楊獻光 和春翠 朱 琳 徐存拴

(河南師范大學生命科學學院，新鄉(xiāng)453007)

肝干細胞移植治療肝損傷的研究進展①

楊獻光 和春翠 朱 琳 徐存拴

(河南師范大學生命科學學院，新鄉(xiāng)453007)

肝臟是人體重要的器官，執(zhí)行合成代謝、解毒和免疫防御等許多重要的功能。近年來，由于病毒性感染、毒性損傷、遺傳缺陷及長期接觸代謝金屬鐵和銅等造成肝功能紊亂和急、慢性肝損傷和肝硬化[1]，使得肝臟相關(guān)疾病的發(fā)病率和死亡率不斷上升。原位肝移植被認為是治療終末期肝損傷最有效的方法之一，但由于缺乏合適的肝供體、手術(shù)風險、免疫排斥、高成本及長期并發(fā)癥等問題嚴重限制其臨床應用[2]。近年來，將干細胞或由其分化產(chǎn)生的功能細胞植入病變部位的細胞療法逐漸受到人們的關(guān)注。然而，人類原代肝細胞的數(shù)量和增殖能力有限，并且在體外培養(yǎng)時存在快速去分化的缺陷，使得分離后的肝細胞需要持續(xù)不斷的提供大量的氧和營養(yǎng)物質(zhì)來維持它們的表型和特定的肝功能，為了解決這個問題，依賴肝干細胞的療法越來越受到人們的重視[3]。

肝干細胞是成人體內(nèi)存在的具有自我增殖和多向分化潛能的一類細胞，在終末期肝病患者模型中肝干細胞可分化形成肝細胞、膽管上皮細胞和其他組織細胞[4]。干細胞移植具有供體來源豐富、手術(shù)損傷小、免疫排斥小、費用低等優(yōu)點。通過肝干細胞移植可以修復損傷的肝臟，提高患者存活率。因此，本文對肝干細胞的來源，肝移植的相關(guān)技術(shù)和移植細胞在損傷組織的遷移作一綜述。

1 誘導肝損傷的模型

1.1 藥物中毒性肝損傷的模型 Proctor等[5]首次提出了四氯化碳(CCl4)中毒誘導嚙齒類動物肝損傷的模型。將溶于橄欖油或花生油中的0.5～1 ml/kg CCl4通過腹腔或皮下組織注入到小鼠體內(nèi)，每周注射2次，持續(xù)4～8周后將會誘導小鼠的肝損傷[6]。其作用機制是：CCl4的活性代謝產(chǎn)物三氯甲基自由基刺激活性中間產(chǎn)物(ROI)的產(chǎn)生，ROI造成脂質(zhì)過氧化，從而引起細胞損害和結(jié)締組織增多，進而造成肝損傷。

對乙酰氨基酚(APAP)也是造成肝臟嚴重壞死的最常見的藥物毒素，通過腹腔注射300 mg/kg的APAP會造成急性肝實質(zhì)損傷[7]。Kofman等[8]證明APAP具有劑量依賴性的特點，過量的APAP將會誘導活性代謝產(chǎn)物N-乙酰對苯醌亞胺(NAPQI)的積累，從而造成線粒體中過氧化亞硝酸鹽生成。這種氧化應激和溶酶體的鐵吸收共同形成線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)，破壞線粒體膜電位的平衡，抑制ATP的合成，進而造成肝損傷。

1.2 酒精誘導肝損傷的模型 長期過量飲酒將會引起中毒性肝臟疾病如酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝硬化等。肝臟是酒精代謝的重要場所，在肝內(nèi)，乙醇主要被細胞質(zhì)中的乙醇脫氫酶(ADH)和細胞色素P450ⅡE1(CYPⅡE1)及過氧化物酶系氧化，由此產(chǎn)生的氧化應激和膜磷脂過氧化可在短期內(nèi)導致肝損傷[9]。

1.3 手術(shù)誘導肝損傷的模型 肝切除術(shù)也是誘導肝損傷的一種方法。在全身麻醉的條件下切除小鼠2/3的肝臟后，再加入2 mg/kg的等小鼠體重的2-乙酰氨基芴(2-AFF)來抑制肝臟再生，進而造成肝損傷[10]。上述幾種模型誘導的肝損傷可通過干細胞的移植來得以修復。

2 肝干細胞的類型和功能

肝干細胞(HSC)是成人體內(nèi)存在的一種具有自我更新和多向分化潛能的細胞，是與肝臟發(fā)育和再生有關(guān)的各類具有干細胞特性類型細胞的總稱。HSC在特定條件下可分化形成肝細胞參與肝臟損傷后的結(jié)構(gòu)和功能的修復，與肝臟的發(fā)育、再生、纖維化等過程密切相關(guān)。HSC是多源的，如成熟肝細胞、肝卵圓細胞、胚胎干細胞、成體干細胞、誘導多能干細胞等。肝干細胞的肝樣分化流程如圖1所示[11]。

圖1 肝干細胞的肝樣分化Fig.1 Hepatocyte-like cells differentiation of hepatic stem cell

2.1 成熟肝細胞 人們普遍認為它是一種終末分化細胞，不再具有增殖和分化能力。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，成熟肝細胞不僅可以自我復制70次以上，而且還具有歸巢能力[12]，即成熟肝細胞具有一定的可塑性和增殖分化潛能。當肝臟受到輕微的損傷時，肝臟肝細胞將重新進入到細胞周期，通過代償性增生促進肝臟的修復和再生。對于終末期肝損傷，可通過體外移植成熟肝細胞來緩解肝損傷。De等[13]表明在進行性家族性肝內(nèi)膽汁淤積Ⅲ型小鼠損傷模型中，通過肝細胞的移植可明顯降低肝纖維化的程度和恢復磷脂的分泌。但由于肝細胞稀少珍貴、增殖能力有限、不耐冷凍保存且移植肝細胞的功效具有時間依賴性等缺陷，使得肝細胞移植療法的大規(guī)模使用存在一定的局限性。

2.2 肝卵圓細胞 1956年，F(xiàn)arber等[14]首次發(fā)現(xiàn)了肝前體細胞并根據(jù)形狀將其命名為卵圓細胞，它是一種小的，具有較大核質(zhì)比的雙向分化干細胞。對于肝卵圓細胞(HOC)的來源存在一定的爭議，大部分學者認為HOC是位于門靜脈周圍肝細胞和最小終末支膽管細胞過渡區(qū)的Hering管中。目前，通常利用2-乙酰氨基芴(2-AAF)結(jié)合2/3肝切除大鼠模型來誘導HOC的激活，使其定向遷移至受損傷的肝臟。Evarts等[15]研究表明HOC首先轉(zhuǎn)變?yōu)槭葔A性小肝細胞，再形成完全成熟的肝細胞，同時檢測到放射性標記的胸苷從卵圓細胞轉(zhuǎn)移到新形成的肝細胞中。Li等[16]將HOC移入肝損傷的小鼠體內(nèi)能顯著降低血清中肝損傷標志物如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、直接膽紅素(DBil)、谷酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)等的水平，從而緩解肝損傷。因此，HOC可作為一種內(nèi)源性的肝干細胞發(fā)揮肝損傷修復作用。

2.3 胚胎干細胞 胚胎干細胞(ESCs)是從受精卵內(nèi)胚層中分離出來的一類多潛能細胞，當ESCs在去除小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)飼養(yǎng)層或白血病抑制因子(LIF)的懸浮培養(yǎng)基培養(yǎng)時，能夠聚集形成包含三個胚層細胞的胚狀體(EBs)，進而分化形成各類細胞[17]。當ESCs在含有丁酸鈉、小鼠肝細胞生長因子(rMuHGF)和地塞米松(Dex)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可被誘導分化為表達肝細胞標志物如白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(TTR)的肝樣細胞；利用類似的細胞因子組合如激活素A(Activin A)、亞硒酸(ITS)、成纖維細胞生長因子4(FGF4)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)及骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)可將人的ESCs逐步誘導為肝樣細胞。將小鼠ESCs注射到CCl4誘導的肝損傷小鼠體內(nèi)，在小鼠體內(nèi)出現(xiàn)功能性的肝樣細胞，通過與肝實質(zhì)融合發(fā)揮損傷修復功能。但ESCs的使用存在倫理道德和免疫排斥問題，我們需要不斷尋找新的細胞來源。

2.4 誘導多能干細胞 誘導多能干細胞(iPSCs)是通過病毒載體把一些特定的轉(zhuǎn)錄因子組合(oct4、 sox2 、klf-4 和c-cmy)導入體細胞而獲得具有干細胞特性的一類細胞。iPSCs具有與ESCs相似的多樣分化潛能，除形成神經(jīng)、骨、造血和內(nèi)皮細胞外，還是應用于再生醫(yī)學和藥物開發(fā)中的肝細胞的潛在來源[18]。Sun等[19]研究大鼠iPSCs的肝樣分化，分別在誘導的0～5、5～10、10～20 d用wnt3a、Activin A組合、FGF4和BMP2組合、OSM、HGF和Dex組合分階段誘導。結(jié)果顯示在內(nèi)胚層誘導階段有其特異標志蛋白FOXA2、SOX17的表達，在肝細胞誘導階段有其特異標志物ALB、AFP、CK18等和功能性的蛋白AAT、CYP1A2和CYP3A4的表達。因此iPSCs可作為一種替代的細胞療法用于肝再生。

2.5 成體干細胞 成體干細胞(ASCs)是存在于分化組織中的未分化細胞，具有自我更新能力，能夠形成該類組織或其他組織的新細胞。間充質(zhì)干細胞(MSC)是最重要的ASCs，可以從成體組織如骨髓、脂肪組織、胎盤、臍血等分離獲得，且能在生長因子、細胞因子、肝細胞或非實質(zhì)肝細胞的作用下分化形成肝樣細胞。目前，骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)和脂肪間充質(zhì)干細胞(ADMSCs)研究較多。

2.5.1 骨髓間充質(zhì)干細胞 骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)是研究最早、最深入的成體干細胞，因其具有獲取容易、易培養(yǎng)、免疫原性低和多向分化潛能等優(yōu)點，逐漸成為肝細胞移植的理想細胞。20世紀60年代，F(xiàn)riedenstein等[20]首次通過密度梯度離心法從骨髓中分離出BMSCs，研究發(fā)現(xiàn)BMSCs在骨髓中的含量很少，約占有核細胞的0.001%～0.01%，但卻能高效的分化成各類細胞系。目前認為BMSCs主要通過細胞轉(zhuǎn)分化和細胞融合兩種途徑在體內(nèi)或體外被誘導分化為肝前體細胞(HLCs)。將從人類、大鼠、小鼠骨髓中分離的BMSCs連續(xù)暴露于FGF-4、HGF、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒和Dex中培養(yǎng)，可以檢測到肝細胞標志物HNF-3β、ALB、AFP 、GATA4和CK19的表達，并具有分泌尿素和ALB、儲存細胞糖原、攝取LDL等功能，經(jīng)苯巴比妥誘導可表達細胞色素P450。體外實驗表明將人類BMSCs與胰島素生長因子-1(IGF-1)、煙酰胺、肝細胞核因子4ɑ(HNF-4ɑ)、丙戊酸混合培養(yǎng)時，能顯著提高其向肝細胞的分化率和肝細胞特征基因表達水平。此外，BMSCs與宿主肝實質(zhì)細胞通過細胞融合機制參與組織修復，呈現(xiàn)典型的肝細胞表型，可形成肝臟特定的三維結(jié)構(gòu)[21]。最新研究發(fā)現(xiàn)將BMSCs在含有特定生長因子(GFs)的海藻酸鹽支架中培養(yǎng)，也會表達肝臟特異性標志物[22]。

BMSCs的肝樣分化潛能可以用來治療肝損傷。實驗表明BMSCs移植后通過減少炎性細胞的浸潤和抑制肝細胞的凋亡來緩解肝損傷。Li等[23]表明自體BMSCs可分化形成肝細胞促進殘余肝臟再生，且通過上調(diào)血管上皮生長因子(VEGF)、HGF、IL-10和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的基因表達減少膠原沉積，緩解肝硬化門靜脈栓塞現(xiàn)象。此外，BMSCs還可以通過旁分泌機制釋放各種細胞因子如SDF-1ɑ、VEGF、bFGF、IGF-1、HGF等改善肝臟微環(huán)境，研究發(fā)現(xiàn)BMSCs可通過SDF-1ɑ/CXCR4、SDF-1ɑ/VEGF參與BMSCs的歸巢和促進壞死細胞凋亡，提高BMSCs治療急性肝損傷的療效[24]。

BMSCs作為治療肝損傷的有效替代療法，還需大量的隨機和對照試驗評估其作用，以期達到臨床應用的安全性。

2.5.2 脂肪間充質(zhì)干細胞 脂肪間充質(zhì)干細胞(ADMSCs)具有與BMSCs相似的自我更新和多樣分化潛能。ADMSC含量豐富，且能很容易的從脂肪抽吸物或切除的脂肪中獲取，因此逐漸成為人們研究的熱點。2001年，Zuk等[25]首次利用膠原酶分離得到ADMSCs。隨后研究發(fā)現(xiàn)ADMSCs在含有OSM、HGF、二甲基亞砜(DMSO)的培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)時，細胞形態(tài)由扁平、細長、梭狀轉(zhuǎn)變?yōu)榫o密相連的圓形上皮細胞，有明顯的膽小管結(jié)構(gòu)和成熟肝細胞表型。此外，在ADMSCs誘導分化培養(yǎng)基中加入曲古抑菌素A(TSA)[26]，將明顯提高其肝樣分化率。

移植的ADMSCs和BMSCs一樣，也能夠改善肝功能，促進肝再生[27]。ADMSCs通過釋放可溶性因子如HGF、LIF、前列腺素E2抑制免疫細胞的激活，降低免疫排斥反應，從而提高移植效率。Zhang等[28]表明與單層培養(yǎng)獲得的ADMSCs相比，球體派生的ADMSCs具有更好的治療肝損傷的效果。

由于ADMSCs具有來源廣泛、獲取容易、多樣分化潛能和沒有倫理道德問題等優(yōu)點，逐漸受到人們的青睞，但ADMSCs治療肝損傷的具體作用機制還需要進一步的闡明。

3 肝干細胞移植的部位和方法

肝干細胞可以通過不同的部位移植到實驗動物大鼠(小鼠)體內(nèi)，移植的細胞通過聚集黏附、存活、產(chǎn)生肝臟來修復肝損傷。移植肝干細胞的方法主要有以下幾種：

3.1 門靜脈 門靜脈由于具有大量的血管通路，因此是最常用的干細胞的移植路徑。將1×106個懸浮培養(yǎng)于30 μl PBS或DMEM中的細胞通過門靜脈移植到試驗動物體內(nèi)，可達到預期的試驗目的。Yuan等[24]表明與尾靜脈注射BMSCs相比，門靜脈注射后能更顯著增加血清中SDF-1、VEGF水平來治療急性肝衰竭(ALF)。

3.2 脾內(nèi)注射 脾內(nèi)注射也是最常用的治療肝損傷的細胞傳遞路線，當90%的肝切除或肝臟嚴重受損不適合干細胞移植時，脾內(nèi)細胞移植將成為有效的替代方式。移植的肝干細胞通過脾內(nèi)血液流入殘余肝臟，使其在肝臟中維持較高的細胞濃度來促進殘余肝再生。由于脾內(nèi)移植的大部分細胞是通過門靜脈遷移至肝臟，可能會造成門靜脈栓塞等并發(fā)癥，因此為了防止注射時細胞泄露，可以通過脾血管暫時封閉來減少栓塞、猝死和門靜脈高壓。

3.3 腹腔內(nèi)注射 腹腔體積較大，允許大量細胞移植，易于操作，侵入性和創(chuàng)傷較小，沒有器官栓塞等優(yōu)點，逐漸被用作治療性細胞移植的良好場所。

3.4 肝內(nèi)注射 肝干細胞直接灌注于肝臟有利于這些細胞快速在肝臟增殖再生，大大提高增殖效率，然而此方法操作復雜，侵入性損傷較大。此外，當細胞移植到病肝中，此時的肝臟微環(huán)境可能已不適合干細胞發(fā)揮其作用。

4 肝干細胞在肝臟內(nèi)定居、遷移和分化的示蹤觀察

為了更好地了解細胞輸注路線、定向遷移和移植后的治療效果，通過使用磁性、熒光標記、射頻成像等標記方法來追蹤移植的細胞。

4.1 紅色熒光染料PKH26 紅色熒光染料PKH26[6]是一種無毒的，且對標記細胞的生物活性和增殖能力沒有任何影響的標記物，通過與細胞膜結(jié)合而能高效追蹤移植的細胞。將PKH26與肝細胞混合培養(yǎng)4 min后，肝細胞便很容易被染色標記，因此便于細胞追蹤。

4.2 高對比度納米顆粒標記移植細胞的磁共振成像技術(shù) MRI由于具有較高的軟組織對比和高度的解剖分辨率被廣泛用于日常的臨床實踐中?？梢酝ㄟ^造影劑觀察特定類型干細胞的富集或用超順磁性氧化鐵(SPIO)直接標記移植的細胞來觀察它們在損傷組織中的遷移。目前，通過對SPIO標記細胞的MRI成像技術(shù)可實現(xiàn)對活體非損傷性監(jiān)測移植細胞的遷移。隨著技術(shù)的進步，將SPIO與釓結(jié)合形成高對比度納米顆粒，可更加有效地觀察移植細胞在組織中的存活和增殖情況[29]。

5 肝干細胞移植的臨床應用

由于肝干細胞來源廣泛，免疫原性低和具有分化形成肝細胞的潛能，在醫(yī)學領域逐漸受到人們的關(guān)注，許多臨床試驗研究表明肝干細胞可以有效地治療慢性肝炎、肝硬化、肝癌和先天性肝臟疾病。將肝干細胞通過肝動脈移植到患有失代償性肝硬化病人體內(nèi)，6個月后可以明顯地觀察到MELD評分的降低(P<0.01)，多個診斷和生化參數(shù)得到改善。Jorns等[30]將肝細胞移植到2名肝切除后的克里格勒-納賈爾綜合征患者體內(nèi)，試驗發(fā)現(xiàn)患者血清膽紅素顯著減少，各項肝臟指標得到改善，表明肝細胞可以用于臨床治療肝損傷。Peng等[31]對158例乙型肝炎患者進行研究，53例治療組(接受自體BMSCs移植)與105例空白對照組相比，治療組在3～24周后ALB水平提高、3～36周觀察到MELD評分有效改善、在4～12周后TBIL(總膽紅素)和PT(凝血酶原時間)也明顯得到改善，此外，治療組患者發(fā)展為HCC的可能性僅約為對照組的1/5。通過靜脈、脾臟或肝動脈注射到患有慢性乙(丙)型肝炎和酒精性肝硬化病人體內(nèi)，一段時間后觀察發(fā)現(xiàn)Child-Pugh評分顯著改善，同時AST、ALT、TBIL、TGF-β1和ɑ-SMA降低[32]。

此外，將肝臟干細胞與工程學的原理和技術(shù)相結(jié)合的肝臟干細胞組織工程學是再生醫(yī)學中的另一個研究熱點。利用各種材料和方法使有限的肝臟干細胞在類似體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)的三維空間培養(yǎng)，從而再生出具有正常肝細胞代謝功能的肝臟組織，通過體內(nèi)植入對肝病患者達到治療的目的。

6 結(jié)語與展望

肝干細胞作為治療肝損傷的有效替代療法越來越受到人們的關(guān)注，但作為一種新興療法，還存在一些問題需要進一步闡明：(1)肝干細胞分化成肝樣細胞的分子機制；(2)肝干細胞的最佳移植路徑、移植數(shù)量、移植時間的選擇；(3)肝干細胞治療肝損傷時，如何預防其向腫瘤細胞的惡化。因此，還需要大規(guī)模的隨機和對照試驗，來檢測肝干細胞臨床應用的安全性。

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[收稿2016-01-06 修回2016-02-22]

(編輯 倪 鵬)

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.029

①本文為國家自然科學基金項目(No.U1404312)、河南省教育廳科學技術(shù)研究重點項目(No.13A180532)和河南師范大學博士啟動基金和青年骨干教師項目。

楊獻光(1980年-)，男，博士，副教授，碩士生導師，主要從事肝再生分子機理方面研究，E-mail：yangxg@htu.cn。

R657.3

A

1000-484X(2016)12-1854-05