趙弘毅，蔣粉榮，陳曉婭，李 坤，潘光兄，蔣利和，趙鐘興，王 靜，劉海波

(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 廣西南寧530004)

中草藥對(duì)銅綠假單胞菌及其群體感應(yīng)抑制作用

趙弘毅，蔣粉榮，陳曉婭，李 坤，潘光兄，蔣利和，趙鐘興，王 靜，劉海波

(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 廣西南寧530004)

為了篩選對(duì)多重耐藥銅綠假單胞菌具有抑菌作用的中草藥，并篩選銅綠假單胞菌的群體感應(yīng)蛋白LasR的抑制劑，本實(shí)驗(yàn)利用紙片擴(kuò)散法對(duì)59株臨床分離的銅綠假單胞菌和1株P(guān)AO1進(jìn)行抗生素藥敏試驗(yàn)，并對(duì)其中3株菌進(jìn)行中草藥提取物體外抑菌試驗(yàn)，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告質(zhì)粒中β-半乳糖苷酶的活性來(lái)篩選LasR蛋白抑制劑。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丁香、赤芍等中藥粗提物具有良好的抑菌效果，部分中草藥可通過(guò)影響LasR蛋白的水溶性或信號(hào)分子與受體蛋白的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌群體感應(yīng)的調(diào)控。

銅綠假單胞菌;多重耐藥性;中草藥;群體感應(yīng)抑制劑

0 引 言

抗生素的發(fā)現(xiàn)是人類醫(yī)學(xué)史上的里程碑，但隨著抗生素類藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重。隨著耐藥菌株大量涌現(xiàn)及蔓延，嚴(yán)重威脅著人類的健康。細(xì)菌耐藥性的出現(xiàn)和耐藥細(xì)菌的感染給臨床抗感染治療帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)，也成為全球最關(guān)注的問(wèn)題之一[1-5]。作為當(dāng)今醫(yī)院感染的首要致病菌之一的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，其耐藥性不斷加劇，耐藥機(jī)制復(fù)雜多變，且耐藥基因在銅綠假單胞菌和其他致病菌中的擴(kuò)散，給臨床治療帶來(lái)極大挑戰(zhàn)[6-8]。

銅綠假單胞菌群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)系統(tǒng)與其毒力因子的啟動(dòng)及其表達(dá)水平有著密切的關(guān)系。群體感應(yīng)參與各種細(xì)胞活動(dòng)，例如細(xì)胞密度控制、次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)、細(xì)胞分化、細(xì)胞膜形成以及毒性[9]。據(jù)現(xiàn)有研究顯示，銅綠假單胞菌的QS系統(tǒng)有三種，分別為las，rhl和喹諾酮信號(hào)系統(tǒng)。las系統(tǒng)是由lasR和lasI基因組成，主要激活LasI和LasR蛋白的轉(zhuǎn)錄[10]，進(jìn)而指導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)分子3OC12-HSL(N-3-氧代十二烷酰-L-同型絲氨酸內(nèi)酯，AHL)的合成。當(dāng)信號(hào)分子達(dá)到一定值后，細(xì)菌會(huì)控制毒性基因的表達(dá)。目前，抑制細(xì)菌群體感應(yīng)的途徑主要有降解信號(hào)分子、抑制信號(hào)分子合成和干擾受體蛋白與信號(hào)分子結(jié)合[11]。其中，通過(guò)干擾受體蛋白與信號(hào)分子來(lái)抑制群感效應(yīng)的可行性高，篩選高效的群體感應(yīng)抑制劑有望成為解決細(xì)菌耐藥問(wèn)題的一個(gè)有效途徑。

傳統(tǒng)的抗菌藥物都是以細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成、細(xì)胞壁的合成、DNA超螺旋、葉酸的合成等為靶點(diǎn)，通過(guò)干擾細(xì)菌的重要生命過(guò)程直接將其殺死或者抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)抗感染的目的，但由于細(xì)菌本身具有快速適應(yīng)性和進(jìn)化能力，在這種生存壓力下，極其容易產(chǎn)生耐藥性和微生物菌群失調(diào)等負(fù)面作用。以細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)為靶標(biāo)篩選出來(lái)的抗菌藥物，與傳統(tǒng)的抗生素的作用機(jī)制完全不同，此類藥物只抑制細(xì)菌群體感應(yīng)調(diào)控的致病行為，不殺死細(xì)菌不抑制其生長(zhǎng)，最終使病原菌無(wú)法對(duì)抗宿主的免疫防御而被機(jī)體自身清除。因此，理論上不會(huì)引起細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。

中草藥在我國(guó)有著悠久的歷史，其中一些草藥具有明顯的抗菌作用。中草藥的主要有效成分為生物堿類、多酚類、萜類和黃酮類化合物[12-14]。廣西壯族自治區(qū)的藥用植物資源豐富，約占全國(guó)的藥用植物資源總量的三分之一。而本文充分利用我區(qū)中草藥資源優(yōu)勢(shì)，尋找具有抗耐藥菌作用的中草藥，并從中草藥中篩選出有效的群體感應(yīng)抑制劑，解決銅綠假單胞菌的多重耐藥性問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 藥敏紙片、中草藥及培養(yǎng)基

中草藥在南寧市藥店購(gòu)買獲得(見(jiàn)表1)；抗生素藥敏紙片通過(guò)杭州天和微生物試劑有限公司購(gòu)買獲得；LB培養(yǎng)基與技術(shù)瓊脂粉分別在北京陸橋科技有限責(zé)任公司和廣東環(huán)凱微生物科技有限公司購(gòu)買獲得。

1.2 菌株

本文所用菌株和質(zhì)粒如表2所示。

表1 實(shí)驗(yàn)中使用的中草藥
Tab.1 Chinese herbal medicine used in this study

樣品名稱八角茴香(1)烏梅(2)何首烏(3)石榴皮(4)花椒(5)川木香(6)丁香(7)馬齒莧(8)蒼耳子(9)茜草(10)五加皮(11)金錢草(12)兩面針(13)連翹(14)知母(15)瞿麥(16)厚木(17)白芥子(18)甘草(19)補(bǔ)骨脂(20)敗醬草(21)夏枯草(22)天冬(23)菊花(24)竹茹(25)柴胡(26)漏蘆(27)海金沙(28)山茱萸(29)五味子(30)升麻(31)山楂(32)苦參(33)黃柏(34)魚腥草(35)紫蘇(36)川芎(37)紫菀(38)枇杷葉(39)雷公藤(40)秦皮(41)板藍(lán)根(42)赤芍(43)百部(44)白天翁(45)大黃(46)穿心蓮(47)防己(48)肉桂(49)五倍子(50)虎杖(51)蒲公英(52)防風(fēng)(53)柴草(54)槐花(55)金銀花(56)廣藿香(57)肉豆蔻(58)白芷(59)胖大海(60)垂盆草(61)野菊花(62)薄荷(63)半枝蓮(64)地榆(65)黃苓(66)豬苓(67)半邊蓮(68)地膚子(69)丹參(70)姜黃(71)石菖蒲(72)藁本(73)黨參(74)茯苓(75)鵝不食草(76)土荊皮(77)前胡(78)鹿銜草(79)黃蓮(80)續(xù)斷(81)

表2 研究中所用的菌株和質(zhì)粒
Tab.2 Strains and plasmids used in this study

菌株描述來(lái)源PaeruginosaPAO1sourceforlasRgeneRochester，USAEcoliBL21(DE3)HLrecombinantEcoliBL21harboringhis?lasR韓國(guó)釜山大學(xué)EcoliDH(5α)host韓國(guó)釜山大學(xué)臨床分離菌株withmulti?drugresistancegene廣西醫(yī)科大學(xué)質(zhì)粒描述來(lái)源pET?28a?lasRlasRgeneinpET?28a；Kanr韓國(guó)釜山大學(xué)pJN105LproduceLasR；GmR韓國(guó)釜山大學(xué)pSC11lasI?lacZreporterplasmid；ApR韓國(guó)釜山大學(xué)

1.3 中草藥有效成分提取

將中草藥分別稱取4 g，其中2 g用10 mL 100%的無(wú)水乙醇浸泡，2 g用10 mL 50 %的乙醇浸泡，浸泡時(shí)間為2 d以上。

1.4 抑菌試驗(yàn)方法

臨床分離的銅綠假單胞菌的藥敏實(shí)驗(yàn)和中藥抑菌實(shí)驗(yàn)均使用紙片法進(jìn)行。通過(guò)抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)，篩選出耐藥性最強(qiáng)和耐藥性最弱的兩株菌供抑菌實(shí)驗(yàn)使用。

1.5 LasR蛋白的表達(dá)

為了表達(dá)LasR蛋白，將含有pET-28a-lasR的大腸桿菌BL21(DE3)菌株接種到100 mL含有50 μg/mL卡那霉素和0.5 mL中藥提取液的LB培養(yǎng)液中，當(dāng)在600 nm下的光密度為0.5時(shí)，將培養(yǎng)物迅速冷卻到20 ℃，用0.1 mmol的異丙基-β-D-氨基半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，在17 ℃下過(guò)夜培養(yǎng)，離心收獲細(xì)胞。將細(xì)胞用50 mmol磷酸鉀緩沖液(pH 7.0)洗滌2次，并重懸于緩沖液中。使用超聲細(xì)胞破碎器將細(xì)胞破碎，將細(xì)胞裂解液進(jìn)行離心分離，并使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，使用考馬斯亮藍(lán)G-250進(jìn)行蛋白染色。

1.6 β-半乳糖苷酶活性分析

在30 ℃下，將含有pJN105L和pSC11質(zhì)粒的大腸桿菌DH(5α)菌株放入含有10 μg/mL慶大霉素和50 μg/mL的氨芐西林的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)在600 nm下的光密度為0.3時(shí)，將0.5 mL培養(yǎng)物分散到2 mL的Ep離心管中，加入AHLs(20 mmol)、中藥提取物(1 μL)和阿拉伯糖(0.04 %)，250 r/min和30 ℃條件下培養(yǎng)3～4 h。離心收獲細(xì)胞，用Z buffer[Na2HPO4·7H2O(60 mmol)、NaH2PO4·H2O(40 mmol)、KCl(10 mmol)、MgSO4·7H2O(1 mmol)、β-巰基乙醇(50 mmol)]清洗1次并重懸。測(cè)定細(xì)胞密度OD600值后，取200 μL重懸液加入到含有800 μL的Z Buffer、40 μL氯仿和16 μL 0.1 % SDS的Ep管中，反復(fù)吸取充分溶解細(xì)胞。取水相400 μL，加入80 μL的鄰-硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG：4 mg/mL 溶劑為磷酸緩沖液)，反應(yīng)20 min左右出現(xiàn)顯色反應(yīng)，加入200 μL的Na2CO3溶液(1 mol)終止反應(yīng)。分別測(cè)OD420和OD550。Miller單位用方程計(jì)算：

Miller Units = 1000× (OD420-1.75 ×OD550)/(T×V×OD600),

其中:T為反應(yīng)時(shí)間，min，V為實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)物的體積，mL；Miller單位與酶的活性成正比。

2 結(jié)果與討論

2.1 銅綠假單胞菌的臨床來(lái)源分布

醫(yī)院感染是人類面臨的一個(gè)難題，它是導(dǎo)致患者病情加重甚至導(dǎo)致死亡率上升的主要原因。在能夠引起醫(yī)療感染的細(xì)菌中，銅綠假單胞菌是首要致病菌之一。銅綠假單胞菌在自然界中廣泛存在，在人體的皮膚、腸道以及呼吸道中都有其存在，是臨床分離率相當(dāng)高的革蘭氏陰性致病菌。當(dāng)人體免疫力下降時(shí)，十分容易感染該菌，造成呼吸道、腸道等感染。由于銅綠假單胞菌很容易附著在醫(yī)療器械上，所以在重癥監(jiān)護(hù)室中機(jī)械通氣的病人十分容易受到它的感染，死亡率非常高。重癥監(jiān)護(hù)室的患者多數(shù)來(lái)源于神經(jīng)外科、神經(jīng)內(nèi)科和呼吸科。本試驗(yàn)中使用的59株銅綠假單胞菌均來(lái)源于以下科室(表3)患者的分泌物、尿液、痰液、膿液等樣本。

表3 59株銅綠假單胞菌的臨床來(lái)源分布
Tab.3 Distribution of 59P.aeruginosaclinical samples

科室菌株數(shù)比例/%感染性疾病科4678神經(jīng)外科4678中醫(yī)科81356重癥科132203呼吸內(nèi)科2339兒科91525腫瘤內(nèi)科2339口腔科3508腎內(nèi)科2339神經(jīng)內(nèi)科3508燒傷整形外科2339創(chuàng)傷骨科手外科2339五官科2339血液內(nèi)科3508

2.2 銅綠假單胞菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)制主要包括生化機(jī)制和遺傳機(jī)制。其中生化機(jī)制主要指以下幾個(gè)方面：①形成細(xì)菌生物膜，阻止抗生素的等藥物進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)[9];②主動(dòng)外排機(jī)制;③誘導(dǎo)酶修飾;④組織滲透;⑤產(chǎn)生酶使得抗生素類藥物失效。而研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的遺傳機(jī)制則與染色體介導(dǎo)、轉(zhuǎn)座子和整合子有關(guān)。

實(shí)驗(yàn)中使用的20種抗生素分別屬于β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類及喹諾酮類抗生素。而根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，針對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的基因有oxa1, oxa2，oxa5，oxa10, shv2, tem, ctxm-1, imp, vim, blaZ, mecA, aac, fox, act, ctxm-NG-1, ctxm-NG-2, ctxm-NG-4, cny2, kpc, ges基因，針對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥的基因有aac，aph-Ⅲ，ant基因，針對(duì)喹諾酮類抗生素耐藥的基因?yàn)閜nra。銅綠假單胞菌的多重耐藥機(jī)制主要有：①由于大量的β-內(nèi)酰胺類抗生素在臨床上使用，使得銅綠假單胞菌產(chǎn)生大量的頭孢菌素酶(AmpC酶)，使得其此類抗生素耐藥;②青霉素結(jié)合蛋白發(fā)生改變[15-16];③銅綠假單胞菌胞外膜蛋白的減少使得抗生素類物質(zhì)很難進(jìn)入到細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)[17];④生物膜的產(chǎn)生是其具有多藥耐藥性的重要原因之一。

本文對(duì)59株臨床菌株和1株野生菌株P(guān)AO1進(jìn)行了藥敏分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，60株銅綠假單胞菌對(duì)阿莫西林、氨芐西林、頭孢曲松、頭孢唑林、頭孢西丁、呋喃妥因、復(fù)方新諾明和替加環(huán)素是完全耐藥的，說(shuō)明了銅綠假單胞菌具有多重耐藥性；阿米卡星、左氧氟沙星、和妥布霉素等抗生素藥物具有良好的抑菌效果(見(jiàn)表4)。通過(guò)抗生素藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選出一株抗藥性最強(qiáng)的菌(#5336)和一株抗藥性最弱的菌(#5685)作為中藥抑菌實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。

表4 59株銅綠假單胞菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果
Tab.4 Antibiotics susceptibility test of 59P.aeruginosastrains

抗生素敏感(S)中敏(I)耐藥(R)頭孢哌酮/舒巴坦20(3333%)9(1500%)31(5167%)阿莫西林/棒酸0(%)0(%)60(10000%)阿米卡星48(8000%)0(%)12(2000%)氨芐西林0(%)—60(10000%)氟曲南25(4167%)10(1667%)25(4167%)頭孢他啶44(7333%)1(167%)15(2500%)環(huán)丙沙星45(7500%)2(333%)13(2167%)頭孢曲松0(%)0(%)60(10000%)頭孢唑林0(%)0(%)60(10000%)頭孢吡肟35(5833%)11(1833%)14(2333%)頭孢西丁0(%)0(%)60(10000%)慶大霉素42(7000%)4(667%)14(2333%)亞胺培南43(7167%)2(333%)15(2500%)左氧氟沙星46(7667%)3(500%)11(1833%)呋喃妥因0(%)—60(10000%)哌拉西林40(6667%)1(167%)19(3167%)復(fù)方新諾明0(%)0(%)60(10000%)替加環(huán)素0(%)0(%)60(10000%)妥布霉素46(7667%)0(%)14(2333%)他唑巴坦34(5667%)13(2167%)13(2167%)

2.3 銅綠假單胞菌中藥抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

針對(duì)目前銅綠假單胞菌多重耐藥性的現(xiàn)狀，研究如何使用中草藥消除細(xì)菌耐藥性成為了熱點(diǎn)。根據(jù)研究顯示，中草藥能夠消除細(xì)菌耐藥性的機(jī)制主要是其對(duì)β-內(nèi)酰胺類有一定的抑制作用、對(duì)細(xì)菌生物膜的形成也有抑制作用。中草藥還可以降低細(xì)菌細(xì)胞的主動(dòng)外排功能和消除耐藥質(zhì)粒等方式解決細(xì)菌耐藥性問(wèn)題。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(見(jiàn)表5)，針對(duì)耐藥性較強(qiáng)的菌株(#5336)，81種中草藥均沒(méi)有顯著的抑菌效果。而針對(duì)耐藥性較弱的菌株(#5685)，丁香、赤芍以及五倍子三種中藥無(wú)論是用100 %乙醇還是50 %乙醇溶劑提取，均具有良好的抑菌效果。針對(duì)野生銅綠假單胞菌PAO1，金銀花、丁香、赤芍以及黃柏四種中藥無(wú)論是用100 %乙醇還是50 %乙醇溶劑提取，均具有良好的抑菌效果。

表5 81種中草藥抑菌篩選結(jié)果
Tab.5 Results of the antimicrobial activities of 81 Chinese herbal medicine

菌株有抑菌效果的中藥溶劑：100%乙醇溶劑：50%乙醇水溶液#5336—1—#5685丁香、赤芍、五倍子、石菖蒲、黃柏丁香、馬齒莧、赤芍、五倍子、甘草PA-O1赤芍、黃柏、金銀花、穿心蓮、川木香、大黃、茯苓、丁香、槐花、甘草、烏梅、車前草金銀花、丁香、赤芍、紅花、虎杖、百部、黃苓、續(xù)斷、黃柏

注：1. “-”表示所篩選的中草藥對(duì)該菌株沒(méi)有抑制效果。

丁香的主要成分有丁香酚和石竹烯，其中丁香酚具有良好的抗氧化作用和較強(qiáng)的抑菌效果，在臨床上應(yīng)用十分廣泛。而石竹烯也具有抗氧化作用，在治療皮膚炎癥方面有很好的效果。赤芍的主要成分為單萜苷類，單萜苷類物質(zhì)含量最高的為芍藥苷，試驗(yàn)中赤芍對(duì)于銅綠假單胞菌有很好的抑制效果，很可能是由于芍藥苷具有抑菌作用。黃柏的主要成分為生物堿、黃柏內(nèi)酯和黃柏酮，其中生物堿可以治療炎癥并對(duì)細(xì)菌有抑制作用，也具有抗癌的作用。五倍子的主要成分為沒(méi)食子酸、黃芩苷、蒽醌、槲皮素和鞣質(zhì)，這些成分均具有抑菌作用，其中含量最高的為沒(méi)食子酸。實(shí)驗(yàn)證明五倍子與黃柏兩種中藥均有較好的抑菌效果。金銀花的主要抑菌成分為有機(jī)酸類，包括綠原酸、白果醇、芳樟醇和木犀草素。其中綠原酸含量最高，其對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌都有抑制作用，是一種十分重要的生物活性組分，在臨床抗菌抗病毒方面有很好的效果。

2.4 LasR蛋白水溶性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在大腸桿菌中表達(dá)LasR蛋白后，通過(guò)對(duì)比LasR蛋白條帶，發(fā)現(xiàn)不同中藥的活性成分對(duì)于LasR蛋白的可溶性影響各有不同。如圖1所示，部分加入中藥的試樣蛋白條帶明顯比空白樣品要細(xì)，說(shuō)明該種中草藥提取物中有可能含有能夠抑制群體感應(yīng)蛋白的活性分子，可通過(guò)影響LasR蛋白的水溶性來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)菌群體感應(yīng)的調(diào)控。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明有抑制作用的中草藥有八角茴香(1)、何首烏(3)、石榴皮(4)、丁香(7)、蒼耳子(9)、甘草(19)、秦皮(41)、大黃(46)、胖大海(60)。

2.5 β-半乳糖苷酶的活性

本實(shí)驗(yàn)利用QS系統(tǒng)中 LasR蛋白與3OC12-HSL信號(hào)分子結(jié)合而形成具有啟動(dòng)基因啟動(dòng)子作用的結(jié)合蛋白，進(jìn)行調(diào)控報(bào)道基因lacZ(編碼β-半乳糖苷酶)的表達(dá)；當(dāng)使用鄰-硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)為底物，其可被β-半乳糖苷酶裂解產(chǎn)生半乳糖和一個(gè)黃色的鄰硝基苯酚；當(dāng)LasR活性被中藥活性分子抑制時(shí)，黃色的鄰硝基苯酚產(chǎn)物濃度將會(huì)降低，故可通過(guò)測(cè)定該產(chǎn)物測(cè)的吸光度來(lái)確定中草藥中是否含有活性成分。

ONPG被β-半乳糖苷酶裂解產(chǎn)生半乳糖和一個(gè)黃色的鄰硝基酚。當(dāng)ONPG(4 mg/mL)過(guò)剩且在混合物中酶反應(yīng)超過(guò)30 min時(shí)單位時(shí)間產(chǎn)生的鄰-硝基苯酚與β-半乳糖苷酶的濃度成正比。如圖2所示，實(shí)驗(yàn)中有18種中草藥β-半乳糖苷酶的活性均有一定程度的抑制作用，其中1～18分別為防己、虎杖、紫苑、豬苓、菊花、白芥子、赤芍、蒿本、鹿銜草、山茱萸、甘草、廣藿香、茜草、兩面針、薄荷、川穹、石榴皮、五倍子。通過(guò)與空白(kb)對(duì)照，可以看出18種中草藥提取物抑制效果較好的是紫菀、豬苓、山茱萸和石榴皮，分別為58.7 %、60.3 %、65.4 %和64.9 %。

圖1 中草藥對(duì)LasR蛋白產(chǎn)生的影響Fig.1 Effect of Chinese herbal medicine on the production of LasR

圖2 中草藥活性成分對(duì)β-半乳糖苷酶活性抑制結(jié)果Fig.2 Inhibitory effects of active ingredients of Chinese herbal medicine against β-galactosidase activity

3 結(jié) 語(yǔ)

本研究針對(duì)銅綠假單胞菌的多重耐藥性，采用藥敏法確定了臨床分離的銅綠假單胞菌株的耐藥情況分布，并通過(guò)紙片擴(kuò)散法篩選出具有抑菌作用的中草藥。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，81種中草藥對(duì)耐藥性較強(qiáng)的菌株無(wú)顯著的抑菌作用。而對(duì)耐藥性較弱的菌株，丁香、赤芍以及五倍子三種中藥提取物均具有良好的抑菌效果。對(duì)于野生銅綠假單胞菌(PAO1)，金銀花、丁香、赤芍以及黃柏四種中藥的100 %乙醇與50 %乙醇提取物，均具有較強(qiáng)的抑菌效果。通過(guò)抑制LasR蛋白電泳實(shí)驗(yàn)與β-半乳糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)，從81種中草藥篩選出了若干個(gè)銅綠假單胞菌的LasR群體感應(yīng)抑制劑，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為今后解決銅綠假單胞菌耐藥問(wèn)題提供了一定的理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯 張曉云 梁碧芬)

Inhibitory effects of Chinese herbal medicine against multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa and its quorum-sensing

ZHAO Hong-yi，JIANG Fen-rong, CHEN Xiao-ya, LI Kun, PAN Guang-xiong, JIANG Li-he, ZHAO Zhong-xing, WANG Jing, LIU Hai-bo

(School of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University，Nanning 530004，China)

The aim of this study is to screen the bioactive molecules from Chinese medicine, which either interfere the bacterial quorum sensing in multi-drug resistantPseudomonasaeruginosaor simply inhibit its growth. TheP.aeruginosastrains isolated from clinic samples were tested for antimicrobial sensitivity using disk diffusion method. Screening of quorum sensing inhibitors from Chinese herbal medicines were carried out by monitoring the activity ofβ-galactosidase (LacZ) in reporter strains, which can be used for screening quorum-sensing signal molecules and inhibitors. The agar diffusion test results indicated that the alcoholic extracts of Clove and Radix Paeoniae Rubra showed strong antimicrobial activity againstP.aeruginosa. The SDS-PAGE gel results further suggested that the active components of Chinese herbal medicine interfered bacterial quorum sensing by reducing the amount of active LasR protein in soluble fraction or competitively binding to the signal molecules binding domain in receptor proteins.

Pseudomonasaeruginosa; multi-drug resistant; Chinese herbal medicine; quorum-sensing inhibitor

2016-05-11；

2016-06-30

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31360020;31560014);廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2014GXNSFCA118003);廣西大學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(XGZ130080)

劉海波(1981—)，男，廣西梧州人，廣西大學(xué)教授，博士；E-mail: lwllhb@gxu.edu.cn。

趙弘毅，蔣粉榮，陳曉婭,等.中草藥對(duì)多重耐藥的銅綠假單胞菌及其群體感應(yīng)抑制作用[J].廣西大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2016，41(6)：2031-2038.

10.13624/j.cnki.issn.1001-7445.2016.2031

O622

A

1001-7445(2016)06-2031-08