劉 佳，李 巍，陳明非，程淑晶，蒼真?zhèn)ィ醯聫?qiáng)，趙怡雯

（1.遼寧省大連市動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 大連 116037；2.遼寧省大連市畜牧總站，遼寧 大連 116037）

布病實(shí)驗(yàn)室檢測方法的篩選與應(yīng)用

劉 佳1，2，李 巍1，2，陳明非1，2，程淑晶1，2，蒼真?zhèn)?，2，王德強(qiáng)1，2，趙怡雯1，2

（1.遼寧省大連市動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 大連 116037；2.遼寧省大連市畜牧總站，遼寧 大連 116037）

布魯氏菌病一直危害著動物和人類的健康，更是影響到畜牧業(yè)發(fā)展和公共衛(wèi)生等社會問題。一直以來，各界實(shí)驗(yàn)室都在尋求一種快速、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室檢測方法來確診布病。大連市獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室共對大連26個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)12 900份羊血清進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)cELISA檢測方法無論是特異性、重復(fù)性都優(yōu)于其他血清學(xué)檢測方法，更適合大連獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用和推廣。

布魯氏菌??；檢測；cELISA

布魯氏菌?。ê喎Q布病）是由布魯氏菌屬細(xì)菌引起的一種人畜共患病，豬、牛、羊都容易感染。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將該病列為B類動物疫病，我國將其列為二類動物疫病?；疾〖倚罂赏ㄟ^流產(chǎn)物、血液、精液、分泌物感染給人，布魯氏菌病呈世界性分布，一年四季均可發(fā)病[1]，在國內(nèi)羊?yàn)椴疾〉闹饕獋魅驹?。近年來，羊布病感染病例呈逐年上升態(tài)勢，不僅嚴(yán)重威脅人民群眾身體健康，也給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來巨大損失，直接影響到公共衛(wèi)生安全和經(jīng)濟(jì)發(fā)展等問題。

布病的防控與凈化已被列入《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012-2020年）》行列，是動物疫病監(jiān)測工作的重中之重。而檢測方法的選擇是布病防控與凈化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前布病凈化采用傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測方法有平板凝集試驗(yàn)（RBPT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT），新型的血清學(xué)檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和免疫膠體金試紙條檢測[2]。

布病的檢測方法雖然多樣，但在布病的凈化很難通過單一的血清學(xué)檢測方法來定性確診，一般都需要兩種或兩種以上的檢測方法相結(jié)合來確診病例。所以，選擇簡便、快捷、準(zhǔn)確度高的檢測方法對布病的防控和凈化至關(guān)重要。2015年5～9月，大連市獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室共對全市11個(gè)區(qū)市縣26個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)12 900份羊血清進(jìn)行檢測，并對獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室常用的布病凈化的幾種血清學(xué)檢測方法進(jìn)行比對、評估，為日后布病凈化血清學(xué)檢測方法的選擇提供了指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1材料待檢羊血清樣品，采自大連11個(gè)區(qū)市縣26個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)羊場和散戶，共計(jì)12 900份。

1.2試劑虎紅平板凝集抗原，中國獸藥監(jiān)察所生產(chǎn)，批號：201503；試管凝集試驗(yàn)抗原，中國獸藥監(jiān)察所生產(chǎn)，批號：201403；布魯氏菌cELISA抗體檢測試劑盒，哈爾濱動物生物制品國家工程研究中心有限公司生產(chǎn)，批號20150826；布魯氏菌抗體檢測試劑盒，美國IDEXX公司生產(chǎn)，批號：PO4130-25023；羊布病膠體金試紙條，韓國安捷動物診斷試劑有限公司生產(chǎn)，批號：T2306020。

1.3儀器準(zhǔn)備離心機(jī)，洗板機(jī)，生化培養(yǎng)箱，單、多道移液器。

1.4檢測方法與判定標(biāo)準(zhǔn)虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）與試管凝集試驗(yàn)（SAT）是按照《動物布魯氏菌病診斷技術(shù)》（GB/T 18646-2002）進(jìn)行檢測；布魯氏菌cELISA抗體檢測試驗(yàn)、布魯氏菌iELISA抗體檢測試驗(yàn)及膠體金試紙條檢測是嚴(yán)格按照試劑使用操作說明書進(jìn)行操作。判定標(biāo)準(zhǔn)按國家《布魯氏菌病防治技術(shù)規(guī)范》執(zhí)行。

2 樣品檢測

首先用虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）對12 900份羊血清進(jìn)行篩查，對篩查結(jié)果陽性樣品再采用試管凝集試驗(yàn)（SAT）、cELISA抗體檢測試驗(yàn)、布魯氏菌iELISA抗體檢測試驗(yàn)和膠體金試紙條進(jìn)行檢測比對，檢測結(jié)果見表1。

表1 不同試驗(yàn)方法檢測結(jié)果Table1 Results of different test methods

3 檢測結(jié)果分析

由表1可以看出，RBPT共檢測出布病陽性樣品173份，對173份陽性樣品用其他4種方法檢測，結(jié)果顯示，SAT的陽性檢出率為63%；iELISA的陽性檢出率為79%；cELISA的陽性檢出率為81%；膠體金試紙條的陽性檢出率為92%。

根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)要求，RBPT陽性，SAT陽性可以判定為抗體陽性個(gè)體，RBPT陽性但SAT陰性需要間隔30 d后重新采樣再進(jìn)行檢測。本實(shí)驗(yàn)室對RBPT陽性但SAT陰性的64只羊經(jīng)重新采樣，用RBPT方法檢測，檢測結(jié)果見表2。

表2 重新采樣后RBPT檢測結(jié)果Table2 RBPT results after re-sampling

根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，重新采樣的RBPT陽性數(shù)為31份，表1的SAT陽性數(shù)為109份，兩次檢測共檢測陽性數(shù)為140份。將以上幾種試驗(yàn)方法和檢測陽性數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定每種試驗(yàn)方法的符合率、特異性和敏感性，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同檢測方法符合率、特異性和敏感性的比較Fig.1 Comparison of different methods in recombination rate,specificity and sensitivity

4 討論

4.1 隨著乳、肉及其制品、皮、毛等產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，布魯氏菌的防治工作顯得尤為重要，檢測布魯氏菌的血清學(xué)診斷方法種類繁多，但總的說來目前還沒有任何一種方法在敏感性、特異性及可操作性等方面都能令人滿意[3]。因此，在實(shí)際檢測工作中，常需要兩種或兩種以上的檢測方法相互配合。采用虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）和試管凝集試驗(yàn)（SAT）都需要采血，工作量不僅很大，更是增加了工作難度。其次，盡管SAT是常用的布氏桿菌病診斷方法，但是此法操作繁雜、費(fèi)時(shí)，主觀影響因素較大，并且不適于現(xiàn)場應(yīng)用[4]；RBPT和膠體金試紙條雖然操作簡單，反應(yīng)時(shí)間較短，成本也相對低廉，但試驗(yàn)易受溫度的影響，特異性和敏感性都差一些，經(jīng)常會有假陽性的情況出現(xiàn)，很難準(zhǔn)確判定結(jié)果，更適合布病的普篩和初篩。

4.2 通過檢測結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，不同檢測方法的檢測結(jié)果是不完全一致的，陽性樣品的符合率也不完全一致。例如，RBPT檢出的陽性數(shù)為173份，膠體金試紙條檢出的陽性數(shù)為159份，SAT檢出的陽性數(shù)是109份，而實(shí)際檢出的陽性數(shù)是140份，說明PBRT和膠體金試紙條兩種檢測方法存在假陽性的可能性，而SAT則存在假陰性的可能性。

4.3 通過試驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，ELISA方法檢出的陽性樣本的準(zhǔn)確率最高，均達(dá)到了95%以上，尤其是cELISA方法，特異性、敏感性、符合率均達(dá)到了100%。ELISA方法的特點(diǎn)是操作簡便、快速、特異性好、準(zhǔn)確度高，可進(jìn)行大量樣品檢測[5]。早期，Garin-Bastuji等[6]首次用ELISA來檢測布魯氏菌抗體表明ELISA的檢測方法的敏感性要比試管高出十倍以上，石琴等[7]也指出cELISA比iELISA特異性更高，可以消除部分由細(xì)菌交叉反應(yīng)引起的非特異性反應(yīng)，并可以排除絕大多數(shù)牛種布魯氏菌19株免疫接種產(chǎn)生的殘留抗體的反應(yīng)。cELISA相比iELISA無論是特異性、符合率都要更好一些，適合于獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室對布病檢測的應(yīng)用與推廣。

[1]萬遂如.目前奶牛主要疫病流行狀況與防控技術(shù)（下）[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2015，（6）：54-57.

[2]張彥婷，劉艷琴，趙林立，等.布魯氏菌檢測技術(shù)的研究進(jìn)展[J].畜牧與飼料科學(xué)，2008，29（6）：43-46.

[3]臧鵬偉，張振嵐，范萬東，等.全乳環(huán)狀試驗(yàn)檢測奶牛布氏桿菌病的試驗(yàn)探討[J].畜牧與獸醫(yī)，2002，34（6）：28-29.

[4]趙鳳菊，李璐，閆明媚，等.牛、羊布魯氏菌病試管凝集試驗(yàn)與微量凝集試驗(yàn)檢測方法的比較[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2015，（2）：8-10.

[5]姚偉，獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)操作要點(diǎn)[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2015，（2）：36-38.

[6] Garin-Bastuji B, Blasco, Grayon M, et a1. Brueella melitensis infection in sheep:present and future[J]. Vet Res, 1998, 29(3-4): 255-274．

[7]石琴，袁立崗，梁俊明，等.獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室實(shí)用布魯氏菌檢測方法[J].新疆畜牧業(yè)，2013，5：18-19.

Screening and application of laboratory testing method onbrucellosis detection

Liu Jia1,2,Li Wei1,2,Chen Mingfei1,2,Cheng Shujing1,2, Cang Zhenwei1,2,Wang Deqiang1,2,Zhao Yiwen1,2
(1.DaLian Center for Animal Disease Prevention and Control,Liaoning Dalian 116037; 2.DaLian Animal Husbandry Station,Liaoning Dalian 116037)

Brucellosis not only has endangered animal and human health,but also has affected the development of animal husbandry and public health and other social issues.All the laboratories are looking for a fast and accurate laboratory tests method to confirm the diagnosis of brucellosis.12 900 goat serum in 26 towns in Dalian have been tested by Dalian Veterinary Laboratories.It shows that cELISA is better than other serological methods in specific detection and repeatability.cELISAis more suitable for application and promotionby veterinary laboratories in Dalian.

Brucellosis；Detection；cELISA

R516.7 < class="emphasis_bold"> 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

B

1672-9692(2016)08-0010-03

2016-07-11

劉佳（1985-），女，碩士研究生，碩士，獸醫(yī)師，研究方向?yàn)閯游镆卟≡\斷及防控。