張人 / 復(fù)旦大學(xué)分析測(cè)試中心

拉曼光譜液體樣品檢測(cè)過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計(jì)與影響因素分析

張人 / 復(fù)旦大學(xué)分析測(cè)試中心

介紹了拉曼光譜液體樣品毛細(xì)管檢測(cè)法，研究了毛細(xì)管的管徑以及毛細(xì)管內(nèi)不同空間位置對(duì)于信號(hào)強(qiáng)度的影響，明確了獲得最優(yōu)信號(hào)強(qiáng)度的空間位置，并給出了標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)步驟。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析驗(yàn)證了毛細(xì)管法能夠獲取具有高重復(fù)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

拉曼光譜；液體樣品；毛細(xì)管；標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)

0 引言

拉曼光譜是一種基于分子極化率變化的分子振動(dòng)光譜，具有無(wú)損、高靈敏度、高分辨率、可在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，被越來(lái)越廣泛應(yīng)用到包括醫(yī)藥、化工、公共安全、新材料及納米科技等各個(gè)行業(yè)。拉曼光譜不需制樣便可檢測(cè)包括水溶液的液體樣品，可定性及定量地提供相關(guān)溶液所包含的溶質(zhì)及溶劑的物質(zhì)種類信息。JY/T 002-1996《激光喇曼光譜分析方法通則》及正在修訂的《激光拉曼光譜分析方法通則》征求意見(jiàn)稿提出了液體樣品檢測(cè)的指導(dǎo)意見(jiàn)，包括使用毛細(xì)管樣品檢測(cè)法。然而因市售毛細(xì)管種類眾多，且上述指導(dǎo)意見(jiàn)未明確標(biāo)準(zhǔn)化操作，因此在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中因毛細(xì)管規(guī)格的不同造成對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果的不一致。本文通過(guò)研究拉曼光譜液體樣品毛細(xì)管檢測(cè)法中多種毛細(xì)管因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提出了一種標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)流程。

1 測(cè)量系統(tǒng)的構(gòu)成

液體樣品的拉曼光譜毛細(xì)管檢測(cè)系統(tǒng)由拉曼光譜儀的顯微系統(tǒng)（物鏡）和毛細(xì)管構(gòu)成，如圖1（A）所示。整個(gè)系統(tǒng)置于減震平臺(tái)上，毛細(xì)管置于固定裝置后固定于顯微鏡下。若液體為易揮發(fā)樣品或易于流動(dòng)，需封閉毛細(xì)管的兩個(gè)端口。將毛細(xì)管放置于顯微物鏡下，通過(guò)物鏡的觀察調(diào)節(jié)物鏡臺(tái)，將物鏡焦點(diǎn)置于液體內(nèi)部。通過(guò)拉曼光譜儀控制軟件，設(shè)定激光波長(zhǎng)、檢測(cè)范圍和掃描時(shí)間等參數(shù)，并控制拉曼光譜信號(hào)的采集。圖1（B）為毛細(xì)管內(nèi)部空間示意圖，中間的三角錐代表入射激光，同時(shí)將毛細(xì)管內(nèi)與入射光平行的方向(y)計(jì)為垂直徑向方向，與入射光垂直的方向(x)計(jì)為平行軸向方向。

圖1 (A)顯微拉曼光譜儀毛細(xì)管檢測(cè)系統(tǒng)；(B) 毛細(xì)管內(nèi)部空間示意圖

本文所用拉曼光譜儀型號(hào)為Horiba Jobin Yvon公司的XploRA，激光波長(zhǎng)選為785 nm，測(cè)量光譜范圍設(shè)定為200-1 800 cm-1，信號(hào)采集方式為180°背散射檢測(cè)。被檢測(cè)物品為國(guó)藥集團(tuán)生產(chǎn)的分析純無(wú)水乙醇，并以拉曼散射位置在875.8 cm-1的C-C-O骨架伸縮振動(dòng)峰用作記錄信號(hào)強(qiáng)度的標(biāo)記峰[1]。

2 方法依據(jù)與方法分析

拉曼光譜液體樣品毛細(xì)管檢測(cè)法，因毛細(xì)管在使用過(guò)程中便捷，所需樣品量少（一至幾十微升），對(duì)檢測(cè)時(shí)間無(wú)要求（暴露環(huán)境中的液體因不斷揮發(fā)，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)間短且不穩(wěn)定），可以再次回收樣品等特點(diǎn)，使其成為實(shí)際檢測(cè)操作的首選方法。但在樣品檢測(cè)過(guò)程中，因拉曼光譜儀的共焦設(shè)計(jì)[2]提供信號(hào)的空間約為直徑10 μm、長(zhǎng)度數(shù)十微米的圓柱狀[3]，而毛細(xì)管的直徑有數(shù)百微米至毫米數(shù)種規(guī)格，且毛細(xì)管管壁對(duì)入射激光具有散射作用而影響入射光強(qiáng)，故需考察毛細(xì)管的管徑與毛細(xì)管內(nèi)部的空間布局對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的影響，以明確不同檢測(cè)條件下所測(cè)結(jié)果的可比性。

根據(jù)上述要求，如果將激光焦點(diǎn)移動(dòng)定位至毛細(xì)管管徑截面圓心，因激光焦點(diǎn)距離管壁最遠(yuǎn)，受管壁影響最小，且能夠獲得整個(gè)檢測(cè)空間的信號(hào)，故可以獲得最強(qiáng)的散射信號(hào)。實(shí)際操作中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)處于截面圓心位置時(shí)，恰好能夠在物鏡中觀察到如圖2（A）所示的清晰毛細(xì)管內(nèi)徑側(cè)壁的像，故可以利用該聚焦位置進(jìn)行檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計(jì)?；谏鲜隼碚撛O(shè)想與操作特點(diǎn)，本文以毛細(xì)管截面圓心位置為出發(fā)點(diǎn)，比較周圍空間的拉曼散射信號(hào)的強(qiáng)度變化情況，進(jìn)而對(duì)JY/T 002-1996《激光喇曼光譜分析方法通則》及正在修訂的《激光拉曼光譜分析方法通則》征求意見(jiàn)稿中的推薦方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作探討。

2.1 測(cè)量步驟

1）用毛細(xì)管吸取被檢測(cè)溶液；

2）將毛細(xì)管置于毛細(xì)管架上；

3）將毛細(xì)管置于拉曼光譜儀的物鏡下；

4）調(diào)節(jié)樣品平臺(tái)位置，將毛細(xì)管準(zhǔn)確定位于物鏡焦點(diǎn)下方；

5）調(diào)節(jié)樣品平臺(tái)高度，將物鏡焦點(diǎn)推至毛細(xì)管內(nèi)部；

6）精細(xì)調(diào)節(jié)樣品臺(tái)的位置與高度，使得物鏡視野內(nèi)能清晰觀察到如圖2（A）所示的毛細(xì)管內(nèi)徑側(cè)壁像，且將焦點(diǎn)位置移至內(nèi)鏡像的中心位置；

7）在拉曼光譜儀中設(shè)定好檢測(cè)范圍、掃描時(shí)間和激光波長(zhǎng)等參數(shù)后開(kāi)始檢測(cè)，獲取如圖2（B）所示的拉曼散射信號(hào)（被標(biāo)記處信號(hào)峰為C-C-O骨架伸縮振動(dòng)，用于記錄散射信號(hào)）。

圖2 (A)顯微鏡下觀察到的毛細(xì)管內(nèi)徑成像；(B)無(wú)水乙醇的拉曼散射光譜圖

2.2 管徑的影響

為了研究不同直徑的毛細(xì)管對(duì)于拉曼信號(hào)強(qiáng)度的影響，本文選取了5種毛細(xì)管（如圖3（A）所示），管徑均值分別為0.3 mm、0.5 mm、1 mm、1.8 mm和5 mm（5 mm管為核磁管，已無(wú)毛細(xì)效應(yīng)，用于比較管徑的影響）。在吸取適量的無(wú)水乙醇后，按本文2.1的測(cè)量步驟進(jìn)行信號(hào)采集，信號(hào)強(qiáng)度與管徑關(guān)系如圖3（B）所示。從圖3（B）中可以看到，隨著管徑的增大信號(hào)逐漸增強(qiáng)，當(dāng)管徑為1.8 mm時(shí)信號(hào)最強(qiáng)，增大至5 mm時(shí)信號(hào)略下降，其原因可能在于激光光柱受小管徑毛細(xì)管管壁的散射要大于大直徑毛細(xì)管管壁的散射，從而使得照射在采樣區(qū)的激光強(qiáng)度下降，導(dǎo)致信號(hào)隨管徑的減小而下降。

2.3 毛細(xì)管水平徑向位置的影響

拉曼光譜采樣信號(hào)界面大約為數(shù)微米，因而需考慮毛細(xì)管水平徑向方向（圖1（B）中x軸）是否對(duì)強(qiáng)度也有明顯影響。為了考察該問(wèn)題，如圖4（A）所示，對(duì)直徑為1 mm的毛細(xì)管該方向進(jìn)行超過(guò)30個(gè)點(diǎn)的掃描，并將強(qiáng)度記錄成隨水平徑向分布的圖形如圖4（B）所示。從圖4（B）中可以看到，在水平徑向中心位置（橫坐標(biāo)0點(diǎn)即毛細(xì)管橫截面圓心位置處）至兩側(cè)一定范圍內(nèi)的強(qiáng)度基本保持穩(wěn)定，但在超出該范圍后強(qiáng)度迅速下降。該結(jié)果表明，在毛細(xì)管水平徑向位置中線上是強(qiáng)度最高的點(diǎn)，同時(shí)在一定水平位置空間內(nèi)能夠保持信號(hào)穩(wěn)定。

為了進(jìn)一步考察不同管徑的毛細(xì)管在水平徑向位置上的信號(hào)強(qiáng)度分布情況，5種不同管徑的毛細(xì)管吸取無(wú)水乙醇后進(jìn)行了跨度為6 mm（-3～3 mm）的水平掃描，結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看到，管徑越大，所能提供的水平徑向檢測(cè)空間越寬，管徑5 mm的毛細(xì)管比管徑1 mm的檢測(cè)空間寬大約4倍，比0.3 mm的大約7倍。其原因可解釋為管徑越大截面圓心離管壁越遠(yuǎn)，故檢測(cè)空間越大。但需要指出的是，當(dāng)管徑增大時(shí)，一方面毛細(xì)管效應(yīng)下降，另一方面樣品需求量上升明顯，所以在實(shí)際使用中需要綜合考慮所用毛細(xì)管的規(guī)格。

圖3 (A)不同管徑的毛細(xì)管；(B)不同毛細(xì)管管徑系統(tǒng)下測(cè)得的乙醇信號(hào)強(qiáng)度

圖4 水平徑向方向的強(qiáng)度分布(A)毛細(xì)管內(nèi)徑圖；(B)水平徑向方向上的檢測(cè)強(qiáng)度分布

圖5 不同毛細(xì)管管徑系統(tǒng)下的水平徑向檢測(cè)范圍

圖6 徑向垂直方向的強(qiáng)度分布

2.4 毛細(xì)管縱軸徑向位置的影響

由于毛細(xì)管縱軸徑向方向（圖1（B）中y軸）與激光入射方向重疊，且激光的采樣空間在縱軸方向的分布更廣（約數(shù)十至數(shù)百微米）[3]，故拉曼信號(hào)強(qiáng)度可能對(duì)縱軸方向的空間變化更敏感。根據(jù)上述推測(cè)，沿縱軸徑向不同位置進(jìn)行采樣，將所得信號(hào)強(qiáng)度與其所處位置作圖，如圖6所示。從圖6中可以看到，確如預(yù)期縱軸徑向隨離圓心位置有明顯的信號(hào)強(qiáng)度衰減，其信號(hào)衰減速度大于水平徑向位置上的衰減速度，在偏離中心位置100 μm處便出現(xiàn)了明顯的信號(hào)下降，說(shuō)明在縱軸徑向位置更需要標(biāo)準(zhǔn)化操作設(shè)計(jì)，即將觀察到明確的毛細(xì)管內(nèi)徑管壁像時(shí)才能確認(rèn)激光焦點(diǎn)聚焦于毛細(xì)管截面中心，進(jìn)而獲取最優(yōu)的拉曼光譜信號(hào)。

3 統(tǒng)計(jì)分析

明確激光焦點(diǎn)位置聚焦在毛細(xì)管界面圓心位置能獲取最優(yōu)的拉曼光譜信號(hào)后，尚需考察毛細(xì)管檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)重復(fù)性。在保持相同的實(shí)驗(yàn)條件下，本文對(duì)拉曼光譜的強(qiáng)度進(jìn)行了51次重復(fù)測(cè)試，相關(guān)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1所示。從表1中可以看到，51次測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.08%，從之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，該結(jié)果可能與毛細(xì)管的品質(zhì)直接相關(guān)。若能夠提升毛細(xì)管的品質(zhì)，如管徑和管壁厚度的均一度，或能進(jìn)一步降低相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，從而使得毛細(xì)管檢測(cè)體系能夠更加準(zhǔn)確地應(yīng)用于定量檢測(cè)。

表1 同一規(guī)格的毛細(xì)管多次采樣的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

4 結(jié)語(yǔ)

本文就JY/T 002-1996及正在修訂的《激光拉曼光譜分析方法通則》征求意見(jiàn)稿中所推薦的拉曼光譜液體樣品毛細(xì)管檢測(cè)法進(jìn)行了檢測(cè)操作標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計(jì)，研究了相關(guān)毛細(xì)管參數(shù)及儀器檢測(cè)參數(shù)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，并依據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析了該標(biāo)準(zhǔn)化操作下的實(shí)驗(yàn)誤差。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，拉曼光譜液體樣品毛細(xì)管檢測(cè)法能夠穩(wěn)定有效地提供被測(cè)樣品的拉曼光譜信號(hào)，但需要對(duì)指導(dǎo)方法補(bǔ)充的是在檢測(cè)過(guò)程中對(duì)檢測(cè)空間進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的選取，即在光學(xué)成像輔助下使激光焦點(diǎn)聚焦到毛細(xì)管的截面圓心位置，才能獲得高穩(wěn)定性、高重復(fù)性、高強(qiáng)度的拉曼光譜信號(hào)，從而使拉曼光譜液體樣品毛細(xì)管檢測(cè)法更好地適用于各個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域。

[1]F R 多林希.有機(jī)化合物的特征拉曼頻率[M].北京：中國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)，1980.

[2]楊序綱.拉曼光譜的分析與應(yīng)用[M].北京：國(guó)防工業(yè)出版社，2008.

[3]R Tabaksblat，R J Meier and B J Kip.Confocal raman microspectroscopy - theory and application to thin polymer sample[J].Applied Spectroscopy，1992（46）：60-68.

Standardized design of liquid sample testing process based on Raman spectra and its influencing factors

Zhang Ren
（Analysis and testing center of Fudan University）

This paper introduces the capillary testing method of liquid samples based on Raman spectra, investigates the influence of capillary diameter and different spatial position within the capillary on signal intensity, definds the spatial position to achieve the optimized signal intensity and the standardized testing process.Following the process, testing experiments are carried out.Statistics analysis results of the experiments show that the capillary method could obtain a good testing repeatability.

Raman spectra; liquid sample; capillary; standardized test