張紅霞 吳廣勝

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液風(fēng)濕科，石河子832000)

β-arrestin1激活STAT3信號通路影響白血病細(xì)胞K562體外遷移侵襲能力

張紅霞 吳廣勝

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液風(fēng)濕科，石河子832000)

目的：探討β-arrestin1對白血病細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及相關(guān)機(jī)制的研究。方法：特異性的β-Arrestin1-siRNA和陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，形成β-Arrestin1-siRNA組、陰性對照siRNA組和空白組對照組。以此為實(shí)驗(yàn)分組，應(yīng)用transwell小室法檢測各組細(xì)胞的遷移侵襲能力變化，Western blot檢測pSTAT3蛋白的表達(dá)。結(jié)果：β-Arrestin1-siRNA處理組細(xì)胞的遷移和侵襲能力較對照組分別下降43%及52%(P<0.05)；且pSTAT3蛋白表達(dá)減少；STAT3抑制劑能抑制K562細(xì)胞體外遷移侵襲能力。結(jié)論：白血病細(xì)胞K562中β-arrestin1蛋白高表達(dá)激活STAT3信號通路，從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移侵襲能力。

β-arrestin1；STAT3；遷移侵襲

慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是一類以髓系細(xì)胞慢性增殖為主要特征，發(fā)生在造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，占白血病確診病例15%～20%，年發(fā)病率為(1～1.5)/10萬[1,2]。95%患者骨髓中可以發(fā)現(xiàn)bcr/abl融合基因陽性，特征性t(9；22)(p34；q11)染色體移位，即Ph染色體。目前有研究報(bào)道CML與Wnt/β-catenin、Hedgehog(Hh)、PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT等信號通路的異常激活密切相關(guān)[3-6]。

β-arrestin 是一類細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，其家族的兩個(gè)主要成員為β-arrestin1和β-arrestin2，廣泛存在于機(jī)體各組織與器官中；β-Arrestin1是一類有多種功能的信號蛋白，通過七次跨膜偶聯(lián)受體(GPCRs) 介導(dǎo)形成蛋白復(fù)合物，在ERK、JNK3、JAK/STAT等信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，從而參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等過程的發(fā)生。另外，β-arrestin通過結(jié)合其他信號分子，并調(diào)節(jié)這些分子的磷酸化、泛素化或其細(xì)胞內(nèi)定位等過程，從而對相應(yīng)的信號通路進(jìn)行調(diào)控，達(dá)到調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生命進(jìn)程的最終目標(biāo)。

大量研究表明β-arrestin1在白血病中明顯高表達(dá)，并且通過激活相關(guān)信號通路從而調(diào)控急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞和慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖[7-9]?；谶@些研究，本實(shí)驗(yàn)組通過應(yīng)用siRNA技術(shù)，抑制白血病細(xì)胞K562中的β-arrestin1表達(dá)，從而觀察K562細(xì)胞體外遷移和侵襲能力的變化，并進(jìn)一步探討這一變化的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 anti-β-arrestin1 抗體(Abcam)；GAPDH單克隆抗體(生工上海股份有限公司)；anti-p-STAT3和anti-STAT3(Cell Signaling公司)；1640培養(yǎng)基和胎牛血清(HyClone公司)；Lipofectamine 2000、陰性對照siRNA、β-arrestin1特異性siRNA及Opti-MEM減血清培養(yǎng)基(Life technologies公司)；24-Well Cell Migration and Invasion試劑盒(cell biolabs)；STAT3通路的抑制劑(JSI-124)(Calbiochem公司)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)分組 將未轉(zhuǎn)染的K562細(xì)胞列為空白對照組、轉(zhuǎn)染negative-siRNA的K562細(xì)胞列為陰性對照組、轉(zhuǎn)染β-arrestin1-siRNA的K562細(xì)胞列為實(shí)驗(yàn)組。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562購自American Type Culture Collection公司。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清高糖培養(yǎng)基中，置于37℃含5%CO2孵箱。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)情況，于細(xì)胞生長的對數(shù)生進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，將3條特異性β-arrestin1-siRNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞，并篩選出抑制效果最好的一條。Lipofectamine? 2000用Opti-MEM預(yù)混后，靜置5 min，分別用Opti-MEM稀釋3條β-arrestin1-siRNA和negative-siRNA，取對應(yīng)量的稀釋的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine? 2000與β-arrestin1-siRNA和negative-siRNA混勻，室溫環(huán)境下靜置20 min。將混合物按分組加入鋪好細(xì)胞的6孔板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 Western blot檢測細(xì)胞中蛋白的表達(dá) PBS充分洗滌細(xì)胞3次，RIPA裂解液裂解細(xì)胞并抽提總蛋白。BCA法檢測細(xì)胞總蛋白濃度，隨后定量35 μg總蛋白，并按照5∶1比例與6×SDS-PAGE上樣緩沖液混合后，95℃加熱5 min。10%SDS-PAGE膠上電泳，轉(zhuǎn)膜，5%BSA室溫封閉1 h，再分別加入1∶500～1∶2 000稀釋后的相應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜。次日洗滌3次，分別加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗(稀釋比例為1∶5 000)，室溫孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光法顯色并用ECL凝膠成像系統(tǒng)(ECL,USA)采集圖像。重復(fù)3次。

1.2.4 transwell小室法檢測細(xì)胞遷移、侵襲能力 對轉(zhuǎn)染48 h后的K562細(xì)胞進(jìn)行重懸，然后進(jìn)行臺盼藍(lán)染色，對細(xì)胞存活率鑒定，超過95%則進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。嚴(yán)格按照transwell說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。以3×106個(gè)/孔的密度將細(xì)胞接種于含有和不含有基質(zhì)膠的transwell的上室中，分別用于測定K562細(xì)胞的遷移和侵襲能力；對于侵襲實(shí)驗(yàn)在transwell的下室中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液。將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24 h后對穿膜的K562細(xì)胞進(jìn)行染色，并用酶標(biāo)儀測定其OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 siRNA對β-arrestin1蛋白表達(dá)的抑制作用 用β-arrestin1 siRNA轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞48 h后提取細(xì)胞總蛋白，通過Western blot檢測β-arrestin1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，特異性siRNA處理后，細(xì)胞內(nèi)β-arrestin1水平顯著降低(圖1)，抑制率為73.3%～78.9%，且第3條序列的抑制率最佳，故選擇該條序列抑制K562細(xì)胞體內(nèi)β-arrestin1的表達(dá)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 特異性siRNA干擾β-arrestin1蛋白對K562細(xì)胞體外遷移、侵襲能力的影響 特異性β-arrestin1 siRNA處理K562細(xì)胞48 h后， transwell檢測K562細(xì)胞體外遷移、侵襲能力的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異性β-arrestin1 siRNA處理K562細(xì)胞相較于陰性對照或空白對照組的細(xì)胞，侵襲和遷移能力均有顯著下降(43%和52%)，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見圖2。

圖1 Western blot法檢測特異性siRNA對β-arrestin1蛋白表達(dá)抑制效率Fig.1 Western blot analysis assess knockdown efficiency of β-arrestin1 siRNANote:Compared with the control and negative siRNA,*.P<0.05.

圖2 K562細(xì)胞遷移侵襲能力的檢測Fig.2 Detection of migratory and invasive K562 cellsNote:Compared with the control and negative siRNA,*.P<0.05.

圖3 Western blot法檢測RNA敲除β-arrestin1后pSTAT3的表達(dá)Fig.3 Assessing expression of pSTAT3 post β-arrestin1-siRNA transfection by using Western blot analysisNote:Compared with the control and negative siRNA,*.P<0.05.

2.3 Western blot檢測各組細(xì)胞內(nèi)p-STAT3的表達(dá)水平 β-arrestin1 siRNA轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞48 h后提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)Western blot法檢測，結(jié)果表明相較于陰性對照或空白對照組，β-arrestin1 siRNA處理組磷酸化的STAT3蛋白(pSTAT3)表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖3。

圖4 抑制STAT3的磷酸化對K562細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig.4 Impact on migration and invasion capacity of K562 cells by inhibiting phosphorylation of STAT3 pathwayNote:Compared with the control group,*.P<0.05.

2.4 抑制K562細(xì)胞內(nèi)pSTAT3的表達(dá)對K562細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響 STAT3的抑制劑處理transwell上室中的K562細(xì)胞，檢測其體外侵襲、遷移能力的變化；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，STAT3的抑制劑處理組K562細(xì)胞的侵襲和遷移能力均較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

3 討論

慢性粒細(xì)胞白血病是一種常伴有白細(xì)胞異常增生及分化成熟障礙，起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性、增殖性疾病，因此檢測白血病細(xì)胞特異基因的表達(dá)改變可能有助于白血病的早期診斷及治療。腫瘤細(xì)胞的高侵襲遷移被認(rèn)為是目前影響腫瘤治療和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素。

Arrestins家族廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)，是一類可溶性蛋白質(zhì)，對G蛋白受體的信號傳導(dǎo)起關(guān)鍵作用，并且也能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)其他多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]。β-arrestin1是家族的主要成員，是在β腎上腺素受體激酶[11]純化過程中被發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵的支架蛋白[12]和信號調(diào)控因子[13]。有研究表明，β-arrestin1參與多種疾病，尤其是惡性腫瘤的發(fā)生。如β-arrestin1通過激活β-catenin 信號傳導(dǎo)途徑,使卵巢癌細(xì)胞體外遷移能力明顯增強(qiáng)[14]；另外還有研究發(fā)現(xiàn)在β-arrestin1轉(zhuǎn)基因小鼠中，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)以及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9的表達(dá)增加，微小血管的形成得到了增強(qiáng)，對于細(xì)胞的侵襲、遷移以及血管的形成有利，從而提供了腫瘤生長適宜的微環(huán)境[15]。本研究采用siRNA技術(shù)抑制白血病細(xì)胞K562中β-arrestin1的表達(dá)后，觀察K562細(xì)胞體外浸潤和轉(zhuǎn)移能力的變化，結(jié)果與學(xué)者們研究結(jié)果一致。這些研究表明β-arrestin1的高表達(dá)能夠促進(jìn)白血病細(xì)胞向周圍淋巴結(jié)浸潤和轉(zhuǎn)移。

腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移是由多種細(xì)胞因子和多種信號通絡(luò)調(diào)節(jié)和介導(dǎo)的，其中，JAK/STAT3通路的異常激活可促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞浸潤。Bonetto[16]在研究中指出，IL-6可通過激活磷酸化的STAT3，從而膠質(zhì)瘤細(xì)胞的浸潤及轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，而當(dāng)使用STAT3抑制劑處理細(xì)胞后，則能抑制IL-6引起的效應(yīng)，有研究發(fā)現(xiàn)在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)JAK/STAT3通路的異常激活，可引起下游的VEGF明顯高表達(dá)從而對胃癌的發(fā)生、遷移和侵襲有重要的作用。基于JAK/STAT3通路對腫瘤細(xì)胞的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)觀察了抑制K562細(xì)胞中β-arrestin1的表達(dá)后 STAT3磷酸化水平的變化，結(jié)果表明抑制β-arrestin1表達(dá)使K562細(xì)胞內(nèi)磷酸化的STAT3水平顯著降低。另外，我們用STAT3通路抑制劑JSI-124抑制STAT3激活后，可觀察到細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移能力顯著降低。進(jìn)一步證明β-arrestin1通過激活白血病細(xì)胞K562體內(nèi)JAK/STAT3信號通路，使K562細(xì)胞遷移侵襲能力明顯增強(qiáng)。

綜上所述，β-arrestin1的高表達(dá)與白血病細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，并且揭示了β-arrestin1對JAK/STAT3信號通路的作用，為發(fā)現(xiàn)慢性髓系白血病新的藥物治療靶點(diǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。

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[收稿2016-04-15 修回2016-06-02]

(編輯 許四平)

β-arrestin1 promotes leukemia cell K562 migration and invasion by activating STAT3 signaling pathway

ZHANG Hong-Xia,WU Guang-Sheng.

Department of Rheumatism,the First Affiliated Hospital of Shihezi University Medical College,Shihezi 832000,China

Objective:To investigate the function of β-arrestin1 and its related mechanisms in migration and invasion capacity of leukemia cell K562.Methods:β-arrestin1-siRNA or negative siRNA was transfected into K562 cells of experiment group or control group.The migration and invasion capacity of K562 cells was detected by transwell tests;and the protein expression of β-arrestin1 and pSTAT3 were detected by Western blot.Results:As compared to control group and negative siRNA group,the migration and invasion capacity of transfected β-arrestin1-siRNA group were attenuated about 43% or 52% (P<0.05);Western blot showed that the expression of phosphorylation of STAT3 was decreased in β-arrestin1-siRNA group.And the STAT3 inhibitors obviously suppressed the migration and invasion capacity of K562 cells.Conclusion:In leukemia cells K562,β-arrestin1 activates STAT3 signaling pathway to promote the cell migration and invasion.

β-arrestin1;STAT3;Migration and invasion

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.010

張紅霞(1980年-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事白血病、骨髓增生異常綜合征等血液病方面的研究，E-mail：zhanghongxia3839@163.com。

及指導(dǎo)教師：吳廣勝(1959年-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事血液病方面的研究，E-mail：hematology@126.com。

R733.7

A

1000-484X(2016)12-1773-04