劉 陽 劉 念 劉 文

(江漢大學附屬醫(yī)院普外科，武漢430015)

氧化苦參堿聯(lián)合5-FU對人胃癌SGC-7901細胞生長的協(xié)同抑制作用及其機制研究

劉 陽 劉 念 劉 文

(江漢大學附屬醫(yī)院普外科，武漢430015)

目的：氧化苦參堿聯(lián)合5-FU對人胃癌SGC-7901細胞生長的協(xié)同抑制作用及相關機制研究。方法：通過不同濃度的氧化苦參堿單獨及聯(lián)合應用5-FU作用于SGC-7901細胞24、48、72 h，采用MTT法檢測細胞活力，HOECHST染色法檢測細胞凋亡，免疫細胞法檢測胃癌 SGC-7901細胞內血管內皮生長因子(VEGF)蛋白的表達，以逆轉錄聚合酶鏈式反應RT-PCR法觀察SGC-7901細胞VEGF mRNA的轉錄情況。結果：與空白組比，氧化苦參堿中劑量、高劑量組及其聯(lián)合5-FU組均能顯著抑制人胃癌SGC-7901細胞生長，并誘導其凋亡(P<0.01)；與單獨使用5-FU組相比，聯(lián)合用藥組細胞增殖抑制率和凋亡率均顯著增高(P<0.05)；氧化苦參堿及聯(lián)合5-FU組中人胃癌SGC-7901細胞的VEGF mRNA轉錄及其蛋白表達顯著降低(P<0.01)。結論：氧化苦參堿對5-FU的胃癌SGC-7901細胞的增殖抑制和誘導凋亡具有協(xié)同作用；促進氧化苦參堿對VEGF的基因和蛋白表達抑制作用可能是其機制之一。

氧化苦參堿；5-氟尿嘧啶；胃癌；細胞增殖；細胞凋亡；血管內皮生長因子

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率也逐漸增加，嚴重威脅著人們的健康，目前對其治療方式有：手術、化療、放療或多種方法綜合治療，晚期胃癌患者較為常見，而鑒于其起病隱匿、無明顯癥狀等發(fā)病特點，其治療多以化療為主。在臨床上對胃癌化療的首選藥為5-氟尿嘧啶(5-FU)[1，2]，是抑制腫瘤細胞增殖和誘導凋亡抗腫瘤藥的重要機制之一。在大部分抗腫瘤藥物中，中藥因其高效低毒的特性，逐漸得到人們的重視，尤其是對抗腫瘤中藥中有效成分的研究?？鄥⒆鳛閭鹘y(tǒng)中藥，在臨床上廣泛應用，具有抗病毒、抗過敏、平喘等功效。其主要有效成分氧化苦參堿已成為肝炎的臨床治療藥物，其不良反應小，且有升高白細胞和提升免疫力的功效，而對機體正常細胞影響較小。研究表明氧化苦參堿對腫瘤細胞具有一定的殺傷和抑制其侵襲的作用[3-5]，在臨床上正得到較為廣泛應用。目前中藥及其中藥成分聯(lián)合運用治療胃癌有一定報道，如馮玉光等[6]人研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可顯著增強5-FU對SGC7901細胞的增殖抑制和誘導凋亡作用，該效應可能與其抑制突變型p53蛋白的表達有關。而雖對氧化苦參堿治療胃癌有一定報道，但對氧化苦參堿聯(lián)合5-FU的抗腫瘤作用卻未見相關報道，本文研究研究了不同濃度氧化苦參堿單用和聯(lián)合5-FU作用胃癌細胞，以觀察二者是否具有協(xié)同作用。同時研究表明血管生成促進因子主要包括血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板源性生長因子(Platelet derived growth factor,PDGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等，其中VEGF是主要的促血管生成因子，在胃癌的侵襲和轉移中起重要作用；中藥可通過對VEGF的表達及活性的調控影響腫瘤的血管生成，進而抑制腫瘤的生長和轉移[7-11]，因此本研究檢測氧化苦參堿單用和聯(lián)合5-FU對VEGF基因和蛋白表達的影響，以研究其相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 小牛血清(杭州四季青)；氧化苦參堿(中國藥品生物制品檢定所的標準品)；氟尿嘧啶(上海旭東海普藥業(yè)有限公司)；HOECHST32258 熒光染色試劑盒(美國Sigma 公司)；兔抗人VEGF多克隆抗體、SP-9000免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒(北京中杉公司)；RNA提取試劑TRIZOL和2×Taq PCR Master Mix(北京天根生化公司)。

1.1.2 細胞培養(yǎng) 將SGC7901 細胞接種于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液中，在5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中進行傳代培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定細胞增殖抑制率 以3×107L-1的密度將處于對數(shù)生長期的細胞接種于96孔的培養(yǎng)板中，每空200 μl。當細胞貼壁后，加入氧化苦參堿(終濃度為0、1、2、4 mg/L)及氧化苦參堿(終濃度為0、1、2、4 mg/L)聯(lián)合5-FU(終濃度10.0 mg/L)，每組設5個復孔。分別連續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后，每空加20 μl的MTT溶液(50 mg/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸盡上清液，每孔加150 μl的二甲基亞砜，震蕩5 min，用酶標儀在570 nm下，檢測其OD值。細胞生長抑制率(%)= (對照孔OD值-實驗孔OD值)/對照孔OD值×100%。

1.2.2 HOECHST染色法檢測細胞凋亡率 將SGC7901細胞制成細胞懸液(2×108L-1)，加入帶有蓋玻片的24孔板內，每孔加0.5 ml。當細胞貼壁后，加入氧化苦參堿(終濃度為0、1、2、4 mg/L)及氧化苦參堿(終濃度為0、1、2、4 mg/L)聯(lián)合5-FU(終濃度10.0 mg/L)，每組設5個復孔。分別連續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h后，取出各組細胞爬片，用甲醇/冰醋酸固定液固定，5 min后，加入HOECHST33258熒光染液，避光1 h后，再用PBS沖洗后用抗熒光液對其進行封片。判斷其存活或凋亡標準：藍色為存活，白色為凋亡。凋亡率(%)= 凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.2.3 免疫細胞化學法觀察胃癌細胞VEGF蛋白表達 以1×105L-1的密度將處于對數(shù)生長期的細胞接種于24孔的培養(yǎng)板中，每空200 μl。當細胞貼壁后，加入氧化苦參堿(終濃度為0、4 mg/L)及氧化苦參堿(終濃度為4 mg/L)聯(lián)合5-FU(終濃度10.0 mg/L)。連續(xù)培養(yǎng)48 h后，PBS洗滌3次，干燥后，加入0.3%H2O2，孵育15 min，PBS洗滌，加山羊血清，孵育15 min，照試劑盒操作步驟說明滴加一抗、二抗，結果用Image Pro Plus軟件進行分析。

1.2.4 RT-PCR法檢測氧化苦參堿單用及聯(lián)合5-FU對細胞VEGF mRNA表達的影響 ①總RNA的提取及逆轉錄：將藥物作用48 h后的細胞按Trizol試劑盒(TIANGEN)說明書提取總RNA，按照逆轉錄試驗盒(TIANGEN)說明逆轉錄成cDNA。②基因擴增：取得的cDNA行25 ml PCR反應。以β-肌動蛋白(β-actin)為內參，其基因擴增物為252 bp；VEGF 產物為417 bp。③擴增產物應用凝膠電泳檢測，在紫外燈下觀察，并對條帶進行光密度掃描分析。各組mRNA的相對表達量等于其目的基因VEGF條帶積分光密度值與其內參照β-actin的條帶積分光密度值的比值。

2 結果

2.1 不同濃度氧化苦參堿單獨及聯(lián)合應用5-FU對SGC7901細胞增殖的抑制作用 由表1可知，中劑量和高劑量氧化苦參堿組對SGC7901細胞增殖的具有顯著的抑制作用(P<0.01)，且隨濃度和時間的增加抑制作用增強；與單獨氧化苦參堿用組相比，對應的聯(lián)合用藥組對SGC7901細胞增殖的抑制作用顯著增高(P<0.05)。

2.2 不同濃度氧化苦參堿單獨及聯(lián)合5-FU對SGC7901細胞凋亡的影響 由表2知，中劑量和高劑量的氧化苦參堿對SGC7901細胞凋亡具有顯著促進作用(P<0.01)，而低劑量作用不顯著(P>0.05)；且隨濃度和時間的增加促進作用增強，高劑量組細胞72 h凋亡率高達46.89%；與單獨氧化苦參堿組相比，對應的聯(lián)合用藥組促進凋亡作用顯著增高(P<0.05)，4 mg/L氧化苦參堿+5-FU組高達50.89%。

2.3 氧化苦參堿單獨及聯(lián)合應用5-FU對SGC7901細胞VEGF蛋白表達影響 由圖1及表3知，與對照組相比，4 mg/L氧化苦參堿組和4 mg/L氧化苦參堿+10 mg/L的5-FU組SGC7901細胞VEGF蛋白表達顯著下降(P<0.01)，而5-FU組下降不明顯(P>0.05)。

表1 不同濃度氧化苦參堿單獨及聯(lián)合應用5-FU對SGC7901細胞增殖的抑制作用

Tab.1 Inhibition effects of different concentrations Oxym-atrine and it combined with 5-FU proliferation of SGC7901 human gastric cancer cells

Group24h(%)48h(%)72h(%)K000A1644±2442435±3352659±359B3238±3381)3833±4331)4389±3891)C4989±2891)5613±1131)6034±4341)5?FU1934±2342435±2352659±459A+5?FU2055±1551)2)2831±3311)2)3022±2221)2)B+5FU3718±2181)2)4073±3731)2)4829±4291)2)C+5FU5639±1391)2)3)6416±2161)2)3)6988±3881)2)3)

Note：K.Control group;A.1 mg/L Oxymatrine group;B.2 mg/L Oxymatrine group;C.4 mg/L Oxymatrine group;5-FU.10 mg/L Oxymatrine group;A+5-FU.1 mg/L Oxymatrine +10 mg/L;5-FU group;B+5FU.2 mg/L Oxymatrine +10 mg/L 5-FU group;C+5FU.4 mg/L Oxymatrine+10 mg/L 5-FU group.1)P<0.05,compared to controls;2)P<0.05.compared to single drug (Oxymatrine) group;3)P<0.05.compared to single drug (5-FU) group.

表2 不同濃度氧化苦參堿單獨及聯(lián)合5-FU對SGC7901細胞凋亡的影響結果

Tab.2 Inhibition effects of different concentrations Oxym-atrine and it combined with 5-FU apoptosis of SGC7901 human gastric cancer cells

Group24h(%)48h(%)72h(%)K471±144511±135642±159A624±244822±335922±359B2022±3381)2411±4331)2712±3891)C4022±2891)4422±1134689±4341)5?FU1523±2341)1722±2351)2022±4591)A+5?FU1625±1551)2)1822±3311)2)2422±2221)2)B+5FU2522±2181)2)2611±3731)2912±4291)C+5FU4322±1391)2)3)4622±2161)2)3)5089±3881)2)3)

Note：K.Control group;A.1 mg/L Oxymatrine group;B.2 mg/L Oxymatrine group;C.4 mg/L Oxymatrine group;5-FU.10 mg/L Oxymatrine group;A+5-FU.1 mg/L Oxymatrine +10 mg/L 5-FU group;B+5FU.2 mg/L Oxymatrine +10 mg/L 5-FU group;C+5FU.4 mg/L Oxymatrine +10 mg/L 5-FU group.1)P<0.05,compared to controls;2)P<0.05.compared to single drug (Oxymatrine) group；3)P<0.05 compared to single drug (5-FU) group.

2.4 RT-PCR檢測細胞內VEGF mRNA的表達結果 由圖2和表4可知，與對照組相比，4 mg/L氧化苦參堿組和4 mg/L氧化苦參堿+10 mg/L的5-FU組SGC7901細胞VEGF基因表達顯著下降(P<0.01)，而5-FU組下降不明顯(P>0.05)。

圖1 免疫組化法檢測氧化苦參堿單獨及聯(lián)合應用5-FU處理組細胞內VEGF蛋白表達(DAB×400)Fig.1 Immunohistochemical staining for VEGF in Oxy-matrine and it combine with 5-FU (DAB×400)

表3 氧化苦參堿單獨及聯(lián)合應用5-FU對VEGF蛋白表達影響

Tab.3 Immunohistochemical staining for VEGF in Oxy-matrine and it combine with 5-FU

Note：1)P<0.05，compared to controls；2)P<0.05，compared to 10 mg/L 5-FU group；3)P<0.05，compared to 4 mg/L Oxymatrine group.

表4 氧化苦參堿單獨及聯(lián)合應用5-FU對SGC-7901細胞VEGF mRNA轉錄的影響

Tab.4 Impacts of Oxymatrine and it combine with 5-FU to transcription of VEGF mRNA in SGC-7901 cells

GroupsVEGFControlgroup0812±002610mg/L5?FUgroup0752±00874mg/LOxymatrinegroup0522±00391)4mg/LOxymatrine+10mg/L5?FUgroup0459±00681)2)3)

Note：1)P<0.05，compared to controls；2)P<0.05，compared to 10 mg/L 5-FU group；3)P<0.05，compared to 4 mg/L Oxymatrine group.

圖2 半定量RT-PCR檢測細胞內VEGF mRNA的表達Fig.2 Expression of VEGF mRNA was detected by semi-quantitative RT-PCRNote:M.Marker PRI 2000;A.10 mg/L 5-FU;B.4 mg/L Oxymatrine;C.4 mg/L Oxymatrine +10 mg/L 5-FU ;D.Control.

3 討論

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率也逐漸增加，嚴重威脅著人們的健康，目前其治療方式有：手術、化療、放療或多種方法綜合治療，而鑒于其起病隱匿、無明顯癥狀等發(fā)病特點，其治療多以化療為主。目前多研究胃癌的轉移機制，以探索治療的新靶點[12-14]?？鄥槎箍苹睂僦参?，主要分布于河北北部、河南西部及山東等地[15]，主要成分以生物堿類為代表如苦參堿、氧化苦參堿、懷果堿等等。苦參具有清熱解毒、燥濕利尿、祛風殺蟲等作用，現(xiàn)對苦參及其生物堿的抗腫瘤作用有較多報道[3-5]。雖對氧化苦參堿治療胃癌有一定報道，但對氧化苦參堿聯(lián)合5-FU的抗腫瘤作用卻未見相關報道，本文研究研究了不同濃度氧化苦參堿單用和聯(lián)合5-FU作用胃癌細胞，以觀察二者是否具有協(xié)同作用，同時檢測VEGF基因和蛋白表達，研究其相關機制。本文研究結果表明中劑量和高劑量的氧化苦參堿對人胃癌SGC-7901細胞增殖具有顯著抑制作用和誘導其凋亡作用，且在劑量上，高劑量作用大于中劑量；在時間上，72 h作用大于48 h，48 h大于24 h，而低劑量氧化苦參堿的抑制作用不明顯，該結果提示氧化苦參堿對胃癌細胞增殖具有顯著抑制作用，該作用呈劑量和時間依賴性。同時，研究了氧化苦參堿與5-FU聯(lián)合用藥對人胃癌SGC-7901細胞增殖具有顯著抑制作用和誘導其凋亡作用，結果表明，聯(lián)合用作用顯著強于單獨用藥，提示氧化苦參堿與5-FU在抑制胃癌SGC-7901細胞增殖和誘導其凋亡上具有一定的協(xié)同作用。

通過抑制血管生成治療腫瘤早有研究報道，且具有較多優(yōu)點如廣譜性、不易產生耐藥性等等[7,16-18]。同時研究表明血管內皮生長因子(VEGF)是血管生成的主要促進因子，其在胃癌的侵襲和轉移中具有重要作用[15]。因此，進一步檢測了氧化苦參堿及其聯(lián)合5-FU用藥對SGC-7901細胞VEGF基因和蛋白表達的影響，以對相關機制進行研究，結果發(fā)現(xiàn)氧化苦參堿和氧化苦參堿聯(lián)合5-FU用藥組能顯著抑制SGC-7901細胞VEGF基因和蛋白表達，而單獨用5-FU組作用不顯著，提示抑制SGC-7901細胞VEGF基因和蛋白表達可能是氧化苦參堿聯(lián)合5-Fu對人胃癌SGC-7901細胞生長的協(xié)同抑制作用機制之一。

綜上，氧化苦參堿對胃癌細胞增殖具有顯著抑制作用，該作用呈劑量和時間依賴性；氧化苦參堿與5-FU在抑制胃癌SGC-7901細胞增殖和誘導其凋亡上具有一定的協(xié)同作用，其協(xié)同作用的相關機制可能是5-FU促進、增加了氧化苦參堿的抑制SGC-7901細胞VEGF基因和蛋白表達作用，從而抑制胃癌細胞增殖和誘導凋亡。本研究為以后采用單獨用藥及聯(lián)合用藥治療胃癌提供了理論依據(jù)，具有一定的參考價值。

[1] Yoshida K,Yamaguchi K,Osada S,etal.Challenge for a better combination with basic evidence [J].Int J Clin Oncol,2008,13(3):212-219.

[2] 李衛(wèi)泊,宋偉慶,張玉印,等.5-氟尿嘧啶術前化療對胃癌細胞凋亡和增殖的影響[J] .中華腫瘤防治雜志,2006,13(14):1077-1079.

[3] Liu J，Manheimer E，Tsutani K,etal.Medicinal herbs for hepatitis C virus infection:a Cochrane hepatobiliary systematic review of randomized trials [J].Am J Gastroenterol,2003,98(3):538-544.

[4] 夏寶妹,周懷君,胡婭莉,等.氧化苦參堿對子宮內膜癌細胞中血管內皮生長因子表達的抑制作用及其機制[J].中華婦產科雜志,2009,44(5):388-390.

[5] 李 敏,錢曉萍,劉寶瑞.奧沙利鉑聯(lián)合復方苦參注射液抗血管生成作用的實驗研究[J].中國癌癥雜志,2008,18(3):167-171.

[6] 馮玉光，刑國輝，宗緒山，等.丹參酮ⅡA聯(lián)合5-FU對人胃癌SGC7901細胞增殖和凋亡與突變型p53蛋白表達的研究[J].中華腫瘤防治雜志，2010，17(11)：831-834.

[7] Ding S,Lin S,Dong X,etal.Potential prognostic value of circulating levels of vascular endothelial growth factor-A in patients with gastric cancer [J].In Vivo,2005,19(4):793-795.

[8] 閔存云,劉和強,李慶明.健脾導滯中藥對胃癌細胞VEGF及其受體表達的作用[J].中華實用中西醫(yī)雜志,2005,18(9):1351-1353.

[9] 徐 莉,丁志山,魏穎慧,等.參麥注射液對胃癌中bFGF、PCNA基因表達的影響[J].中成藥,2006,28(4):530-532.

[10] 曹文濤,廖愛軍,曾 斌,等.藜蘆醇對胃癌SGC-7901細胞VEGF表達的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2006,6(10):52-54.

[11] 王國平,尹成進,歐陽曙明,等.雷公藤內酯醇對人胃癌細胞SGC 7901增殖及表達血管內皮生長因子的影響[J].實用醫(yī)學雜志,2008,24(1):17-19.

[12] Neufeld G,Cohen T,Gengrinovitch S,etal.Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors[J].FASEB J,1999,13(1):9-22.

[13] Ferrara N,Gerber HP,Le Couter J.The biology of VEGF and its receptors[J].Nat Med,2003,9(6):669-676.

[14] Hotz HG,Hines OJ,Masood R,etal.VEGF antisanse therapy inhibits tumor growth and improves survival in experimental pancreatic cancer[J].Surgery,2005,137(2):192-199.

[15] 付起鳳，曹 琦，呂邵娃，等.正交法優(yōu)化苦參中苦參生物堿的超聲提取工藝[J].中醫(yī)藥信息，2015，32(1)：11-13.

[16] Folkman J.What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent? [J].Nat Cancer Inst，1990,82(1):4-6.

[17] Grothey A,Ellis LM.Targeting angiogenesis driven by gascular endothelial growth factors using antibody-based therapies [J].Cancer J,2008,14(3):170-177.

[18] Ferrara N.VEGF as a therapeutic target in cancer [J].Oncology,2005,69(suppl3):11-16.

[收稿2016-03-25 修回2016-05-05]

(編輯 許四平)

Effect of combination Oxymatrine with 5-FU inhibited proliferation in SGC-7901 human gastric cancer cells and its mechanism

LIU Yang,LIU Nian,LIU Wen.

General Surgery,Affiliated Hospital of Jianghan University,Wuhan 430015，China

Objective:To study the synergy inhibition effects of Oxymatrine combine with 5-FU on proliferation and apoptosis of SGC7901 human gastric cancer cells and its mechanism.Methods:SGC7901 cells were treated by different concentrations of Oxymatrine with or without 10.0 mg/L 5-FU for 24,48 and 72 h.The cells proliferative vitality was detected by MTT assay,and the apoptosis of SGC7901 cells was detected by HOECHST stain.Immunohistochemistry was applied to examine the protein expression of VEGF.The transcriptions of VEGF mRNA were distinguished by RT-PCR technique.Results:Compared with control group,middle dose and high dose concentration of Oxymatrine groups,and groups of its combined with 5-FU can inhibit the proliferation and induced the apoptosis of SGC7901 cancer cells.Compared with 5-FU group,the inhibition rate and apoptosis rate were significantly increased in groups of Oxymatrine combined with 5-FU.The mRNA and protein expression of VEGF were significantly decreased in groups of Oxymatrine and it combined with 5-FU.Conclusion:Synergy inhibition effects of Oxymatrine combine with 5-FU on proliferation and apoptosis of SGC7901 human gastric cancer cells were found,which may be related to strengthen the effects of Oxymatrine of inhibiting angiogenesis relate with down-regulating the expression of VEGF.

Oxymatrine;5-FU;Gastric cancer;Proliferation;Apoptosis;VEGF

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.012

劉 陽(1978年-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事胃腸道腫瘤方面的研究，E-mail：liuyang887811@163.com。

R392.5

A

1000-484X(2016)12-1781-05