劉婷婷 趙 雪 張子寧 傅雅靜 姜擁軍

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，衛(wèi)生部艾滋病免疫學(xué)重點(diǎn)實驗室，沈陽110000)

·臨床免疫學(xué)·

未治療HIV感染者NKT樣細(xì)胞活化、凋亡和增殖的相關(guān)研究①

劉婷婷 趙 雪 張子寧 傅雅靜 姜擁軍②

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，衛(wèi)生部艾滋病免疫學(xué)重點(diǎn)實驗室，沈陽110000)

目的：研究HIV感染后NKT樣細(xì)胞活化、凋亡和增殖的變化情況。方法：選取47名未治療的HIV感染者和31名健康對照者，提取外周血細(xì)胞，用熒光標(biāo)記抗體進(jìn)行染色，利用流式細(xì)胞儀檢測HIV感染者NKT樣細(xì)胞HLA-DR、Annexin-V、Ki-67等表面分子的表達(dá)。結(jié)果：未治療HIV感染者NKT樣細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為(3.03±1.61)%，正常人NKT樣細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為(8.30±7.42)%，HIV感染者NKT樣細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著低于健康對照組(P<0.05)；未治療HIV感染者HLA-DR表達(dá)為(5.40±4.10)%，健康對照組HLA-DR表達(dá)為(0.89±0.83)%，HIV感染者活化程度明顯高于健康對照組(P<0.001)，且活化程度與CD4+T細(xì)胞計數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.885 7，P<0.05)；未治療HIV感染者Annexin-V表達(dá)為(30.21±13.15)%，凋亡程度明顯高于健康對照組(5.40±8.05)%，(P<0.01)；未治療HIV感染者Ki-67的表達(dá)為(11.15±4.76)%，增殖能力明顯低于健康對照組(27.63±18.31)%，(P<0.05)。結(jié)論：HIV感染可明顯降低NKT樣細(xì)胞數(shù)量及增殖能力，而其活化及凋亡能力增加。

HIV；AIDS；NKT樣細(xì)胞

自然殺傷樣T細(xì)胞(Natural killer T like cells,NKT樣細(xì)胞)是一群同時具有NK細(xì)胞和T細(xì)胞免疫學(xué)特點(diǎn)的天然存在的細(xì)胞，可以介導(dǎo)固有免疫和適應(yīng)性免疫[1,2]。目前國內(nèi)外對NKT樣細(xì)胞的認(rèn)識仍不夠全面，根據(jù)CD3和CD56的表達(dá)情況可將NKT樣細(xì)胞定義為CD3+和CD56+，既表達(dá)TCR又表達(dá)NK細(xì)胞表面標(biāo)志物CD56。NKT樣細(xì)胞在抗腫瘤、抗感染、移植免疫以及自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要作用[3,4]。艾滋病，即獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired immune deficiency syndrome，AIDS)， 是由人類免疫缺陷病毒(HIV)引起的一種以CD4+T細(xì)胞減少，并伴隨反復(fù)機(jī)會性感染和惡性腫瘤的傳染病。目前有研究表明，NKT樣細(xì)胞在抗病毒感染中也可能發(fā)揮著重要作用[5-7]。NKT樣細(xì)胞活化后具有NK細(xì)胞樣細(xì)胞毒活性，可溶解NK細(xì)胞敏感的靶細(xì)胞，分泌大量IFN-γ[8,9]，導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡。國內(nèi)外關(guān)于NKT樣細(xì)胞的研究還不是很透徹和全面，尤其是在HIV免疫當(dāng)中NKT樣細(xì)胞所發(fā)揮的作用及其功能狀態(tài)。因此，本文主要對HIV感染后NKT樣細(xì)胞的變化進(jìn)行研究，并探索其在抗病毒感染中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本研究選取的未接受抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的HIV感染者，均來自中國醫(yī)科大學(xué)艾滋病研究所艾滋病確認(rèn)實驗室，經(jīng)WB(Western blot)試驗確認(rèn)為陽性的HIV/AIDS 患者。其中CD4+T細(xì)胞計數(shù)范圍在31～979 cell/μl，均值為462.5 cell/μl；病毒載量范圍在0～2 927 365 copies/ml，均值為132 813.7 copies/ml。正常對照(HIV-negative normal control，NC)，符合以下標(biāo)準(zhǔn)：HIV抗體陰性，血常規(guī)及肝腎功正常，乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰性，無免疫系統(tǒng)疾病，未暴露于HIV的正常人。

1.2 主要儀器和試劑 肝素抗凝負(fù)壓真空采血管、CD3-FITC/CD56-PEcy7/HLA-DR-PerCP/Ki-67-PE、Annexin-V、7AAD等購于BD公司，流式細(xì)胞儀為BD公司FACSCalibur。

1.3 流式細(xì)胞儀校準(zhǔn) 為保證實驗準(zhǔn)確性,用FACSComp CaliBRITE Beads、TruCOUNT Controls和Multi-Check Control 校準(zhǔn)流式細(xì)胞儀，合格后再進(jìn)行標(biāo)本測定。

1.4 NKT樣細(xì)胞活化、凋亡、增殖指標(biāo)檢測 200 μl肝素抗凝全血中加入4 ml溶血素，10 min后，離心，洗滌2次后加anti-CD3-FITC、anti-CD56-PEcy7熒光抗體進(jìn)行NKT樣細(xì)胞表面染色和HLA-DR-PerCP的活化染色；凋亡指標(biāo)檢測中，NK細(xì)胞表面染色20 min，洗滌后進(jìn)行Annexin-V-PE染色，15 min后加入200 μl凋亡洗液，直接在LSR上檢測，該試驗需在1 h內(nèi)完成檢測；NK細(xì)胞的增殖水平檢測是在標(biāo)記出NK細(xì)胞后，破膜20 min，用破膜洗液洗滌2次后進(jìn)行胞內(nèi)Ki-67-PE染色。見圖1。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間實驗指標(biāo)的比較采用Mann-WhitneyU檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIV感染后NKT樣細(xì)胞百分?jǐn)?shù)變化情況 對16例HIV感染者和11例健康對照者進(jìn)行CD3/CD56表面染色，檢測NKT樣細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示：未治療HIV感染組NKT樣細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為(3.03±1.61)%，健康對照組NKT樣細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為(8.30±7.42)%，HIV組明顯低于NC組(P<0.05)，見表1、圖2，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 HIV感染后NKT樣細(xì)胞活化情況 將14例HIV感染者和9例健康對照者的新鮮全血進(jìn)行NKT樣細(xì)胞表面染色(CD3/CD56)及活化標(biāo)志(HLA-DR)染色。結(jié)果顯示：未治療HIV感染組NKT樣細(xì)胞HLA-DR表達(dá)的百分?jǐn)?shù)為(5.40±4.10)%，健康對照組HLA-DR表達(dá)的百分?jǐn)?shù)為(0.89±0.83)%，因此NKT樣細(xì)胞在HIV感染者中，HLA-DR表達(dá)量明顯高于NC組(P<0.001)，見圖3、表2。NKT樣細(xì)胞活化程度與CD4+T細(xì)胞計數(shù)有負(fù)相關(guān)趨勢(P<0.05，r=-0.885 7)，見圖4。

GroupsnNKT(%)PUntreatedHIVgroup16303±161<005Normalcontrolgroup11830±742

圖1 畫門策略及代表流式圖Fig.1 Gate strategy and representative flow chart

2.3 HIV感染后NKT樣細(xì)胞凋亡情況 將16例HIV感染者和11例健康對照者的新鮮抗凝全血進(jìn)行NKT樣表面染色(CD3/CD56)及凋亡標(biāo)志(Annexin-V)染色。結(jié)果顯示：未治療HIV感染者

圖2 HIV感染及健康對照者NKT樣細(xì)胞百分?jǐn)?shù)Fig.2 Percentage of NKT like cell in HIV infected individuals and healthy controls

圖3 HIV感染及健康對照者NKT樣細(xì)胞HLA-DR表達(dá)Fig.3 HLA-DR expression of NKT like cell in HIV infected individuals and healthy controls

GroupsnNKT(%)PUntreatedHIVgroup14540±410<005Normalcontrolgroup9089±083

GroupsnNKT(%)PUntreatedHIVgroup16540±805<005Normalcontrolgroup113021±1315

Annexin-V表達(dá)的百分?jǐn)?shù)為(5.40±8.05)%，凋亡程度明顯高于健康對照組(30.21±13.15)%(P<0.01)，見圖5、表3。

2.4 HIV感染后NKT樣細(xì)胞增殖情況 將17例HIV感染者和11例健康對照者新鮮抗凝全血破膜后，進(jìn)行細(xì)胞核活躍指標(biāo)(Ki-67)染色。結(jié)果顯示：未治療HIV感染者Ki-67表達(dá)的百分?jǐn)?shù)為(11.15±4.76)%，健康對照組Ki-67表達(dá)的百分?jǐn)?shù)為(27.63±18.31)%，因此NKT樣細(xì)胞在HIV組中細(xì)胞核活躍程度Ki-67明顯低于NC組(P<0.05)，見圖6、表4。

圖4 HIV感染NKT樣細(xì)胞活化程度與CD4+T細(xì)胞計數(shù)的相關(guān)性Fig.4 Correlation between HLA-DR of NKT like cell and CD4+T cell count

圖5 HIV感染及健康對照者NKT樣細(xì)胞Annexin-V表達(dá)情況Fig.5 Annexin-V expression of NKT like cell in HIV infected individuals and healthy controls

圖6 HIV感染及健康對照者NKT樣細(xì)胞Ki-67表達(dá)情況Fig.6 Ki-67 expression of NKT like cell in HIV infected individuals and healthy controls

GroupsnNKT(%)PUntreatedHIVgroup171115±476<005Normalcontrolgroup112763±1831

3 討論

NKT樣細(xì)胞是具有T細(xì)胞與NK細(xì)胞兩方面性質(zhì)的一類特殊的淋巴細(xì)胞，其表面可以同時表達(dá)T 細(xì)胞受體(T-cell antigen receptors，TCR)和NK細(xì)胞受體(NK associated receptors，NKR)[10,11]。NKT樣淋巴細(xì)胞是天然免疫和固有免疫之間的橋梁，在抗感染免疫應(yīng)答、抗腫瘤免疫監(jiān)視和自身免疫性疾病中均起到重要的作用。

我們以中國HIV感染者為研究對象，通過檢測HIV感染后NKT樣細(xì)胞的數(shù)量變化，以及活化、凋亡和增殖狀態(tài)的改變，來進(jìn)一步分析HIV 感染后NKT樣細(xì)胞的功能狀況及其抗病毒作用。我們的結(jié)果顯示:HIV感染者NKT樣細(xì)胞百分?jǐn)?shù)低于正常對照組(P<0.05)。表明HIV 感染后NKT樣細(xì)胞數(shù)量減少[12,13]，提示NKT樣細(xì)胞在HIV疾病進(jìn)展過程中發(fā)揮的抑制HIV病毒復(fù)制和殺傷病毒感染細(xì)胞的作用減弱。我們發(fā)現(xiàn)HIV感染后，NKT樣細(xì)胞增殖能力降低(P<0.05)，表明HIV感染者的NKT樣細(xì)胞功能受到了損害[14]，而其增殖能力的降低也可能是其感染HIV后數(shù)量減少的原因之一。HIV感染后NKT樣細(xì)胞活化程度顯著增加(P<0.001)，提示盡管HIV感染后NKT樣細(xì)胞數(shù)量減少了，但其仍能夠發(fā)揮部分抗HIV感染作用，活化后分泌IFN-γ對抗病毒感染，且NKT樣細(xì)胞活化程度與CD4+T 細(xì)胞數(shù)量成反比(P<0.05，r=-0.885 7)(圖3)。

我們的研究還發(fā)現(xiàn)在HIV感染后NKT樣細(xì)胞凋亡增加，什么原因?qū)е缕涞蛲鲈黾幽壳叭圆磺宄?，可能是由于HIV感染后NKT樣細(xì)胞的凋亡易感性增加了。但NKT樣細(xì)胞在HIV感染后凋亡的增加也可能是其數(shù)量減少的原因之一。由此看來,HIV感染無論是對NKT樣細(xì)胞數(shù)量還是對活化程度、增殖以及凋亡都有一定的影響，對HIV感染后NKT樣細(xì)胞的變化進(jìn)行不斷深入的研究，利用NKT樣細(xì)胞的獨(dú)特性為HIV感染后的免疫重建及抗HIV治療提供相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。

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[收稿2016-04-05 修回2016-04-27]

(編輯 倪 鵬)

Studies on activation,apoptosis and proliferation of NKT like cells in untreated HIV infected patients

LIU Ting-Ting，ZHAO Xue，ZHANG Zi-Ning，F(xiàn)U Ya-Jing，JIANG Yong-Jun.

Clinical Laboratory，the First Affiliated Hospital,China Medical University，Key Laboratory of AIDS Immunology of Ministry of Health,Shenyang 110000,China

Objective:To study the changes of the NKT like cells after HIV infected.Methods: We collected peripheral blood from 47 untreated HIV infected individuals and 31 healthy controls,and analyzed the expression of Annexin-V,Ki-67,HLA-DR and other surface molecules in NKT like cells by flow cytometry.Results: The NKT like cell percentage of untreated HIV infected group was (3.03±1.61)%,the NKT like cell percentage of normal control group was (8.30±7.42)%,the percentage of NKT like cells in HIV infected individuals was significantly lower than the healthy controls (P<0.05)；the NKT like cell HLA-DR expression of untreated HIV infected group and normal control group were (5.40±4.10)% and (0.89±0.83)%,the NKT like cell Annexin-V expression of untreated HIV infected group and normal control group were (30.21±13.15)% and (5.40±8.05)% ,and the activation and apoptosis of NKT like cells was significantly higher after HIV infection compared with health individuals (P<0.001，P<0.01)，the degree of activation was negatively correlated with CD4 count (r=-0.885 7，P<0.05)；and the NKT like cell Ki-67 expression of untreated HIV infected group and normal control group were (11.15±4.76)% and (27.63±18.31)%，the proliferation ability was significantly lower after HIV infection compared with healthy controls(P<0.05).Conclusion: HIV infection can significantly reduce the number of NKT like cells and its ability to proliferate,and increase its ability to activation and apoptosis.

Human immunodeficiency virus；Acquired immune deficiency syndrome;NKT like cells

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.016

①本文為國家科技重大專項課題資助項目(2014ZX1000100 2001004)和基礎(chǔ)臨床緊密結(jié)合平臺項目(醫(yī)大發(fā)字[2013]5號)。

劉婷婷(1990年-)，女，碩士，初級檢驗技師，主要從事艾滋病相關(guān)方面的研究。

R512.91

A

1000-484X(2016)12-1797-04

②通訊作者，E-mail：jiangjun55555@163.com。