高群，于新宇

（菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東 菏澤 274000；大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116000）

白術(shù)對(duì)腦老化小鼠記憶能力和突觸結(jié)構(gòu)的影響

高群，于新宇

（菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校，山東 菏澤 274000；大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116000）

目的探討白術(shù)對(duì)D-半乳糖致腦老化小鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬突觸結(jié)構(gòu)的影響。方法采用連續(xù)皮下注射D-半乳糖的方法，建立腦老化小鼠模型，通過(guò)Morris水迷宮檢測(cè)小鼠的記憶能力，用透射電鏡和形態(tài)計(jì)量法分析白術(shù)對(duì)腦老化小鼠CA3區(qū)Gray I型突觸結(jié)構(gòu)參數(shù)的影響。結(jié)果水迷宮實(shí)驗(yàn)：腦老化組的逃避潛伏期顯著長(zhǎng)于對(duì)照組P＜0.05，而RAM低、中、高組的逃避潛伏期顯著短于腦老化組(P＜0.05，P＜0.01。海馬CA3區(qū)Gray I型突觸結(jié)構(gòu)觀察：與對(duì)照組相比，腦老化組小鼠的突觸界面曲率、突觸后致密物厚度均顯著減小(P＜0.05；P＜0.01)，突觸間隙寬度顯著增大(P＜0.05)；白術(shù)組小鼠的突觸界面曲率、突觸間隙寬度、突觸后致密物厚度與對(duì)照組基本相近似(P＞0.05)。結(jié)論白術(shù)可以改善腦老化所致小鼠海馬CA3區(qū)Gray I型突觸結(jié)構(gòu)的改變，改善學(xué)習(xí)記憶能力。

白術(shù);腦老化；學(xué)習(xí)記憶能力；突觸；超微結(jié)構(gòu)

學(xué)習(xí)和記憶是構(gòu)成人腦智能的要素，是大腦認(rèn)知功能的重要組成部分。學(xué)習(xí)記憶功能的減退常常伴隨著年齡的增長(zhǎng)而發(fā)生，這是由于大腦的老化是全身機(jī)能老化的基礎(chǔ)。近年來(lái)，大量研究表明自由基的產(chǎn)生與腦老化密切相關(guān)，并認(rèn)為腦氧化應(yīng)激損傷在腦老化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。腦老化機(jī)制的研究，為治療和延緩腦衰老相關(guān)藥物的開發(fā)提供了重要理論依據(jù)。白術(shù)(RAM)是菊科植物白術(shù)的干燥根莖，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白術(shù)有較強(qiáng)的清除自由基、抑制氧化應(yīng)激等作用。研究表明，白術(shù)可抑制興奮毒性誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[1]改善三氯化鋁所致動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力[2]，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。但尚未見白術(shù)對(duì)腦老化引起的學(xué)習(xí)記憶障礙的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)D-半乳糖致腦老化動(dòng)物模型，考察白術(shù)對(duì)腦老化動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶功能影響，并從突觸可塑性的角度探討其作用機(jī)制，旨在為延緩和治療腦衰老化相關(guān)藥物的研發(fā)提供基礎(chǔ)理論。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物昆明種小鼠購(gòu)于“大連大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心”

1.2 藥材與試劑 白術(shù)購(gòu)于毫州飲片有限責(zé)任公司，白術(shù)水提物的制備4.0 kg白術(shù)粉碎后，涼水浸泡1 h，然后分3次加水、煮沸藥材，每次煮沸30min，合并3次藥液，過(guò)濾后蒸發(fā)濃縮，最終得水提取物3.06 kg，提取物置于冰箱內(nèi)冷藏保存。D-半乳糖購(gòu)于上海試劑二廠。戊二醛、鋨酸、丙酮、醋酸鈾購(gòu)于上海化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器 Morris水迷宮(DMS-2型)為上海欣軟信息科技有限公司產(chǎn)品。自動(dòng)純水儀為上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品。低溫冰箱為上海美菱公司產(chǎn)品。HT7700型透射電子顯微鏡(日本日歷)。超薄切片機(jī)為北京中鏡儀器科儀技術(shù)有限公司。

1.4 方法 小鼠隨機(jī)分組5組：空白對(duì)照組；腦老化組(模型組)；3種不同劑量的白術(shù)組，每組12只，雌雄各半。小鼠適應(yīng)環(huán)境2 d后，D-半乳糖模型組和白術(shù)組參照文獻(xiàn)和藥典[3，4]所述方法建立衰老動(dòng)物模型:每日皮下注射120mg/（kg·d）D-半乳糖(新鮮配置)；空白對(duì)照組每日皮下注射等量生理鹽水；3個(gè)白術(shù)劑量組每日灌胃700mg/（kg·d）、1050mg/（kg·d）、1400 mg/（kg·d）三種劑量的白術(shù)水溶物，空白對(duì)照組合和D-半乳糖模型組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)6周。

1.4.1 Morris水迷宮測(cè)試測(cè)試在第7周進(jìn)行，歷時(shí)6 d。前5天進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，隱蔽平臺(tái)置于第西南象限中央水下面0.5～1 cm，每天訓(xùn)練小鼠4次，每次60 s，儀器自動(dòng)記錄從入水到找到隱蔽平臺(tái)并立于其上所需要的時(shí)間(逃避潛伏期)，數(shù)據(jù)取4次均值。第6 d進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去平臺(tái)，然后在標(biāo)記的S點(diǎn)將小鼠面向池壁邊緣輕放入水中，記錄小鼠30 s內(nèi)在四個(gè)象限的游泳時(shí)間，其中西南象限的時(shí)間為記憶保持的時(shí)間，用來(lái)判斷動(dòng)物記憶儲(chǔ)存及提取再現(xiàn)。

1.4.2 形態(tài)學(xué)檢測(cè)Morris水迷宮測(cè)試結(jié)束后，選擇對(duì)學(xué)習(xí)記憶行為有顯著影響的小鼠(白術(shù)組)及對(duì)照組、腦老化組小鼠，經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，掀開其顱蓋骨，迅速取出腦，參照小鼠腦立體定位解剖數(shù)據(jù)[5]，取海馬CA3區(qū)，固定于3%戊二醛液中，并做好各組標(biāo)記，用0.1mol/LPBS清洗三次，1%鋨酸固定2 h，再0.1mol/LPBS清洗三次，每次10min。乙醇、丙酮中逐級(jí)脫水，100%丙酮和環(huán)氧樹脂Epon 812(1∶1)混合液浸泡2～4 h，環(huán)氧樹脂Epon 812各聚合12 h。LKB 11800型修塊機(jī)修塊、定位，超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾染液染色，透射電子顯微鏡觀察海馬CA3區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)，電鏡下拍攝各組海馬CA3區(qū)Gray I型突觸照片(每組各30張)，照片先經(jīng)Photoshop軟件進(jìn)行圖像效果處理后，用CIA-I型圖像分析系統(tǒng)分別測(cè)量突觸界面曲率(突觸界面弧長(zhǎng)/弦長(zhǎng))、突觸間隙寬度、突觸后致密物厚度，每組各測(cè)量30個(gè)突觸。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0軟件，所獲數(shù)據(jù)采用方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 白術(shù)對(duì)腦老化小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)：隨著訓(xùn)練學(xué)習(xí)天數(shù)的增加，各組小鼠的逃逸潛伏期均呈縮短趨勢(shì)。訓(xùn)練第2 d時(shí)，腦老化組小鼠逃逸潛伏期與對(duì)照組相比，P＜0.05，有顯著性差異。白術(shù)高劑量組小鼠的逃逸潛伏期顯著短于腦老化組，P＜0.05，有顯著性差異。訓(xùn)練第3 d始，白術(shù)中、高劑量組小鼠的逃逸潛伏期均明顯短于腦老化組(P＜0.05；P＜0.01)。空間探索實(shí)驗(yàn)：腦老化組小鼠在原放置平臺(tái)的象限(西南象限)內(nèi)停留時(shí)間顯著縮短，P＜0.05，有顯著性差異。在該象限的穿越次數(shù)顯著減少，P＜0.05，有顯著性差異。白術(shù)中、高劑量組小鼠在原放置平臺(tái)的象限內(nèi)停留時(shí)間顯著延長(zhǎng)，P＜0.05；P＜0.01，有顯著性差異。見圖1。

圖1 白術(shù)對(duì)腦老化小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響（水迷宮實(shí)驗(yàn)）

2.2 白術(shù)對(duì)腦老化小鼠海馬突觸結(jié)構(gòu)的影響 腦老化組小鼠海馬CA3區(qū)Gray I型突觸的突觸界面曲率、突觸后致密物厚度均顯著減小，P＜0.05；P＜0.01，有顯著性差異。突觸間隙寬度顯著增大，P＜0.05，有顯著性差異。與腦老化組相比，白術(shù)劑量組小鼠海馬CA3區(qū)Gray I型突觸的突觸界面曲率、突觸后致密物厚度均顯著增大，P＜0.05；P＜0.01，有顯著性差異。突觸間隙寬度顯著減小，P＜0.05，有顯著性差異。三個(gè)突觸結(jié)構(gòu)相關(guān)參數(shù)值與對(duì)照組基本相近似，P＞0.05，無(wú)顯著性差異。白術(shù)低、高劑量組之間，P＜0.05，有顯著性差異。各組小鼠CA3區(qū)Gray I型突觸結(jié)構(gòu)參數(shù)測(cè)量。見圖2和表1。

圖2 各組小鼠CA3區(qū)Gray I型突觸照片(×50,000)

表1 各組小鼠突觸結(jié)構(gòu)參數(shù)的的比較±s，nm)

表1 各組小鼠突觸結(jié)構(gòu)參數(shù)的的比較±s，nm)

與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與腦老化組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 n 突觸界面曲率 突觸間隙寬度 突觸后致密物厚度對(duì)照組 12 1.48±0.16 16.47±4.13 54.29±12.61腦老化組 12 1.12±0.14* 19.30±4.38* 37.04±8.03**白術(shù)700mg/kg 12 1.15±0.13 18.44±4.34 43.52±11.78#1050mg/kg 12 1.21±0.13 17.32±4.19# 49.39±12.15##1400mg/kg 12 1.43±0.15# 16.75±4.25# 56.13±12.54##

3 討論

大腦是一個(gè)具有高度復(fù)雜性的有機(jī)體，這種復(fù)雜性表現(xiàn)在其結(jié)構(gòu)與神經(jīng)化學(xué)活動(dòng)為了適應(yīng)環(huán)境的變化而處于調(diào)整和改變中，即可塑性。神經(jīng)可塑性是神經(jīng)系統(tǒng)的一個(gè)重要特征，是神經(jīng)活動(dòng)的一個(gè)重要體現(xiàn)，是學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)[6]。在神經(jīng)活動(dòng)過(guò)程中，突觸結(jié)構(gòu)及功能、神經(jīng)遞質(zhì)受體的結(jié)構(gòu)及功能、神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)及功能以及電生理等方面均可存在這種可塑性的變化[7]。研究顯示，改變突觸傳遞可塑性可影響學(xué)習(xí)記憶活動(dòng)，而同時(shí)在學(xué)習(xí)記憶相關(guān)腦區(qū)可見突觸的可塑性變化。突觸界面是突觸前成分與突觸后成分相互接觸的面，常有一定的彎曲度，稱為突觸界面曲率。彎曲是度增大是增加接觸面的一種方式，能保證突觸前成分釋放的遞質(zhì)到達(dá)突觸后膜上的靶受體，保障神經(jīng)信息傳遞的有效性[8,9]。突觸間隙的大小對(duì)突觸活動(dòng)的動(dòng)力學(xué)，即突觸囊泡包裹著的神經(jīng)遞質(zhì)傳遞的速度有重要的影響。突觸間隙增大，將延緩神經(jīng)遞質(zhì)傳遞的速度。以往研究表明，突觸界面結(jié)構(gòu)是敏感易變的指標(biāo)，易受一些因素（傳入信號(hào)、藥物、腦損傷、機(jī)體內(nèi)外環(huán)境變化、行為和年齡等）的影響而發(fā)生可塑性變化，并且這種變化與宏觀上學(xué)習(xí)記憶行為的變化相一致，其中以突觸后致密物(postsynaptic density,PSD)最為敏感[10,11]。PSD是位于突觸活性區(qū)突觸后膜胞質(zhì)側(cè)的一層致密物質(zhì)，呈圓盤狀或不規(guī)則狀，直徑300～500nm，厚約50 nm，由特化的細(xì)胞骨架、多種調(diào)節(jié)蛋白和酶構(gòu)成。這些蛋白和酶對(duì)突觸的信號(hào)傳導(dǎo)起關(guān)鍵的調(diào)控作用，它們的數(shù)量和構(gòu)象變化均可引起PSD超微結(jié)構(gòu)的可塑性變化，即PSD厚度的變化[12，13]。白術(shù)可能通過(guò)通改變腦老化小鼠突觸的某些結(jié)構(gòu)參數(shù)（突觸界面曲率、突觸后致密物厚度，突觸間隙寬度），從而以改善腦老化小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

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Effect of Rhizoma Atractylodis Macrocephalae on Learning-memory and Synaptic Structure in Aging Mice

Gao Qun，Yu Xinyu
(Heze Medical College,Heze 274000,Shandong;Dalian University,Dalian 116000,Liaoning)

Ob jec tiveTo observe the effects of rhizoma atractylodis macrocephalae(RAM)on learning-memory and synaptic structure in D-galactose-induced brain aging m ice.MethodsD-galactose was injected subcutaneously for the brain aging model.Learning-memory abilitywas tested by Morris water maze test and The structure of Grey Itype synapses in hippocampal CA 3 area were observed under transmitted electron microscope.ResultsMorris water maze test:In brain aging group,the escape latency was significantly prolonged,(P＜0.05).The escape latency in 3 RAM group was significantly shorter (P＜0.05，P＜0.01).The structure of Grey I type synapses in hippocampalCA3 area.In brain aging group,the curvature of synapse interface and thickness of postsynaptic desity were significantly decreased(P＜0.05,P＜0.01),and the width of synaptic cleft was significantly increased(P＜0.05)compared with control group.In RAM-treated groups,the curvature of synapse interface,width of synaptic cleft and thickness of postsynaptic desity were approximately the same as that of control group(P＞0.05).ConclusionRAM could significantly increase the ability of learning-memory in brain agingmice.the mechanism related to the protective effect on synapese in hippocam pal CA 3 area.

Rhizoma atractylodis macrocephalae; Brain aging; Learning and memory ability; Synapses; Ultrastructure

R28;R742;Q75

：A

：1008-4118（2016）02-0001-04

10.3969/j.issn.1008-4118.2016.02.001

2016-02-18

高群（1986-），女，漢，碩士，山東臨沂人。研究方向：神經(jīng)生物學(xué)。

于新宇。E-mail:xybio@sina.com