于瀟，王代友，曾祥林

（廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530000）

大鼠腮腺組織放射后差異表達(dá)基因譜的構(gòu)建及生物信息學(xué)分析

于瀟，王代友，曾祥林

（廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530000）

目的探討全基因芯片對(duì)放射后腮腺組織表達(dá)譜的差異及相關(guān)生物信息學(xué)的重要基因、通路。方法選用SD大鼠12只，隨機(jī)分為空白組和放射組，每組各6只，一次性給予放射組60Co-γ射線15Gy的局部照射，空白組大鼠只腹腔注射10%水合氯醛。照射后2 h，無(wú)菌條件下迅速取出大鼠腮腺，投入液氮冷卻。將提取的腮腺組織的總RNA進(jìn)行Cye Dye Labeling熒光標(biāo)定及Phalanx OneArray-TM雜交反應(yīng)，利用含有20717個(gè)基因的ROAv2 RatOoeArray全基因表達(dá)譜芯片進(jìn)行差異基因的篩選，將|log2（Ratio）|≥1作為篩選閾值。對(duì)篩選出的差異基因進(jìn)行GO功能分類(lèi)和Pathway通路分析。結(jié)果差異表達(dá)基因913條，上調(diào)基因455個(gè)，下調(diào)基因458個(gè)。將差異基因的功能概括為13類(lèi)，包括代謝、細(xì)胞死亡、轉(zhuǎn)錄、應(yīng)激等相關(guān)基因。對(duì)913個(gè)基因的Pathway通路有顯著改變的通路共有13條，包括75個(gè)差異表達(dá)基因，其中7個(gè)涉及13條改變通路：Akt1、Pik3r1、Pik3cg、Nfkbia、Kras、Mapk13、Casp8。結(jié)論60Co-γ射線可使正常的大鼠腮腺組織中的基因表達(dá)水平發(fā)生改變。Akt1、Nfkbia、TPM1在放射后腮腺組織中的的基因表達(dá)改變有待于進(jìn)一步研究。

腮腺;放射效應(yīng)；基因表達(dá)；腫瘤

頭頸部惡性腫瘤是常見(jiàn)的腫瘤之一，目前最常用的治療方法：手術(shù)治療、放射療法和化學(xué)藥物治療[1]。放射治療常規(guī)治療方法之一。接受放射治療后，生存率和治愈率大幅度提高，對(duì)局部復(fù)發(fā)、腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)起到一定的抑制作用。同時(shí)放射線又是腫瘤的致病因素之一。放射線對(duì)正常組織、癌旁組織也造成一定的損傷，甚至出現(xiàn)一系列的并發(fā)癥[2]。

不同組織對(duì)放射線的敏感性不同，腮腺對(duì)放射線較敏感，因此，常對(duì)腮腺造成放射線損傷[3]。放射治療引起的繼發(fā)性放射性癌變也日益增多，放射性癌不但可發(fā)生于第一次口腔癌放療以后，也可發(fā)生在腮腺周?chē)M織放療之后[1]。研究表明：15Gy劑量的放射可引起腮腺損傷，但疾病的發(fā)生發(fā)展由基因編碼的蛋白操控，基因表達(dá)改變引起的腮腺組織變化需要一定時(shí)間。為此，我們應(yīng)用全基因芯片表達(dá)譜對(duì)放射后腮腺組織進(jìn)行整體的研究?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般材料 SD大鼠12只(廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)、Agilent RNA 6000 Nano Kit(5067-1511, Agilen公司)、Onearray Amino Allyl aRNA Amplification Kit(Phalanx公 司)、Amersham Cy5 NHS Ester (PA15106，GE公司)、Whole Genome Experssiomicroarray(Phalanx公司)、Agilent 2100生物分析儀(G2940CA，Agilent公司)、NanoDrop分光光度計(jì)(ND1000，Thermo Fisher公司)PCR System(9700，Applied Biosystem公司)、Hybridization oven(HR-80，COCONO公司)、AgilentMicroarray Scanner(G2505C，Agilent公司)、60Co-γ 照射源(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院西院)

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 選用SD大鼠12只，體重在180～200 g左右。按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組（0Gy）和放射組（15Gy），每組各6只，對(duì)空白組及放射組大鼠進(jìn)行腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后對(duì)放射組一次性給予60Co-γ射線15Gy的局部照射?？瞻捉M不照射。照射后2 h，無(wú)菌條件下迅速取出大鼠腮腺，剃去筋膜及結(jié)締組織，用RNase-free的生理鹽水迅速漂洗樣本，以去除血漬和污物。放入提前預(yù)冷的凍存管中，迅速投入液氮中冷卻。

1.2.2 樣本RNA的提取、純化及檢測(cè) 使用TRIzol試劑盒，分別將空白組和實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本中的總RNA提取出來(lái)，使用QIAGENRaeasy Kit分別對(duì)兩組的總RNA進(jìn)行純化，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。測(cè)定OD值，并做其他的RNA質(zhì)量檢測(cè)（包括吸光度測(cè)定、RNA質(zhì)量數(shù)測(cè)定以及瓊脂糖凝膠電泳）。

1.2.3 熒光標(biāo)定及片段化處理 取aRNA 15 ug，Couplingbuffer 9 ul，H2O 13.5 ul以及Cy5-NHS 1.5 ul混合均勻，輕微離心，在室溫下反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程共30min，注意避光，完成標(biāo)定反應(yīng)。并對(duì)其進(jìn)行純化，得到了已完成標(biāo)定、熒光染色、純化的反義RNA，并進(jìn)行吸光度、標(biāo)記效率測(cè)定，使用冰箱-20℃冷凍保存。取兩組已標(biāo)記好的RNA各15 ug，各加入Cot-1 10 ul以及10x片段化緩沖液30 ul配置成片段化反應(yīng)液；將反應(yīng)液放在70℃PCR儀中，15min后取出置于冰上。加入3 ul終止液后，完成片段化處理，室溫，避光儲(chǔ)存。

1.2.4 芯片雜交 在雜交反應(yīng)前必須進(jìn)行前雜交處理，其目的是：降低背景值，提高訊號(hào)噪聲比。取出完成前雜交處理的芯片，將其與空白芯片（含墊片）對(duì)夾。將熱縮膜套在兩芯片外側(cè)，放入燒杯水中（90～95℃），進(jìn)行熱縮。完成后放在50℃烘箱內(nèi)。將足量NewOA Hyb Buffer（182 ul）加入片段化aRNA的PCR管中，放入PCR儀中在95℃下開(kāi)始變性反應(yīng)，5min后以60℃恒溫。然后將液體從芯片熱縮膜切口處倒入，套上第二層熱縮膜，完成熱縮后，放入烘箱反應(yīng)16 h，溫度50℃，轉(zhuǎn)速120 rpm/h。最后應(yīng)用雜交清洗液清洗芯片，甩干水分，放入黑色芯片盒中，避光備用。

1.3 影像掃描與數(shù)據(jù)擷取 應(yīng)用Agilent Microarray G2505C掃描儀對(duì)芯片進(jìn)行掃描，借由掃描儀XDR的功能，分辨率為10 um，使用PMT 100%與10%的分辨率進(jìn)行兩次掃描。再利用GenePix?4進(jìn)行影像數(shù)據(jù)擷取，獲得兩份初級(jí)數(shù)據(jù)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理。

1.4 生物信息學(xué)分析 以|log2(Ratio)|≥1作為閾值判定標(biāo)準(zhǔn)（即Ratio≥2和Ratio≤0.5），進(jìn)行顯著性差異表達(dá)基因的篩選；用上海卓立工司提供的軟件對(duì)差913條差異基因進(jìn)行分析，包括GO功能分類(lèi)和Pathway通路分析等，通路顯著性的選擇標(biāo)準(zhǔn)是P＜0.05，以其為閾值選擇相關(guān)通路。

2 結(jié)果

2.1 樣品總RNA質(zhì)量檢測(cè)

2.1.1 RNA純度及質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)為總RNA含量不小于6μg，A260/A280比值在1.8～2.1之間。本試驗(yàn)中正常腮腺及放射后腮腺的樣品總RNA均在6μg以上，A260/A280比值分別為2.00和2.01，符合要求（見(jiàn)表1）。

表1 Phalanx OneArray?基因表達(dá)RNA質(zhì)量檢測(cè)

2.1.2 RNA整體質(zhì)量測(cè)定結(jié)果 RIN即RNA分子完整數(shù)，范圍為1～10，較高值表示總RNA整體質(zhì)量較好，標(biāo)準(zhǔn)為樣品的RIN≧6（見(jiàn)表1）。

2.1.3 RNA完整性測(cè)定結(jié)果 觀察電泳圖上樣品中28 S及18S核醣體RNA條帶，電泳圖上條帶清晰，表明其完整性較好。該RNA電泳28 S及18 S清晰可見(jiàn)（圖1）。

圖1 RNA瓊脂電泳圖像

2.2 基因芯片生物信息學(xué)分析

2.2.1 整體上差異基因的表達(dá)及分布情況

圖2 正常腮腺與放射后腮腺芯片對(duì)比火山圖

2.2.2 差異表達(dá)基因的篩選 本實(shí)驗(yàn)將差異基因的篩選條件設(shè)定為log2|Fold change|≥1且P＜0.05。聚類(lèi)后經(jīng)過(guò)軟件分析，共有差異表達(dá)基因913個(gè)，包括上調(diào)455個(gè)和下調(diào)458個(gè)。

2.2.3 GO功能分類(lèi) 差異表達(dá)基因13類(lèi)，包括：代謝、細(xì)胞死亡、轉(zhuǎn)錄、應(yīng)激、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)基因(表2)。

表2 GeneOntology生物學(xué)過(guò)程分類(lèi)（個(gè)）

2.2.4 差異明顯基因的注釋?zhuān)簩Ratio值|降序排列，選取上調(diào)、下調(diào)基因各10個(gè)差異最明顯的基因。通過(guò)NCBIgenebank以及Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索分析上調(diào)和下調(diào)前10個(gè)基因中每個(gè)基因的信息（見(jiàn)表3、表4）。表3為上調(diào)前10名基因，表4為下調(diào)前10名基因。

2.2.5 差異表達(dá)基因的pathway通路分析：顯著改變的通路共有13條，包含75條差異基因，其中有7個(gè)基因涉及13條改變通路：Akt1、Pik3r1、Pik3cg涉及8條通路，Nfkbia涉及7條通路，Kras涉及6條通路，Mapk13涉及5條通路，Casp8涉及4條通路（見(jiàn)表5）。

表3 表達(dá)上調(diào)前10名差異基因

表4 表達(dá)下調(diào)前10名差異基因

表5 7個(gè)主要基因的Pathway通路分析

3 討論

對(duì)大鼠進(jìn)行15 Gy放射后，其腮腺的蛋白量減少，大鼠腮腺組織發(fā)生損傷[4，5]。放射后2 h，細(xì)胞對(duì)放射線最敏感，細(xì)胞中各基因表達(dá)的變化最大，超過(guò)該時(shí)間點(diǎn)，會(huì)出現(xiàn)各種調(diào)節(jié)機(jī)制。利用含有20717個(gè)基因的ROAv2 RatOoeArray全基因表達(dá)譜芯片對(duì)兩張芯片進(jìn)行分析，共獲得差異表達(dá)基因913個(gè)，其中上調(diào)基因455個(gè)，下調(diào)基因458個(gè)。使用GO分類(lèi)和Pathway通路分析差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)913個(gè)差異表達(dá)基因共分為13類(lèi)；13條通路有顯著改變，有75個(gè)差異表達(dá)基因存在于改變的通路中，其中7個(gè)基因涉及13條改變通路：Pik3cg、Nfkbia、Akt1、Pik3r1、Kras、Mapk13、Casp8。

這7個(gè)基因均與癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，上調(diào)基因?yàn)椋篜ik3cg和Nfkbia；下調(diào)基因?yàn)椋篈kt1、Pik3r1、Kras、Mapk13、Casp8。Nfkbia、Mapk13、Casp8等基因在腫瘤組織中的表達(dá)下調(diào)，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展有抑制作用；口腔鱗狀細(xì)胞癌中，Kras基因突變位點(diǎn)位于突變頻率較高的第12、13、61、147位氨基酸所在的密碼

子[6]；Akt1基因在腫瘤組織中高表達(dá)，參與腫瘤轉(zhuǎn)移；Pik3cg和Pik3r1屬于PI3K基因的亞基，PI3K基因編碼的蛋白在口腔鱗癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率較高，提示PI3K可能與口腔鱗癌的發(fā)生有關(guān)[7]。Akt1、Pik3cg和Pik3r1均參與PI3K/AKT細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該通路能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

由于這7個(gè)基因涉及13條改變通路（100%），因此我們可以認(rèn)為這7個(gè)基因與放射后組織發(fā)生癌變有密切關(guān)系。本研究中，Akt1、Nfkbia、TPM1的表達(dá)改變情況與以往研究結(jié)果相反，需進(jìn)一步明確這3個(gè)基因在放射后腮腺組織中的作用。

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The Construction of Differentially Expressed Genes Spectrum of Parotid Gland Tissue In Rats After Radiation and Bioinformatics Analysis

Yu Xiao，Wang Daiyou,Zeng Xianglin
(Guangxi Medical University,Nanning 530000,Guangxi)

ObjectiveTo investigate the gene chip,the difference of the expression of parotid gland tissue after radiation spectrum and related important genes and pathways of bioinformatics.Methods12,only choose SD rats were random ly divided into blank group and radiation group,each group 6,60 co radiation group-once gamma-ray gy 15 local irradiation,blank group rats by intraperitoneal injection of only 10%chloral hydrate.2 h after irradiation,aseptic conditions quickly remove the parotid gland of rats,liquid nitrogen cooling.Parotid gland tissue extraction of total RNA Cye Dye fluorescent Labeling calibration and Phalanx One Array TM hybridization reaction,using contains 20717 genes ROAv2 Rat OoeArray?all gene expression profile chip for differences in gene screening,w ill|log2(thew ire)|1 asa screening or threshold.To GO to screen out the difference of gene function classification and Pathway Pathway analysis.Results913 differentially expressed genes,raised 455 genes,cut458 genes.The function of the genetic variations will be divided into 13 classes,including metabolism,cell death,transcription,stress related genes.Pathway Pathway of 913 genes significantly change access article 13,including 75 differentially expressed genes,including seven involves 13 change pathways:Akt1,Pik3r1, Pik3cg,Nfkbia,Kras,Mapk13,Casp8.Conclusion60 co-gamma rays can make the level of gene expression in the parotid gland tissue of rats with normal change.Akt1,Nfkbia and TPM 1 gene expression changes of parotid gland tissue after radiation needs to be further research.

Parotid gland,Radiation effect;Gene expression;Tumor

R818.74

：A

：1008-4118（2016）02-0004-05

10.3969/j.issn.1008-4118.2016.02.002

2016-02-11

王代友。E-mail:wangdaiyou@sina.com