李朝旭 張浚哲 王勝濤 王銳英 唐際存

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨二科，桂林541004)

·中醫(yī)中藥與免疫·

雷公藤紅素經過TRAIL途徑增強γδ T細胞對骨肉瘤細胞株HOS的殺傷作用①

李朝旭 張浚哲 王勝濤 王銳英 唐際存②

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨二科，桂林541004)

目的：探討雷公藤紅素經過TRAIL途徑增強γδ T細胞對骨肉瘤細胞株HOS的殺傷作用。方法：Western blot檢測骨肉瘤細胞株HOS死亡受體(DR)的表達。使用唑來膦酸(ZOL)聯合IL-2體外擴增人γδ T細胞，LDH法檢測γδ T細胞對HOS細胞株的殺傷活性。結果：雷公藤紅素可促進骨肉瘤細胞株HOS死亡受體DR4和DR5的表達(P<0.05)。健康人來源的γδ T細胞具有殺傷HOS細胞株的能力(P<0.05)，經過雷公藤紅素(1 μmol/L) 24 h預處理HOS細胞株，γδ T細胞殺傷HOS細胞株的能力增強(P<0.05)，TRAIL中和抗體可阻斷雷公藤紅素增強γδ T細胞殺傷HOS細胞株的能力(P<0.01)。結論：雷公藤紅素經過TRAIL途徑增強γδ T細胞對骨肉瘤細胞株HOS的殺傷作用。

骨肉瘤；γδ T細胞；免疫治療；雷公藤紅素

我們前期研究顯示，γδ T細胞在體內外對骨肉瘤(Osteosarcoma,OS)有一定的殺傷作用[1]。然而，腫瘤微環(huán)境中大量免疫抑制因素的存在，導致免疫效應細胞難以識別腫瘤細胞，影響了γδ T細胞免疫治療的效果，限制了γδ T細胞的進一步臨床應用。

通過藥物上調腫瘤細胞表面表達的為免疫細胞所識別的特異性高親和力受體，達到免疫細胞特異性殺傷腫瘤細胞的效果，是提高γδ T細胞免疫治療效果的可靠途徑[2]。因此，尋找不同的聯合方案成為提高γδ T細胞免疫治療OS亟需解決的問題[3]。本研究旨在觀察雷公藤紅素對γδ T細胞殺傷人OS細胞系HOS的影響及機制，為OS患者的γδ T細胞免疫治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 Daudi和人OS細胞系HOS購自中國科學院上海細胞所。唑來膦酸(Zoledronate,ZOL)、雷公藤紅素為瑞士諾華制藥公司產品，人重組白介素2(recombinant interleukin 2，rIL-2)、 MTT和DMSO購自上海普欣生物有限公司,CD3、TCR-γδ、死亡受體(Death receptors,DR)4、DR5和抗腫瘤壞死因子相關誘導凋亡配體(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)抗體購自美國eBioscience公司，淋巴細胞分離液購自加拿大Cedarlane公司，CytoTox96?非放射性細胞毒性試劑盒購自Promega公司，胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640干粉均購自Gibco公司，CytomicsTMFC500型流式細胞儀為美國Beckman-Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤細胞培養(yǎng) Daudi細胞培養(yǎng)于RPMI-1640完全培養(yǎng)基，HOS細胞培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基。

1.2.2 Western blot法檢測蛋白表達 用RIPA裂解液裂解雷公藤紅素處理前后HOS細胞，提取總蛋白質，用BCA法測定蛋白質濃度，等量蛋白質采用120 g/L SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進行分離，然后轉PVDF膜上，室溫下搖動封閉2 h后，總蛋白加入鼠抗人DR4、DR5抗體4℃過夜，室溫下洗膜后加入辣根過氧化物酶(HRP) 耦聯羊抗鼠二抗，ECL顯影，以β-actin條帶作為內對照。

1.2.3 γδ T細胞制備 本研究獲得桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會批準并經健康志愿者同意。γδ T細胞制備具體步驟見我們以前研究[4]。取健康人外周靜脈血5 ml,1∶1稀釋后,用淋巴細胞分離液獲取外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),RPMI1640完全培養(yǎng)基調整細胞密度為(1～2)×106ml,在24孔培養(yǎng)板(1 ml/孔)中培養(yǎng),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱;培養(yǎng)第1天新鮮培養(yǎng)液含ZOL 1 μmol/L和人rIL-2 400 U/ml;以后，每3 d更換一半新鮮培養(yǎng)液，內含人rIL-2 400 U/ml，共培養(yǎng)2周后收獲γδ T細胞，分別加入抗人TCR-γδ-PE抗體和抗人CD3-FITC抗體， 避光4℃孵育30 min；流式細胞儀檢測γδ T細胞的純度。

1.2.4 T細胞細胞毒性試驗及阻斷試驗 以HOS為靶細胞,分別設置效靶細胞比為1.5∶1、3∶1、6∶1和12∶1,根據CytoTox96?非放射性細胞毒性試劑盒的操作說明檢測體外擴增2周的γδ T細胞細胞毒性，具體步驟見我們以前研究[5]。阻斷實驗，γδ T細胞在含抗TRAIL抗體(10 μg/ml)的新鮮培養(yǎng)液孵育半小時，PBS洗滌2次后,按6∶1的比例，與HOS細胞混合。根據以下公式計算:γδ T細胞殺傷率=(A實驗組-A效應細胞對照組-A靶細胞對照組)/( A靶細胞最大釋放量組-A靶細胞對照組)×100%[6]。

1.2.5 MTT法測定細胞相對活力 γδ T細胞分別以每孔1×104個細胞接種于96孔板內，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。加入終濃度分別為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00和16.00 μmol/L的雷公藤紅素，每個濃度梯度設5個復孔同時設空白和未干預對照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。酶標儀檢測490 nm波長處各孔吸光度值(A值)，計算細胞相對活力：γδ T細胞細胞相對活力=A藥物/A對照×100%。重復3次。

2 結果

2.1 雷公藤紅素促進HOS細胞DR4和DR5的表達 如圖1所示， DR4和DR5在HOS細胞不表達或表達較弱。經不同濃度雷公藤紅素預處理HOS 24 h后，HOS細胞DR4和DR5表達明顯提高(P<0.05)，尤其是DR5的提高呈劑量依賴性。

2.2 γδ T細胞對HOS細胞具有殺傷作用 4例健康人志愿者參與本研究,健康人PBMCs來源的γδ T細胞體外擴增結果見我們前期研究[6，7]。如圖2所示，在效靶細胞比為1.5∶1、3∶1、6∶1和12∶1，γδ T細胞對HOS的殺傷率分別為(3.2±1.3)%、(12.0±2.1)%、(16.7±1.9)%和(19.5±2.0)%。

2.3 雷公藤紅素增強γδ T細胞對HOS細胞殺傷作用 HOS在含1 μmol/L的雷公藤紅素的完全培養(yǎng)基孵育24 h，觀察雷公藤紅素對γδ T細胞殺傷HOS細胞的影響。結果如圖2所示，在效靶細胞比為1.5∶1、3∶1、6∶1和12∶1，γδ T細胞對雷公藤紅素預處理的HOS細胞的殺傷率達到(8.0±2.1)%、(17.3±2.4)%、(24.7±1.5)%和(36.3±1.4)%，雷公藤紅素可增強γδ T細胞對HOS細胞殺傷作用(P<0.05)。

圖1 雷公藤紅素對HOS細胞DR4 and DR5表達的影響Fig.1 Impact of celastrol on DR4 and DR5 expression in OS cell line HOS

圖2 雷公藤紅素增強γδ T細胞對HOS細胞殺傷作用Fig.2 Celastrol sensitizes OS cells HOS to γδ T cell-mediated cytotoxicityNote:*.P<0.05 vs untreated group.

圖3 TRAIL中和抗體阻斷γδ T細胞對骨肉瘤細胞的殺傷作用Fig.3 Effect of a neutralizing TRAIL antibody on cytotoxic lysis of OS cells by γδ T cells

圖4 雷公藤紅素對γδ T細胞增殖及殺傷活性的影響Fig.4 Impact of celastrol on proliferation and cytotoxic activity of γδ T cells

2.4 雷公藤紅素增強γδ T細胞對HOS細胞殺傷作用通過TRAIL途徑 為了觀察雷公藤紅素增強γδ T細胞對HOS細胞殺傷作用的途徑，我們使用TRAIL中和抗體，阻斷γδ T細胞經過TRAIL途徑對骨肉瘤細胞的殺傷。結果如圖3所示，在效靶細胞比為6∶1時，γδ T細胞對未處理的HOS細胞及雷公藤紅素預處理的HOS細胞的殺傷分別達到(16.7±1.9)%和(24.7±1.5)%；使用TRAIL中和抗體預先作用γδ T細胞30 min后，對未處理的HOS細胞及雷公藤紅素預處理的HOS細胞的殺傷分別達到(10.7±1.0)% 和(9.7±1.0)%，兩者無統計學差異(P>0.05)。

2.5 小劑量雷公藤紅素對γδ T細胞活力及殺傷活性無影響 結果如圖4A所示， 當雷公藤紅素的濃度達到4 μmol/L時，γδ T細胞活力仍然達到(86 ± 2.3)%，提示小劑量雷公藤紅素對γδ T細胞活性影響不大。為觀察雷公藤紅素對γδ T細胞殺傷活性的影響，我們選擇對γδ T細胞殺傷敏感的Daudi細胞作為靶細胞，γδ T細胞在含或不含1 μmol/L的雷公藤紅素的完全培養(yǎng)基孵育24 h后，觀察雷公藤紅素對γδ T細胞殺傷Daudi細胞的影響，結果顯示雷公藤紅素對γδ T細胞殺傷活性無明顯影響(P<0.05，圖4B)。

3 討論

目前已知TRAIL途徑是導致腫瘤細胞凋亡的主要機制之一[8],亦是γδ T細胞識別殺傷腫瘤細胞的重要途徑之一[9]。TRAIL屬腫瘤壞死因子超家族成員，表達于活化的T細胞,與DR4/DR5結合可選擇性誘導腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞沒有影響[10]。體外實驗表明表達DR的OS細胞對TRAIL誘導的caspase-8介導的凋亡高度敏感，并且體內研究發(fā)現TRAIL可阻止肺部淋巴結播散和提高OS動物模型生存率[11]。因此，上調OS細胞表面死亡受體DR4/DR5的表達，可能促進γδ T細胞免疫治療OS。

雷公藤紅素是雷公藤單體之一，屬三萜類色素，分子式為C29H38O4，分子量為450。除了具有抗氧化、抗風濕、抗老年癡呆癥等功效，近年來國內外研究發(fā)現雷公藤紅素也具有廣泛的抗癌活性。尤其重要的是，雷公藤紅素可通過上調腫瘤細胞表面死亡受體DR4和DR5，進而增強通過TRAIL途徑誘導腫瘤細胞的凋亡[12]，提示雷公藤紅素可能致敏免疫細胞對靶細胞的殺傷作用[13]。但是，雷公藤紅素能否上調OS細胞表面死亡受體DR4和DR5并被γδ T細胞識別，目前尚未見文獻報道。本研究經不同濃度雷公藤紅素預處理OS細胞系HOS 24 h后，HOS細胞DR4和DR5表達明顯提高(P<0.05)，尤其是DR5的提高呈劑量依賴性，提示雷公藤紅素可能致敏免疫細胞對OS細胞的殺傷作用。

我們前期研究發(fā)現健康人及不同類型OS患者PBMCs經ZOL刺激可選擇性高度擴增γδ T細胞[7]，尤其重要的是，這種體外擴增的γδ T細胞對OS細胞具有殺傷作用[14]。但是，本研究及我們前期研究結果表明γδ T細胞對OS細胞的殺傷作用較弱[15]。為觀察雷公藤紅素對γδ T細胞殺傷HOS細胞的影響，本研究結果顯示1 μmol/L的雷公藤紅素預處理HOS 24 h，可增強γδ T細胞對HOS細胞殺傷作用(P<0.05)。

為確定雷公藤紅素增強γδ T細胞殺傷HOS細胞的作用途徑，我們使用TRAIL中和抗體，阻斷γδ T細胞TRAIL殺傷途徑。結果顯示，其對未處理的HOS細胞及雷公藤紅素預處理的HOS細胞的殺傷作用無統計學差異(P>0.05)，提示雷公藤紅素增強γδ T細胞對OS細胞株HOS的殺傷作用是通過TRAIL途徑發(fā)揮作用。

為了進一步觀察雷公藤紅素對γδ T細胞增殖及殺傷活性的影響，我們首先采用MTT法觀察不同濃度雷公藤紅素對γδ T細胞增殖的影響，結果顯示， 在含濃度達到4 μmol/L的雷公藤紅素培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，γδ T細胞增殖率仍然達到(86.0±2.3)%。為觀察雷公藤紅素對γδ T細胞殺傷活性的影響，我們選擇對γδ T細胞殺傷敏感的Daudi細胞作為靶細胞，γδ T細胞在含1 μmol/L的雷公藤紅素的完全培養(yǎng)基孵育24 h后， γδ T細胞對Daudi細胞殺傷活性無明顯變化(圖4B)。因此，我們認為小劑量雷公藤紅素對γδ T細胞增殖及殺傷活性無影響，在本研究中我們采用1 μmol/L的雷公藤紅素預處理骨肉瘤細胞系HOS。

綜上所述，雷公藤紅素能上調骨肉瘤細胞表面死亡受體DR4和DR5，進一步促進γδ T細胞對HOS細胞的殺傷作用，TRAIL中和抗體可阻斷雷公藤紅素增強γδ T細胞對HOS細胞的殺傷作用。

[1] Li Z.Potential of human gammadelta T cells for immunotherapy of osteosarcoma[J].Mol Biol Rep,2013,40(1):427-437.

[2] 李朝旭,王銳英,唐際存.丙戊酸鈉增強γδT細胞對骨肉瘤的殺傷[J].中華實驗外科雜志,2016,33(1):154-157.

[3] 李朝旭,王銳英,唐際存.γδT 細胞對耐甲氨蝶呤骨肉瘤細胞株U2OS的殺傷作用[J].中華微生物學和免疫學雜志,2015,35(7):523-526.

[4] Li Z,Peng H,Xu Q,etal.Sensitization of human osteosarcoma cells to Vγ9υδ2 T-cell-mediated cytotoxicity by zoledronate[J].J Orthop Res,2012,30(5):824-830.

[5] 李朝旭,唐際存,葉招明.IFN-γ增強人γδ T細胞殺傷骨肉瘤細胞的研究[J].南方醫(yī)科大學學報,2013,33(1):22-25.

[6] 李朝旭,王銳英,唐際存.Ⅰ型IFN體外增強人γδT 細胞對骨肉瘤的殺傷作用[J].中國免疫學雜志,2014,30(11):1533-1535,1542.

[7] 李朝旭,孫凌凌,程瑞林,等.唑來膦酸刺激健康人和骨肉瘤PBMCs體外擴增γδT細胞[J].細胞與分子免疫學雜志,2012,28(8):822-824.

[8] Spencer SL,Gaudet S,Albeck JG,etal.Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis[J].Nature,2009,459(7245):428-432.

[9] 李朝旭,唐際存.γδT細胞過繼細胞免疫治療惡性實體腫瘤研究進展[J].細胞與分子免疫學雜志,2015,31(4):565-568.

[10] Wilson NS,Yang A,Yang B,etal.Proapoptotic activation of death receptor 5 on tumor endothelial cells disrupts the vasculature and reduces tumor growth[J].Cancer Cell,2012,22(1):80-90.

[11] Picarda G,Lamoureux F,Geffroy L,etal.Preclinical evidence that use of TRAIL in Ewing′s sarcoma and osteosarcoma therapy inhibits tumor growth,prevents osteolysis,and increases animal survival[J].Clin Cancer Res,2010,16(8):2363-2374.

[12] Sung B,Park B,Yadav VR,etal.Celastrol,a triterpene,enhances TRAIL-induced apoptosis through the down-regulation of cell survival proteins and up-regulation of death receptors[J].J Biol Chem,2010,285(15):11498-11507.

[13] Zhu H,Liu XW,Ding WJ,etal.Up-regulation of death receptor 4 and 5 by celastrol enhances the anti-cancer activity of TRAIL/Apo-2L[J].Cancer Lett,2010,297(2):155-164.

[14] 李朝旭,唐際存,孫凌凌,等.唑來膦酸對骨肉瘤患者PBMCs來源γδT細胞抗骨肉瘤作用的影響[J].細胞與分子免疫學雜志,2013,29(1):6-9.

[15] Li Z,Xu Q,Peng H,etal.IFN-gamma enhances HOS and U2OS cell lines susceptibility to gammadelta T cell-mediated killing through the Fas/Fas ligand pathway[J].Int Immunopharmacol,2011,11(4):496-503.

[收稿2016-04-13 修回2016-05-18]

(編輯 倪 鵬)

Celastrol increases osteosarcoma cells line HOS lysis by γδ T cells through TRAIL way

LI Zhao-Xu,ZHANG Jun-Zhe,WANG Sheng-Tao,WANG Rui-Ying,TANG Ji-Cun.

Department of Orthopaedics No.2,Affiliated Hospital of Guilin Medical University,Guilin 541004,China

Objective:To investigate whether celastrol can increase the cytotoxic activity of γδ T cells against osteosarcoma(OS) cells line HOS through TRAIL way.Methods:The death receptors 4/5 (DR4/5) protein levels in the OS cell lines HOS was investigated by Western blot analysis.Zoledronate (ZOL) was used to induce γδ T cells from PBMCs of healthy volunteers.γδ T cell cytotoxicity against HOS cells was investigated by a standard lactate dehydrogenase release assay (LDH).Results:Celastrol increased DR4/5 protein expression in HOS (P<0.05).γδ T cells from PBMCs of healthy volunteers showed cytotoxicity against HOS (P<0.05).Following co-culture with HOS pre-treated with celastrol (1 μmol/L) for 24 h,γδ T cells showed significantly higher cytotoxicity against HOS (P<0.05).The induction of DR4/5 molecules increased lysis of HOS by γδ T cells which was abolished by addition of a blocking TRAIL antibody.Conclusion:Celastrol can enhance γδ T cells′cytotoxic activity against OS cells line HOS through TRAIL way.

Osteosarcoma;γδ T cell;Immunotherapy;Celastrol

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.011

①本文為國家自然科學基金 (81360400)和廣西自然科學基金(2014GXNSFAA118169)資助項目。

李朝旭(1977年-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事骨與軟組織腫瘤的生物治療方面研究，E-mail:lizhaoxu@glmc.edu.cn。

R392.12

A

1000-484X(2016)12-1777-04

②通訊作者，E-mail:tangjicun@glmc.edu.cn。