虎紋蛙(Hoplobatrachus ru?gulosus)[13]等，說明消化酶的研究在基礎(chǔ)研究中的重要性。鑒于有關(guān)墨吉明對蝦消化酶的資料尚缺，本文研究不同pH值、溫度和鹽度條件下，墨吉明對蝦肝胰臟和腸道中淀粉酶和蛋白酶的活力變化規(guī)律及最適條件，為墨吉明對蝦人工養(yǎng)殖和配合飼料的開發(fā)提供依據(jù)，促進(jìn)墨吉明對蝦的規(guī)?；B(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

墨吉明對蝦[體長（10.0±0.5）cm]采自廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物研究基地，選取健康無損傷的活潑個體，置于預(yù)先充氧的桶內(nèi)暫養(yǎng)，并保持24 h不投喂飼料，使其處于長時間不進(jìn)食狀態(tài)，令腸道內(nèi)食物殘渣基本排出至無殘渣狀態(tài)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

隨機(jī)選取50尾對蝦，將活體置于冰浴的培養(yǎng)皿內(nèi)解剖，取出其肝胰臟，隨后取出腸道并用預(yù)冷蒸餾水（約4℃）將腸道內(nèi)未能排出的殘渣沖洗干凈，用吸水紙分別吸干表面多余的水分。然后將50尾蝦的肝胰臟、腸道樣本分別混合在一起，接著，按照其質(zhì)量加入9倍體積（m/V）預(yù)冷蒸餾水，用玻璃勻漿器在冰浴中勻漿。充分勻漿后，將勻漿液置于5 000×g、4℃離心機(jī)中離心15 min，最后取上清液（即酶粗提取液）置于-20℃冰箱中保存待測酶活力。

1.2.2 酶活力的測定

采用黃耀桐等[14]方法改良后對蛋白酶活力進(jìn)行測定，而淀粉酶活力則采用榮俊等[15]方法進(jìn)行改良測定。酶活力則統(tǒng)一用酶的比活力來表示，即酶的比活力=酶活力單位/該粗酶液中蛋白質(zhì)的含量（U/mg prot.）。蛋白酶與淀粉酶測定均設(shè)置pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5的10個pH值梯度，溫度為25、30、35、40、45、50、55 ℃和60 ℃的8個溫度梯度，鹽度為0、10、20、30、40、50、60和70的8個梯度。總蛋白質(zhì)含量測定，采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒（南京建成生物科技有限公司）按說明書操作。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。再用EXCEL 2010和SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差分析和Ducan's法多重比較，P＜0.05時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pH值對墨吉明對蝦消化酶的影響（見表1）

表1 pH值對墨吉明對蝦淀粉酶和蛋白酶的影響（U/mg prot.）

如表1所示，在試驗設(shè)計pH值范圍內(nèi)，墨吉明對蝦肝胰臟和腸道中的蛋白酶和淀粉酶的比活力均隨著pH值的升高呈現(xiàn)先升高后下降的的趨勢，在pH值6.0時，不同組織中兩種酶的比活力達(dá)到最大值。因此，認(rèn)為兩種酶的最適pH值都是6.0，屬于偏弱酸性酶。從消化酶的比活力來看，在相同條件下，肝胰臟和腸道中蛋白酶的比活力相近，而在肝胰臟中淀粉酶的比活力高于腸道中。

2.2 溫度對墨吉明對蝦消化酶的影響（見表2）

表2 溫度對墨吉明對蝦淀粉酶和蛋白酶的影響（U/mg prot.）

由表2可知，在試驗設(shè)計溫度范圍內(nèi)，墨吉明對蝦肝胰臟和腸道中的蛋白酶和淀粉酶的比活力均隨著溫度的升高呈先升高后下降的趨勢。兩種組織中蛋白酶的比活力的最大值出現(xiàn)在55℃時，而兩種組織中淀粉酶的比活力的最大值出現(xiàn)在40～45℃時。在相同溫度條件下，肝胰臟中淀粉酶的比活力高于腸道中的酶活力，達(dá)腸道中的3.52～4.88倍。兩種消化酶的最適溫度都顯著高于墨吉明對蝦正常的棲息水溫，符合水生動物消化酶特性。

2.3 鹽度對墨吉明對蝦消化酶的影響（見表3）

表3 鹽度對墨吉明對蝦淀粉酶和蛋白酶的影響（U/mg prot.）

由表3可知，在鹽度為0～70范圍內(nèi)，隨著鹽度的升高兩種組織中的消化酶均出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在鹽度40時，兩種組織中的蛋白酶的比活力均顯著高于其它鹽度條件下的比活力（P＜0.05），而淀粉酶的比活力卻是在鹽度10條件下顯著高于其它鹽度條件下（P＜0.05）。

3 討論

3.1 pH值對墨吉明對蝦消化酶的影響

pH值是影響酶活力的一個因素，主要是通過改變蛋白酶的構(gòu)象使其失活，或者影響酶分子側(cè)鏈上極性基團(tuán)的解離從而使酶活性中心結(jié)構(gòu)發(fā)生變化影響產(chǎn)物的生成[16]。本研究結(jié)果表明，pH值對墨吉明對蝦消化酶活力都有影響，在試驗設(shè)計pH值范圍內(nèi)均呈現(xiàn)消化酶活力先升高后降低的趨勢。

大多數(shù)生物學(xué)者認(rèn)為海洋甲殼動物消化酶最適pH值范圍大約在5.0～7.9[17]，與本試驗測得結(jié)果相近。本試驗測得墨吉明對蝦肝胰臟和腸道中蛋白酶的最適pH值都是6.0，屬于偏弱酸性的酶，與黃燕華等[9]在凡納濱對蝦上的研究結(jié)果相似，與姜永華[8]等研究中國龍蝦、胡毅等[17]研究三疣梭子蟹(Portunus tritu?berculatus)時，發(fā)現(xiàn)的最適pH值約為4.0左右有差異，這可能是物種之間的差異所致。李廣麗等[18]測定的中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)以及姜鶴等[19]測得大連蝦蛄(Oratosquilla oratoria)的數(shù)據(jù)也進(jìn)一步證實淀粉酶在偏弱酸性條件下最適合促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。研究發(fā)現(xiàn)，不同物種的消化酶最適pH值可能不同，這可能與不同物種的生活習(xí)性、生活環(huán)境的不同，以及自身遺傳物質(zhì)不同而形成不同代謝方式，使得自身內(nèi)部酶的性質(zhì)也形成差異，甚至不同生長發(fā)育階段其消化酶活力也會發(fā)生變化[17]。

3.2 溫度對墨吉明對蝦消化酶的影響

眾所周知，酶活力會受到溫度影響。對蝦是變溫動物，水溫是決定對蝦體溫的最主要因素，可以直接影響到對蝦體內(nèi)消化酶活力。溫度影響酶促反應(yīng)速率主要是通過在適當(dāng)溫度范圍內(nèi)，溫度會使活化分子增多從而加快酶促反應(yīng)，其次是因為大部分酶本質(zhì)為蛋白質(zhì)，會隨著溫度升高而逐漸變性甚至完全失活而影響酶促反應(yīng)的效率[16]。

本試驗測得墨吉明對蝦肝胰臟和腸道中蛋白酶的最適溫度都為55℃，與沈文英等[10]研究的凡納濱對蝦最適溫度50～60℃，吳根等[12]研究的中國明對蝦、日本囊對蝦的最適溫度為45～55℃的結(jié)果較為相近。淀粉酶最適溫度測得為40～45℃，高于姜鶴等[19]在研究大連蝦蛄的最適溫度為30℃，也高于沈文英等[10]研究的凡納濱對蝦最適溫度為30～35℃，這可能是墨吉明對蝦生活環(huán)境溫度較高，受到環(huán)境長期影響所致。有實驗表明，墨吉明對蝦適合生長溫度為26～27℃[20]，墨吉明對蝦肝胰臟和腸道的兩種消化酶的最適溫度均比棲息水溫要高，尤其是蛋白酶。在雜色鮑(Hali?otis diversicolor)[21]、駝背鱸(Cromileptes altivelis)[22]和海蜇(Rhopilema esculenta)[23]等常見的水生動物中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)論。消化酶的比活力是在實驗室規(guī)定條件下進(jìn)行測定，受到反應(yīng)時間等的限制，而實際上蝦體內(nèi)消化酶起作用時間要更長，同時，其分泌量會受到外界溫度影響。因此，和最適pH值一樣，消化酶的最適溫度只有在一定條件下才有生物學(xué)上的意義。

3.3 鹽度對墨吉明對蝦消化酶的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶最適鹽度為40，鹽度為40～60時，蛋白酶活性都有顯著差異(P＜0.05)。淀粉酶最適鹽度為10，鹽度為0～60時，淀粉酶都有差異。從兩種酶活力變化來看，說明蛋白酶對于鹽度變化耐受性更好并且活力相對比較穩(wěn)定，而淀粉酶受到鹽度變化的影響更大，可能與蛋白酶和淀粉酶的結(jié)構(gòu)有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。李希國等[24]研究黃鰭鯛（Sparus latus）幼魚消化酶活性時，也發(fā)現(xiàn)蛋白酶的最適鹽度高于淀粉酶。

4 結(jié)論

蛋白酶和淀粉酶最適pH值為6.0，最適溫度為55℃和40～45℃，最適鹽度為40和10。