■許錦華

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，福建福州 350002）

砷是一個與環(huán)境和人體健康關系密切的有害元素，砷的生物毒性不僅與其含量有關，與其存在形態(tài)更是密切相關，不同形態(tài)的砷化合物的毒性差異很大[1-3]。亞砷酸鹽[As(Ⅲ)]、砷酸鹽[As(Ⅴ)]、單甲基砷酸[MMA]、二甲基砷酸[DMA]和砷甜菜堿(AsB)是自然界常見的砷形態(tài)。它們的毒性排序為：As(Ⅲ)＞As(Ⅴ)＞MMA＞DMA，砷甜菜堿常被認為是無毒的。最近的研究顯示，MMA和DMA可能會誘發(fā)DNA被氧化，其毒性可能會超過無機砷[4]。它們易在食用者或飼用者體內(nèi)積累[5]，而且DMA又被認為是潛在的致癌因子。

有機砷作為動物抗病原微生物和促生長類飼料添加劑，對于提高畜禽的飼料利用率、增強抗病能力有著明顯作用，被普遍添加于飼料中。無機砷雖然在現(xiàn)代動物營養(yǎng)學研究中被認為和硒、碘一樣，是動物機體的一種必需元素，但卻是一種有毒有害元素，對畜禽動物的危害性很大，因此飼料衛(wèi)生標準中對無機砷有嚴格的限制要求，即≤3.0 mg/kg。

目前測定飼料無機砷的方法主要是用氫化物原子熒光分光光度計進行測定[6]。該方法測出來的無機砷含量往往會偏高，這是由于在分離提取過程中部分有機砷也會被提取出來，在鹽酸長時間浸泡過程中，導致砷形態(tài)的轉化；無機砷測定過程中部分有機砷也會產(chǎn)生氫化物。為了解決上述問題，近年來，色譜聯(lián)用技術被廣泛應用于砷元素形態(tài)分析。國內(nèi)外常采用高效液相色譜（HPLC）與電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）、原子熒光光譜（AFS）等[7-9]技術分析砷形態(tài)化合物。ICP-MS具有靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬等優(yōu)點，近年來已成為重要的元素檢測分析手段。HPLC與ICP-MS聯(lián)用技術已經(jīng)成為元素形態(tài)分析最常用和有效的方法之一，對于砷形態(tài)分析而言，在靈敏度、分離效能方面最具優(yōu)勢。

本文采用HPLC-ICP-MS進行五種砷形態(tài)的分離分析，采用水為提取劑，在封閉環(huán)境下加熱提取，針對飼料樣品基質(zhì)復雜的問題，采用C18小柱凈化，實現(xiàn)了飼料樣品五種砷形態(tài)的準確測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Agilent 1100高效液相色譜（安捷倫科技有限公司）；Agilent 7500a型電感耦合等離子體質(zhì)譜（安捷倫科技有限公司）；MARS 5微波消解儀（美國CEM公司）；電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；Avanti J-E冷凍高速離心機（BECKMAN）；ST 2100/3C Pro-F型pH酸度計（美國奧豪斯）；XK-80A快速混勻器（新康醫(yī)療器械有限公司）；DKQ-4型智能控溫電加熱器（上海屹堯微波化學技術有限公司）；Sartorius BSA224S電子分析天平（賽多麗斯科學儀器有限公司）；Milli-Q超純水機（Milipore公司）。

試劑：超純水（電阻率18.2 MΩ·cm）；硝酸（優(yōu)級純，CNW公司）；無水乙酸鈉（分析純）；硝酸鉀（分析純）；磷酸二氫鈉（分析純）；乙二胺四乙酸二鈉（分析純）；氨水（分析純）；無水乙醇（色譜純）；砷標準物質(zhì)：亞砷酸根[As(Ⅲ)]（GBW 08666）、砷酸根[As(V)]（GBW 08667）、一甲基砷酸（MMA）（GBW 08668）、二甲基砷酸（DMA）（GBW08668）、砷甜菜堿（AsB）（GBW 08669）（中國計量科學研究院）；砷標準貯備液（1 000 μg/ml，國家有色金屬及電子材料分析測試中心）；調(diào)諧液（10 μg/l鋰、釔、鉈標準溶液）。

1.2 液相色譜及ICP-MS條件

色譜柱：陰離子分析柱Dionex IonPac AS19（250 mm×4.0）；陰離子保護柱IonPac AG19(50 mm×4.0)；

流動相：A相：10 mmol/l無水乙酸鈉，3 mmol/l硝酸鉀，2 mmol/l磷酸二氫鈉，0.2 mmol/l乙二胺四乙酸二鈉，用氨水調(diào)節(jié)pH值10.7；B相：無水乙醇；A+B(99+1)混合等度淋洗；流速：1.0 ml/min；進樣量：25 μl。

ICP-MS工作條件：功率1 350 W；載氣流量0.65 L/min；補償氣流量0.45 L/min；采樣深度7.0 mm；采集質(zhì)量數(shù)75。

1.3 飼料中砷形態(tài)的提取

取飼料樣品過40目篩待用。稱取該飼料樣品1 g（準確至0.001 g）于50 ml離心管中，加入24 ml超純水，渦旋混勻，置于95℃烘箱中加熱提取2.5 h，每隔0.5 h渦旋1次。提取完后，冷卻至室溫，加入3%（v/v）乙酸溶液1 ml混勻沉淀蛋白，于4℃以10 000 r/min轉速離心5 min，取上清液用0.45 μm水系濾膜過濾及C18小柱凈化后上機測試。

1.4 總砷含量的測定

稱取過篩后的飼料樣品0.5 g（準確至0.001 g）于聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，加入6 ml硝酸和2 ml鹽酸，將消解罐蓋旋緊后，放入微波消解儀中，微波消解程序見表1。樣品消解完成，冷卻后打開消解罐，置于趕酸器（溫度設置為160℃）中趕酸，待消解液濃縮剩余2 ml左右，將其移入50 ml比色管，以少量去離子水清洗消解罐3次以上，洗液一同并入容量瓶中，定容、搖勻，同時做試劑空白。用電感耦合等離子體質(zhì)譜測定總砷。

表1 微波消解程序

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

砷形態(tài)是以陰離子形式存在，因此選擇陰離子交換柱進行分離，磷酸鹽溶液進行等度淋洗，pH值和磷酸鹽濃度均會影響目標砷形態(tài)的分離度，在流動相中加入少量的甲醇或乙醇，都能對砷的檢測起到增敏效應，提高砷的電離效率及靈敏度，考慮到乙醇對人體的傷害較小，因此實驗選擇在淋洗液中加入1%乙醇，可以有效地將靈敏度提高1倍以上。在流動相：A相：10 mmol/l無水乙酸鈉，3 mmol/l硝酸鉀，2 mmol/l磷酸二氫鈉，0.2 mmol/l乙二胺四乙酸二鈉，用氨水調(diào)節(jié)pH值10.7；B相：無水乙醇；A+B(99+1)混合等度淋洗下，能夠?qū)崿F(xiàn)5種砷形態(tài)分離，分離度和保留時間均可以達到試驗要求。圖1為選用該流動相的5種砷形態(tài)標準品與樣品色譜圖。

圖1 砷形態(tài)色譜圖

2.2 方法線性范圍及檢出限

按試驗方法，對質(zhì)量濃度分別為0、1.0、5.0、10.0、20.0 μg/l和50.0 μg/l的5種形態(tài)砷混合標準溶液進行HPLC-ICP-MS分析，以砷形態(tài)的峰面積對濃度進行線性回歸，結果表明：在0～50.0 μg/l的范圍內(nèi)，各種砷形態(tài)的線性回歸方程相關系數(shù)均在0.999以上。以3倍色譜峰信噪比S/N計算得到5種無機砷形態(tài)的儀器檢出限見表2，在試樣取樣量為1 g，定容體積為25 ml時，方法檢出限（按儀器檢出限×稀釋倍數(shù)計算）結果見表2。

2.3 飼料中砷形態(tài)的提取效率

砷形態(tài)的提取方法有水、甲醇-水、酶提取、酸提取等[10-12]。熱水提取，是一種傳統(tǒng)的砷形態(tài)提取方法，不會造成砷形態(tài)的轉化。試驗采用水做為提取劑，密閉加熱提取，對提取溫度和提取時間進行優(yōu)化。為了考察砷形態(tài)的提取效率，試驗通過比較微波消解-ICP-MS方法測定的總砷（見表3）與HPLC-ICP-MS測定的總砷，提取效率為88.7%～104%，說明95℃中熱浸提2.5 h可以有效地提取飼料中的砷形態(tài)。

2.4 方法回收率及重現(xiàn)性

為考察方法的回收率和砷形態(tài)化合物的穩(wěn)定性，按試驗方法對飼料樣品進行3個添加水平的加標回收試驗，結果見表4。從表4可以看出，5種形態(tài)砷化合物的加標回收率在88.6%～105%之間，相對標準偏差在2.1%～6.7%（平行測定6次）。說明熱提取方法不會造成砷形態(tài)的轉化。

2.5 飼料中砷形態(tài)分布

采用所建立的方法測定12個飼料樣品中的5種砷形態(tài)化合物，檢驗結果見表3。從試驗結果可知，飼料中的總砷含量在0.46～3.92 mg/kg之間，砷形態(tài)以砷甜菜堿（AsB）為主，個別樣品含有DMA和無機砷，無機砷含量遠遠低于其限量值。

3 結論

試驗建立了熱水浸提，C18小柱凈化，陰離子交換色譜與電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用方法測定飼料中5種砷形態(tài)的方法。通過測定12個飼料的砷形態(tài)，發(fā)現(xiàn)飼料中的砷形態(tài)以有機砷為主。HPLC-ICP-MS測定飼料中無機砷含量的分析方法，具有靈敏度高、準確性好等優(yōu)點，是檢測飼料無機砷的有效方法之一。

表2 線性范圍及檢出限

表3 飼料樣品中砷形態(tài)分布（mg/kg）

表4 飼料樣品中5種砷形態(tài)的加標回收率和相對標準偏差(%)(n=6)