李 穎，鄭思騫，寸冬梅

（沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110016）

硫酸沙丁胺醇肺吸緩釋微球的制備與評價

李 穎，鄭思騫，寸冬梅*

（沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110016）

目的制備可通過肺部吸入方式給藥的硫酸沙丁胺醇緩釋微球。方法以透明質(zhì)酸為載體材料，采用乳化溶劑揮發(fā)法制備硫酸沙丁胺醇的透明質(zhì)酸微球，以微球的體積平均直徑為指標考察不同工藝和處方因素的影響，并對優(yōu)化處方的微球進行體外釋放評價。結(jié)果經(jīng)優(yōu)化，得到的最佳制備工藝和處方為：透明質(zhì)酸質(zhì)量濃度為6 g·L-1，油相為含質(zhì)量分數(shù)1.0% Span80的蓖麻油，藥物與載體的質(zhì)量比為1∶1，內(nèi)外相的質(zhì)量比為1∶10，勻質(zhì)轉(zhuǎn)速為1.2×104r·min-1，超聲功率為500 W。制備得到的最優(yōu)硫酸沙丁胺醇微球， 粒徑較小， 平均粒徑為(4.75±2.56) μm；粒徑分布較窄，跨距為1.55±0.09；表面粗糙；其體外釋放行為表現(xiàn)出一定的緩釋效果。結(jié)論透明質(zhì)酸的質(zhì)量濃度、乳化方式、超聲功率是影響微球粒徑的重要因素，透明質(zhì)酸的性質(zhì)對微球的體外釋放行為有顯著影響。

藥劑學；透明質(zhì)酸緩釋微球；乳化溶劑揮發(fā)法；硫酸沙丁胺醇；體外釋放；肺部給藥研究

硫酸沙丁胺醇（salbutamol sulfate, SAS）是選擇性β2受體激動劑，用于輕度或重癥哮喘的治療[1]。硫酸沙丁胺醇半衰期較短，約4.5 h，需多次給藥[2]。且該藥首過效應(yīng)大，口服生物利用度僅為10%～30%，而其肺部生物利用度卻能高達 90%[3]。因此，開發(fā)其肺吸干粉制劑不僅可以提高藥物的生物利用度，還能改善病人的順應(yīng)性。

通常1～5 μm被認為是適宜肺部給藥的粒徑范圍，大于5 μm，微粉易在口咽部沉積，小于1 μm，則易隨呼吸呼出，難以獲得較高的肺部沉積率。肺部高效的清除機制如黏液纖毛剃、巨噬細胞吞噬、咳嗽等[4-6]，是影響吸入性藥物在肺部滯留的重要因素。透明質(zhì)酸（hyaluronic acid, HA）是人體內(nèi)源性物質(zhì)，分子質(zhì)量較大，并具有生物黏附性，能對抗肺黏膜纖毛活動剃的清除作用，從而延長制劑在肺部的滯留時間[7]。因此，本文作者嘗試應(yīng)用透明質(zhì)酸制備粒徑在1～5 μm內(nèi)、適合肺部吸入且具有緩釋特性的硫酸沙丁胺醇微球制劑。目前關(guān)于此方面的研究尚未有文獻報道。

1 儀器與材料

HPLC系統(tǒng)包括L-2130液相色譜泵、L-2420可變波長紫外吸收檢測器（日本Hitachi公司），Kromasil?C18色譜柱（200 mm×4.6 mm，5 μm，Eka Chemicals，瑞典），DF-101S數(shù)顯恒溫水浴鍋（鞏義予華儀器制造有限公司），F(xiàn)J200-S數(shù)顯高速分散均質(zhì)機（上海標本模型廠），JY92-2D超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司），LS230貝克曼激光粒度測定儀（美國 Beckman Coulter有限公司），S-3400N掃描電鏡（日本Hitachi公司），WHY-2往返水浴恒溫振蕩器（金壇大地自動化儀器廠）。

硫酸沙丁胺醇（阿法埃莎（天津）化學有限公司，批號 A18544），透明質(zhì)酸鈉（MW為1.47×106u，山東福瑞達生物醫(yī)藥有限公司，批號 120326），藥用蓖麻油（江西吉水香料廠），Span80（分析純，天津博迪化工有限公司），正己烷（分析純，天津富宇精細化工有限公司），磷酸二氫鈉（分析純，西隴化工有限公司），磷酸（分析純，天津科密歐化工有限公司），甲醇（色譜純，江蘇漢邦實業(yè)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 微球的制備

作者參照S.T.Lim等[8]的方法并加以改進，采用W/O 乳化溶劑揮發(fā)法制備硫酸沙丁胺醇透明質(zhì)酸微球。將一定量的透明質(zhì)酸鈉和藥物加至重蒸水中，攪拌12 h使透明質(zhì)酸鈉充分溶脹，得到藥物-載體溶液；在勻質(zhì)機轉(zhuǎn)速為8 000 r·min-1速度下，將藥物-載體（質(zhì)量比1∶1）溶液逐滴加至一定體積含有質(zhì)量分數(shù)1.0%Span80的蓖麻油中，制成初乳；將制成的初乳轉(zhuǎn)移到剩余的預(yù)熱好的油相中，在50 ℃、450 r·min-1條件下攪拌10 h；離心，正己烷洗滌3次，真空干燥箱常溫干燥，即得硫酸沙丁胺醇透明質(zhì)酸微球。

2.2 微球粒徑的測定及表面形態(tài)觀察

采用LS230激光粒度儀，測定粒子的粒徑。每個樣品平行測定3次，結(jié)果取平均值即得體積平均粒徑(VMD，dv)。粒度分布以跨距SPAN作為衡量指標，其值可通過下式計算得到：

其中，d10、d50、d90分別表示樣品的累計粒度分布數(shù)達到10%、50%和90%時所對應(yīng)的粒徑；跨度越大，則表明粒徑分布越不均勻。

采用S-3400N掃描電子顯微鏡，對微球的形狀及表面形態(tài)進行觀察。取少量干燥樣品粉末，用導電雙面膠布固定于金屬盤上，置于真空條件下噴金40 s使各個樣品表面覆蓋薄薄的一層金屬金，置于S-3400N掃描電子顯微鏡上觀察并采集圖像，掃描電鏡觀測時的操作加速電壓為15 kV。

2.3 微球回收率、載藥量及包封率的測定

收集干燥后的微球并稱質(zhì)量，通過下述公式計算得到微球的回收率：回收率 = 收集的微球的質(zhì)量 /（投藥量+載體質(zhì)量）×100%。

精密稱定載藥微球10.0 mg，加至10 mL量瓶中，用重蒸水充分溶解后，定容，搖勻。取1 mL 在1.6×104r·min-1下離心5 min，取上清液用0.22 μm濾膜過濾后，采用HPLC法在波長276 nm處測定微球中藥物的質(zhì)量濃度，結(jié)果硫酸沙丁胺醇質(zhì)量濃度在0.5～40 mg·L-1內(nèi)呈良好線性，相關(guān)系數(shù)R = 0.999 5，精密度、準確度均符合測定要求。根據(jù)下列公式，可分別計算得到載藥量和包封率：

載藥量 = 微球的實際藥物含量 / 微球的質(zhì)量 × 100%；包封率 = 微球的實際載藥量 / 微球的理論載藥量 × 100%。

2.4 體外釋放的測定方法

稱取微球10 mg，加至5 mL pH值為7.4的PBS緩沖液中，置于水平-恒溫振蕩儀中進行體外釋放度的測定。振蕩速度為200 r·min-1，釋藥溫度為 37 ℃。在每個取樣時間點，將所取樣品于4 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心1 min，取出上清液1 mL，同時補充1 mL已預(yù)熱的新鮮PBS。取出的上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾后用HPLC法分析，測定其中硫酸沙丁胺醇的濃度。根據(jù)測定的濃度、微球的載藥量和釋放介質(zhì)體積計算出各個取樣時刻的藥物累積釋放量（Qt），其計算如下：

以微球的累積釋放率（Q）為縱坐標，以釋放時間（t，min)為橫坐標，即可繪制微球的體外累積釋放曲線。

2.5 處方和工藝因素對微球粒徑的影響

乳化溶劑揮發(fā)法制備微球時，影響微球粒徑的處方和工藝因素較多。作者通過單因素分析，重點考察了透明質(zhì)酸的質(zhì)量濃度、乳化方式、超聲功率以及乳化劑的質(zhì)量濃度幾個因素對微球粒徑的影響。

2.5.1 透明質(zhì)酸質(zhì)量濃度對微球粒徑的影響

透明質(zhì)酸鈉為具有高度黏弾性的高分子聚合物，其濃度對微球的粒徑有顯著的影響。隨著透明質(zhì)酸鈉質(zhì)量濃度的增加，內(nèi)水相黏度也隨之增加，乳化時需克服的阻力更大，形成的乳滴粒徑更大，因而制備得到的微球粒徑也更大。由表1可知，透明質(zhì)酸的質(zhì)量濃度從8 g·L-1減小至6 g·L-1時，微球的粒徑顯著減小。

Table 1 Effect of concentration of hyaluronic acid on the average size of SAS-loaded HA microspheres(x±s, n=3)表1 透明質(zhì)酸質(zhì)量濃度對微球平均粒徑的影響(±s, n=3)

Table 1 Effect of concentration of hyaluronic acid on the average size of SAS-loaded HA microspheres(x±s, n=3)表1 透明質(zhì)酸質(zhì)量濃度對微球平均粒徑的影響(±s, n=3)

Formulation ρ(HA) /( g·L-1) dv/ μm SPAN F1 8 65.9±38.7 2.19±0.65 F2 6 56.2±36.4 2.02±0.51

2.5.2 乳化方式及超聲功率對微球粒徑的影響

對于乳化方式的影響，主要考察了勻質(zhì)和超聲兩種方式。由表2可知，在勻質(zhì)破碎方式中，勻質(zhì)機轉(zhuǎn)速從初始處方的8×103r·min-1(F2)增加到1.2×104r·min-1(F3)時，微球的粒徑由（56.2±36.4）μm相應(yīng)的減小到（46.5±33.6）μm；而在超聲破碎方式中，當超聲功率由200 W增大至500 W時，微球粒徑由（25.6±13.9）μm降至（14.3±9.32）μm。上述結(jié)果表明，超聲破碎方式較勻質(zhì)破碎方式所得微球的粒徑要小，但粒徑仍未達到理想的1～5 μm內(nèi)。

Table 2 Effect of emulsion techniques and ultrasonic power on the average size of SAS-loaded HA microspheres (±s, n=3)表2 乳化方式及超聲功率對微球平均粒徑的影響(±s, n=3)

Table 2 Effect of emulsion techniques and ultrasonic power on the average size of SAS-loaded HA microspheres (±s, n=3)表2 乳化方式及超聲功率對微球平均粒徑的影響(±s, n=3)

Formulation n(homogenization) / (r·min-1) P(ultrasonic) / W dv/ μm SPAN F2 8×103 56.2±36.4 2.02±0.51 F3 1.2×104 46.5±33.6 1.93±0.35 F4 200 25.6±13.9 1.86±0.23 F5 500 14.3±9.32 1.66±0.15

2.5.3 乳化劑質(zhì)量分數(shù)對微球粒徑的影響

微球制備過程中，乳化劑的質(zhì)量分數(shù)與形成的乳滴大小密切相關(guān)，并且直接影響形成的微球的粒徑。實驗中考察了4種質(zhì)量分數(shù)的Span80對微球粒徑的影響，結(jié)果見表3。當Span80的質(zhì)量分數(shù)從初始處方中的1.0%(F5)增加到1.5%、2.0%和3.0%時，相應(yīng)微球的粒徑也略有降低，但其變化并不顯著，可能是由于在現(xiàn)有實驗條件下，1.0% Span80已經(jīng)能夠滿足體系的需求，表現(xiàn)出了良好的乳化效果。進一步增大乳化劑的質(zhì)量分數(shù)，雖然粒徑無明顯變化，但其增溶作用會增強，使藥物在油相中的溶解度增加，進而降低微球的載藥量。因此，優(yōu)化處方中Span80的質(zhì)量分數(shù)仍確定在1.0%。

Table 3 Effect of concentration of surfactant of SAS-loaded HA microspheres(±s, n=3)±s, n=3)表3 乳化劑質(zhì)量分數(shù)對微球平均粒徑的影響(

Table 3 Effect of concentration of surfactant of SAS-loaded HA microspheres(±s, n=3)±s, n=3)表3 乳化劑質(zhì)量分數(shù)對微球平均粒徑的影響(

Formulation w(Span80 ) / % dv/ μm SPAN F5 1.0 F6 1.5 13.72±9.137 1.62±0.14 F7 2.0 12.04±7.927 1.58±0.10 F8 3.0 11.86±7.459 1.56±0.11

2.6 優(yōu)化微球處方及微球表面形態(tài)觀察

單因素考察的結(jié)果顯示，乳化的方式以及超聲功率的大小對粒徑的影響非常顯著，因此將勻質(zhì)與超聲2種乳化方式相結(jié)合，將乳化方式定為先以1.2×104r·min-1勻質(zhì)8 min，再在500 W超聲5 min，其他處方因素依次為：透明質(zhì)酸溶液質(zhì)量濃度為6 g·L-1、油相為含質(zhì)量分數(shù)1.0% Span80的蓖麻油、藥物與載體的質(zhì)量比為1∶1、內(nèi)外相質(zhì)量比為1∶10。按此優(yōu)化條件制備的微球，其體積平均直徑為（4.75±2.56）μm，跨距約1.55±0.09，回收率為（37.0±1.89）%。

電鏡下觀察，絕大部分微球的粒徑都小于5 μm，與貝克曼測定的粒徑大小基本一致。粒子形狀較規(guī)則，為球形，表面不光滑，有突起（圖 1）。據(jù)報道[9]，表面多褶皺粒子的空氣動力學行為較平滑的好，可能是由于粒子表面褶皺的存在，使得粒子之間的接觸機會減少，減少彼此之間的聚集，更有利于保持分散的狀態(tài)。

Fig. 1 SEM images of optimal HA microspheres prepared by emulsion solvent evaporation at different magnifications圖1 乳化溶劑揮發(fā)法制備的優(yōu)化處方微球在不同放大倍數(shù)下的掃描電鏡圖

2.7 載藥量及影響因素探討

HPLC法測定優(yōu)化處方中的硫酸沙丁胺醇微球的載藥量，測得載藥量為（3.95±0.690）%，包封率為（8.24±1.22）%。進一步提高藥物載體質(zhì)量比，載藥量亦無明顯的改善。

為找到包封率低的原因，分別測定微球、制備微球后分離得到的含Span 80的蓖麻油和洗滌溶劑正己烷三部分樣品中硫酸沙丁胺醇的含量。具體操作如下：微球制備后，收集所有分離后的蓖麻油和正己烷，稱質(zhì)量后，分別精密稱定20 g，置于分液漏斗中，加入飽和NaCl溶液20 mL作為萃取劑，充分振搖后靜置30 min使分層。分離并收集下面的水層，準確測定體積，取1 mL于1.6×10 r·min-1離心5 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，進樣，HPLC法測定。分別測得分離的蓖麻油和正己烷中藥物的含量，平行操作3次，求平均值，結(jié)果見表4。

Table 4 Mass distribution of SAS after the preparation of SAS-loaded microspheres(±s, n=3)表4 微球制備后硫酸沙丁胺醇在各部分的質(zhì)量分布(±s, n=3)

Table 4 Mass distribution of SAS after the preparation of SAS-loaded microspheres(±s, n=3)表4 微球制備后硫酸沙丁胺醇在各部分的質(zhì)量分布(±s, n=3)

Items w(SAS ) / % Microspheres3.58 ± 0.942Castor oil 51.6 ± 3.56 n-hexane 6.37×10-2± 3.24×10-2

從表4中所顯示的結(jié)果看，絕大部分的藥物在制備過程中從內(nèi)水相泄露到油相中是造成藥物載藥量和包封率低的直接原因。蓖麻油的主要成分是蓖麻油酸，是一種含羥基的不飽和脂肪酸，可通過氫鍵與硫酸沙丁胺醇相互作用[10]，因而在以蓖麻油作為油相制備硫酸沙丁胺醇微球的過程中，絕大部分的藥物向蓖麻油中轉(zhuǎn)移，使得形成的微球載藥量較低。

另外，需要說明的是三部分中回收的藥物總質(zhì)量為54%，這是由于油相中含有1.0%的Span80，在萃取過程中乳化非常嚴重，雖然有飽和NaCl幫助破乳，但效果不是十分明顯，因而有部分藥物形成了乳劑，造成了回收損失。

2.8 體外釋藥度評價

硫酸沙丁胺醇透明質(zhì)酸微球的體外釋放度測定結(jié)果見圖 2。從釋放曲線來看，藥物從微球中的釋放分為兩個階段：第一階段為突釋期，SAS在初始的1 min內(nèi)的釋放量接近62%，突釋現(xiàn)象比較明顯。這是由于應(yīng)用乳化溶劑揮發(fā)法制備微球時，相當一部分藥物會吸附在微球表面，在接觸釋放介質(zhì)后，這部分藥物迅速釋放，使得制備得到的微球具有明顯的突釋效應(yīng)[11-12]。第二階段為藥物的緩釋期，該階段藥物的釋放發(fā)生了明顯的遲滯現(xiàn)象，持續(xù)時間約1 h。因為近表面藥物已經(jīng)在第一階段釋放完全，埋藏在微球內(nèi)部的藥物受到透明質(zhì)酸高分子鏈的阻礙，使得擴散變得緩慢。此時釋放介質(zhì)PBS已向HA內(nèi)部滲入，形成的溶脹性的HA骨架具有較大的黏度，使SAS通過的阻力增加，藥物釋放大大減緩。

Fig. 2 Cumulative in vitro release of SAS from HA microspheres using constant temperature bath oscillator and pH 7.4 PBS at 37 ℃ (±s, n=3)圖2 硫酸沙丁胺醇從透明質(zhì)酸微球中的累積釋放曲線（恒溫水浴振蕩儀，pH 7.4、37 ℃ PBS為釋放介質(zhì)）

為了探討藥物從微球中釋放的機制，作者對微球的釋放曲線與以下4種數(shù)學模型進行擬合（表5），各模型的線性相關(guān)系數(shù)依次為：Ritger-Peppas＞一級釋放模型＞Higuchi釋放模型＞零級釋放模型。其中Ritger-Peppas方程的擬合度最好，其中k為常數(shù)，n表示釋放機制的特征參數(shù)，與制劑的骨架的形狀有關(guān)，對于球狀骨架，其值< 0.43時，藥物的釋放特點服從Fick擴散。即對于硫酸沙丁胺醇微球，藥物均勻地分散在透明質(zhì)酸高分子材料中，外層的藥物暴露在釋放介質(zhì)中，會首先溶解，然后擴散到骨架外面，此過程不斷地在制劑內(nèi)部和釋放介質(zhì)之間進行。在此期間，透明質(zhì)酸為可生物降解的聚合物，與水溶性PBS接觸后膨脹，形成凝膠屏障而控制藥物的釋放。硫酸沙丁胺醇微球的釋藥速率很大程度上取決于骨架中藥物的初始質(zhì)量濃度、藥物溶解度和透明質(zhì)酸聚合物的性質(zhì)。

Table 5 Release fitted equation and correlation coefficients of SAS released from HA microspheres(±s, n=3)表5 硫酸沙丁胺醇微球釋放曲線模型擬合(±s, n=3)

Table 5 Release fitted equation and correlation coefficients of SAS released from HA microspheres(±s, n=3)表5 硫酸沙丁胺醇微球釋放曲線模型擬合(±s, n=3)

Kinetic model Fitted equation R2Zero-order Q =71.14+34.86t 0.829 6 First-order ln(1-Q) =-0.827-3.951t 0.965 0 Higuchi model Q =59.59+44.16t? 0.958 4 Ritger-peppas lnQ = 4.095+0.124lnt 0.971 1

3 討論

a. 作者采用乳化溶劑揮發(fā)法，應(yīng)用高分子透明質(zhì)酸為載體材料，制備了硫酸沙丁胺醇透明質(zhì)酸微球，微球的粒徑小，為（4.75±2.56）μm，且其體外釋放表現(xiàn)出一定的緩釋效果。目前，關(guān)于透明質(zhì)酸應(yīng)用于硫酸沙丁胺醇微球制備方面的研究尚未有文獻報道。

b. 應(yīng)用乳化溶劑揮發(fā)法制備微球時，處方和工藝因素對微球粒徑影響較大。其中透明質(zhì)酸的質(zhì)量濃度、乳化方式、超聲功率會對微球的粒徑產(chǎn)生顯著性影響，且相比于勻質(zhì)，采用超聲破碎方式得到微球的粒徑更小。

c. 由于蓖麻油分子中有氫鍵存在，會與硫酸沙丁胺醇通過氫鍵相互作用，兩者之間親和力大大增加，從而在制備過程中，藥物會向外相的蓖麻油中緩慢轉(zhuǎn)移，造成藥物從微球中“泄漏”，從而形成的微球載藥量較低。

d. 硫酸沙丁胺醇從透明質(zhì)酸微球中的釋放表現(xiàn)為Fick擴散行為，即分散在微球中的藥物不斷溶解，并逐步擴散到釋放介質(zhì)中，此過程中透明質(zhì)酸遇水后膨脹，形成的溶脹性的HA骨架具有較大的黏度，使SAS通過的阻力增加，藥物釋放大大減緩。硫酸沙丁胺醇微球的釋藥速率很大程度上取決于骨架中藥物的初始質(zhì)量濃度、藥物溶解度和透明質(zhì)酸聚合物的性質(zhì)。

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Preparation and evaluation of sustained release salbutamol sulfate microspheres for pulmonary drug delivery

LI Ying, ZHENG Siqian, CUN Dongmei*
（School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China）

ObjectiveTo prepare sustained release microspheres suitable for pulmonary drug delivery.MethodsHyaluronic acid was used as carrier material and salbutamol sulfate was applied as model drug to prepare salbutamol sulfate loaded hyaluronic acid microspheres by emulsion solvent evaporation method. Effects of various parameters of formulation and process on volume mean diameter of microspheres were studied, and the in vitro release study of optimal microspheres was conducted as well.ResultsOptimal formulation was set as follows: 6 g·L-1HA as dispersed phase, castor oil contained 1.0% Span80 as continuous phase, ratio of drug polymer ratio as 1∶1, ratio of dispersed phase to continuous phase as 1∶10, homogenization speed (1.2×104r·min-1, 10 min) and ultrasonic power (500 W, 5 min). The drug-loaded HA microspheres prepared from optimal formulation were spherical with rough surfaces and possessed a average diameter of (4.75±2.56) μm, and also possessed small particle size distribution of 1.55±0.09. The in vitro release study suggests microspheres formed had a sustained release effect.ConclusionsPolymer concentration, emulsification techniques and surfactant concentration show significant influence on the particle sizes of microspheres. The characteristics of hyaluronic acid significantly affect the in vitro release behavior of prepared microspheres.

pharmaceutics; hyaluronic acid sustained release microspheres; emulsion solvent evaporation method; salbutamol sulphate; in vitro release; pulmonary drug delivery

(本篇責任編輯：趙桂芝)

R 94

A

（2016）05-0143-08

10.14146/j.cnki.cjp.2016.05.001

2015-05-07

國家自然科學基金資助項目(81302720)

李穎(1990-), 女(漢族), 湖南岳陽人, 碩士研究生,E-maildilemmaly@126.com；*

寸冬梅(1977-), 女(白族), 云南大理人, 副教授, 博士，碩士生導師，主要從事肺部藥物傳遞系統(tǒng)及生物大分子藥物傳遞系統(tǒng)研究,Tel.024-23986330,E-mailcundongmei@163.com。