張雅會，李少麗，李艷麗

（1.中央農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校唐山分校，河北 唐山 063000；2.杭州薦量獸用生物制品有限公司，浙江 杭州 310018）

一種去除豬圓環(huán)病毒中支原體污染的方法

張雅會1，李少麗2*，李艷麗2

（1.中央農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校唐山分校，河北 唐山 063000；2.杭州薦量獸用生物制品有限公司，浙江 杭州 310018）

針對目前病毒中普遍存在支原體污染的現(xiàn)狀，本研究擬采用一種聯(lián)合過濾和用Plasmocin兩種方法，去除PCV2病毒中的支原體。PCV2病毒處理后，套式PCR檢測處理病毒樣品為陰性，同時進行IFA檢測，其效價仍能達107.3TCID50/mL以上。結(jié)果表明，采用這種聯(lián)合的方法在保證病毒效價不降低的情況下，徹底去除了PCV2病毒中污染的支原體，為同行關(guān)于去除病毒中污染的支原體提供了一種參考方法。

PCV2；支原體

在我國現(xiàn)階段，疫苗免疫被認為是防控動物疫病的有效手段，這些疫苗中絕大部分為病毒類疫苗，病毒類疫苗的制備一般均需先分離病毒，而在采集病料分離病毒及病毒傳代的過程中常因環(huán)境、使用器材污染等因素的影響，導(dǎo)致病毒被支原體污染。

支原體是一類缺乏細胞壁的原核細胞型微生物，大小一般在0.3～0.5 μm之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態(tài)[1]，支原體約有1%可通過濾菌器。商品化的支原體抗生素Plasmocin主要用于治療或預(yù)防細胞培養(yǎng)中支原體的污染，使用推薦濃度5倍的高濃度Plasmocin處理細胞，雖未觀察到藥物對細胞新陳代謝的副作用，但據(jù)檢測，若在繁殖病毒的過程中，細胞培養(yǎng)液中反復(fù)加入Plasmocin，則會使病毒效價降低。

本研究以污染支原體的豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus type 2，PCV2）為例，研究出一種聯(lián)合過濾和用抗生素兩種途徑去除病毒中支原體的方法。

1 材料

PCV2病毒由杭州薦量獸用生物制品實驗室保存；胎牛血清購自Hyclone；MEM培養(yǎng)基購自GIBCO；Plasmocin購自Invivogen；0.1 μm濾菌器購自Milliple，細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)板均購自Corning。

2 方法

2.10.1 μm濾器過濾PPCV2并連續(xù)繁殖四代用含5%胎牛血清的MEM培養(yǎng)PK-15細胞，細胞密度為2× 105個/mL。將PCV2用0.1 μm濾器過濾后，向MEM中接種PCV2，使PCV2接種量為MEM體積的1%，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)72 h。之后反復(fù)凍融3次，得到PCV2懸液。

以得到的病毒懸液為種毒，重復(fù)步驟2.1操作3次，得到第四代繁殖的病毒懸液。

2.2PCV2用終濃度2.5 μgg//mmLL的Plasmocin處理兩代用含5%胎牛血清的MEM培養(yǎng)PK-15細胞，細胞密度2×105個/mL，再向MEM中接種上述步驟中最終得到的PCV2，使PCV2接種量為MEM體積的1%，并向MEM中加入Plasmocin至終濃度2.5 μg/mL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)72～96 h；細胞鋪滿后，將細胞瓶反復(fù)凍融3次，得到PCV2懸液；

重復(fù)步驟2.2操作1次，得到第六代繁殖的病毒懸液。

2.3常規(guī)繁殖PPCV2兩代用含5%胎牛血清的MEM培養(yǎng)PK-15細胞，細胞密度2×105個/mL，再向MEM中接種步驟2.2最終制得的PCV2，使PCV2接種量為MEM體積的1%，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱，培養(yǎng)72 h；將培養(yǎng)后的細胞瓶取出后，反復(fù)進行3次凍融，得到細胞瓶中凍融好的PCV2懸液；

重復(fù)步驟2.3操作1次，即制得第八代所需的PCV2懸液。

2.4PCV2中支原體的檢測參考豬支原體基因序列（Genbank，NR-103095.1），采用DNAMAN軟件設(shè)計兩對上下游引物：P1：AAGTCGTAACAACCTATCCCTA，P2：GTGTCTGGTTAGTATTTAGCCTTA；P3：GCAAGTCGATGAAGGACG，P4：GCTTCGCTCGCCACTACT，采用套式PCR法，以步驟2.3最終制得的PCV2為樣品模板，并設(shè)滅菌雙蒸水為陰性對照，豬滑液囊支原體為陽性對照，先用P1和P2引物進行PCR擴增，將其擴增產(chǎn)物作為PCR反應(yīng)模板，再用P3和P4引物擴增目的基因片段。第2次PCR反應(yīng)條件為94℃ 3 min，94℃1 min，56℃ 1 min，68℃ 1 min，共30 cycle，第2次PCR反應(yīng)條件為94℃ 3 min，94℃ 1 min， 58℃ 30 s，68℃ 30 s，共30 cycle。PCR反應(yīng)體系均為dNTP 4 μL，PCR Buffer 5 μL，P1和P2（P3和P4）均為1 μL，rTaq酶1 μL，模板1 μL，滅菌水37 μL，共50 μL體系。第2次PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測支原體。

2.5PCV2 TCID50的測定先將PK-15細胞用MEM稀釋成2×105個/mL的細胞懸液，細胞懸液加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，再將步驟2.3最終制得的PCV2 10倍梯度稀釋，選擇10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7共6個梯度，每孔100 μL加到細胞懸液中，每個梯度重復(fù)6個孔，同時，設(shè)MEM培養(yǎng)液作陰性對照、107.3TCID50/mL的PCV2作陽性對照，陰性、陽性對照各1孔，然后將細胞培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72 h。

培養(yǎng)結(jié)束后，取出細胞培養(yǎng)板并棄掉細胞培養(yǎng)板中的液體，每孔加入100 μL冷的甲醇-丙酮固定液（甲醇和丙酮體積比1:1），-20℃固定30 min，棄固定液，再用pH 7.4的PBST洗滌1次細胞培養(yǎng)板后甩干。

將鼠源Cap蛋白單克隆抗體用PBS進行1:2 000倍稀釋，100 μL/孔加入到甩干的細胞培養(yǎng)板中，將細胞培養(yǎng)板在37℃搖床孵育60 min，棄細胞培養(yǎng)板中液體，再用pH7.4的PBST洗滌3次細胞培養(yǎng)板后甩干。

將FITC-羊抗鼠二抗用PBS進行1:200倍稀釋，100 μL/孔加入到甩干的細胞培養(yǎng)板中，錫箔紙包裹細胞培養(yǎng)板避光，將細胞培養(yǎng)板在37℃搖床孵育60 min，棄細胞培養(yǎng)板中液體，再用pH 7.4的PBST洗滌3次細胞培養(yǎng)板后甩干。

將甩干的細胞培養(yǎng)板于倒置熒光顯微鏡下觀察，按Reed和Muench法計算PCV2效價。

3 結(jié)果

3.1PCV2中支原體的檢測用濾菌器和Plasmocin處理過的PCV2 PCR檢測不到支原體，而未處理的PCV2則檢測出目的條帶，陰性對照和陽性對照均成立，見圖1。

3.2PCV2病毒TCID50的測定從各梯度的熒光效果看，用濾菌器和Plasmocin處理過的PCV2比未處理過的PCV2熒光強度好，且處理過的PCV2病毒效價仍能維持在107.3TCID50/mL以上（見圖2，顯微鏡放大倍率為10×10）。

圖1 PCV2支原體檢測Fig.1 mycoplasma detection of PCV2

圖2 PCV2的TCID50測定Fig.2 TCID50detection of PCV2

4 討論

在細胞培養(yǎng)或在利用培養(yǎng)的細胞繁殖病毒的過程中，細胞或病毒被支原體污染是世界性的問題，支原體的污染來源常包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染、試驗器材的污染以及用污染支原體的細胞繁殖病毒。為獲得無支原體污染的疫苗種毒或研究用病毒，以保證疫苗的純凈性和試驗結(jié)果的可靠性，本試驗聯(lián)合0.1 μm的濾菌器和Plasmocin兩種方法快速、徹底清除了PCV2中污染的支原體，且未影響到PCV2的病毒效價，為同行關(guān)于去除病毒中支原體的問題提供了一種參考方法。

Eliminate the mycoplasma in PCV2

Zhang Yahui1,Li Shaoli2*,Li Yanli2
(1.The central agricultural broadcasting and television school of tangshan branch,Hebei Tangshan 063000；2.Hangzhou Jianliang Veterinary Biological Preparations Co．Ltd,Zhejiang Hangzhou 310018)

Since the mycoplasma common contaminate in virus,To eliminate mycoplasma in PCV2, the research adopted a combined filtering and plasmocin two methods.PCR detection of PCV2 virus after processing,the results were negative,at the sametime detection of IFA,its titer can reached more than 107.3TCID50/mL.The results showed that the method using the joint in the case thoroughly eliminate the contaminated mycoplasma in PCV2 without lowing the titer of virus，and this case can provide a reference for peers about mycoplasma removal in virus.

PCV2;Mycoplasma

S852.62 < class="emphasis_bold"> 文獻標(biāo)識碼：B

B

1672-9692(2016)08-0042-03

2016-06-28

張雅會（1984-），女，本科，獸醫(yī)師，主要從事動物類產(chǎn)品監(jiān)測研究。

李少麗（1983-），女，在職博士，獸醫(yī)師，主要從事動物疫苗的開發(fā)與檢測。