聶 鑫 余益本 文格波

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院老年病科，十堰442000)

鹽酸吡格列酮對(duì)糖尿病大鼠腎組織TOLL受體4/MAPKs信號(hào)通路的影響

聶 鑫 余益本①②文格波②

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院老年病科，十堰442000)

目的：探討吡格列酮對(duì)糖尿病腎病大鼠腎組織中TOLL受體4/MAPKs信號(hào)通路的影響。方法：將雄性SD隨機(jī)分為對(duì)照組(n=8)和試驗(yàn)組(n=32)。試驗(yàn)組SD鼠造模成功后隨機(jī)分為3組進(jìn)行干預(yù),應(yīng)用Western blot檢測(cè)對(duì)照組和干預(yù)組大鼠腎組織中絲裂原活化蛋白激酶ERK1/2及p38MAPK磷酸化水平。結(jié)果：與對(duì)照組比較，各組大鼠腎組織中TOLL受體4表達(dá)增強(qiáng)，其中ERK1/2與JNK磷酸化水平明顯升高(P<0.05)，但p38MAPK水平變化不明顯(P>0.05)；與模型組比較，吡咯列酮干預(yù)組大鼠腎組織中ERK1/2與p38MAPK磷酸化水平降低 (P<0.05)。結(jié)論：吡格列酮通過TOLL受體4/MAPKs/ERK1/2與TOLL受體4/MAPKs/JNK信號(hào)通路來完成，延緩糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展。

鹽酸吡格列酮；糖尿病腎??；TOLL受體4/MAPKs信號(hào)通路

糖尿病腎病是導(dǎo)致終末期腎衰竭的重要原因之一，目前認(rèn)為糖尿病腎病受多方面因素的影響，包括遺傳因素、血流動(dòng)力學(xué)異常、高糖相關(guān)的生化代謝異常等。近年免疫、炎癥學(xué)說備受關(guān)注，TLR(TOLL-like receptors，TLR)是促使免疫炎癥反應(yīng)加重的重要因素之一,發(fā)現(xiàn)TLR是介導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)的橋梁[1]。我們?cè)谇捌谘芯恐校名}酸吡格列酮對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行干預(yù)后能減少腎組織微血管TOLL受體4表達(dá)[2]，但鹽酸吡格列酮改善糖尿病腎臟疾病通過何種機(jī)制的報(bào)道尚不多見?，F(xiàn)通過研究鹽酸吡格列酮對(duì)糖尿病腎組織TOLL受體4/MAPKs下游信號(hào)蛋白磷酸化的表達(dá)，了解其治療糖尿病腎病的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性SD大鼠40只，6周齡，體質(zhì)量100～200 g，購(gòu)自湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部，許可證編號(hào)SCXK(鄂)2014-01346 ；鏈脲佐菌素(STZ)購(gòu)自Sigma公司；鹽酸吡格列酮(15 mg/片)由杭州中美華東制藥有限公司提供；兔抗小鼠TOLL受體4、p-ERK、p-p38MAPK及p-JNK抗體由武漢寶曼公司提供。①40只雄性清潔級(jí)SD大鼠，喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(n=8)和造模組(n=32)。將32只大鼠按50 mg/kg通過腹腔注射STZ，在72 h后測(cè)3次隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病大鼠模型，有24只大鼠造模成功，作為實(shí)驗(yàn)組(n=24)[3]。將成模大鼠隨機(jī)分為3組，每組8只：模型組，小劑量吡格列酮組6 mg/(kg·d)，大劑量吡格列酮組12 mg/(kg·d)。②在造模成功后開始干預(yù)，實(shí)驗(yàn)組及正常對(duì)照組僅給予12 mg/(kg·d)生理鹽水灌胃，低劑量組、高劑量組分別給予吡格列酮6、12 mg/(kg·d)灌胃。上午8點(diǎn)給藥，連續(xù)8周。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠腎臟組織病理學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠經(jīng)氯胺酮麻醉后，取腹正中切口暴露雙腎及腹主動(dòng)脈，經(jīng)腹主動(dòng)脈插管，用冷PBS將雙腎充分灌洗后，取左腎經(jīng)腎門冠狀面取組織，石蠟切片，厚4 μmol/L，行HE染色。送湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院病理教研室進(jìn)行HE染色分析，了解大鼠腎臟組織病變情況。

1.2.2 Western blot檢測(cè)蛋白的表達(dá) 檢測(cè)大鼠腎組織，立即放入預(yù)冷的裂解緩沖液中，4℃超聲粉碎，離心 30 min，取上清，Bradford 法測(cè)定蛋白濃度。用10% 的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 分離蛋白質(zhì)，電泳后將 PAGE凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，取出膜放至3% BSA 阻斷緩沖液中，振蕩封閉1 h，TBS洗膜 3 次，每次 10 min。將膜放入一抗中(抗體1∶500 稀釋)，4℃過夜。10 min×3次洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(抗體1∶500 稀釋) 37℃振蕩 1 h，用大量 TBS液 10 min×3 次洗膜后用 ECL試劑暗室內(nèi)膠片曝光,測(cè)定TOLL受體4,經(jīng)X膠片曝光顯影，并用GIS1000分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值的數(shù)字化。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎臟組織病理改變 光鏡下觀察：正常對(duì)照組大鼠腎臟表面光滑，形狀正常；光鏡下見腎小球結(jié)構(gòu)清晰，球囊壁光滑，未見增大及萎縮；腎小管上皮細(xì)胞呈方形，大小整齊一致；基底膜完整，間質(zhì)中無纖維組織增生，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組多數(shù)大鼠腎臟體積增大，光鏡下腎小球肥大，腎小球明顯充血、腫脹，腎小球內(nèi)細(xì)胞數(shù)目明顯增多,基底膜不規(guī)則增厚、皺曲，腎小囊腔變窄，部分腎小管亦明顯擴(kuò)張，上皮細(xì)胞破碎程度加深、明顯水腫。小劑量吡格列酮組大鼠腎組織系膜基質(zhì)增生減輕，少數(shù)腎小管擴(kuò)張，上皮細(xì)胞水腫減輕，糖原空泡減少。大劑量吡格列酮組大鼠腎組織系膜基質(zhì)增生明顯減輕，腎小管無擴(kuò)張，上皮細(xì)胞輕微水腫。見圖1。

2.2 大鼠腎臟組織中TOLL受體4蛋白的表達(dá) 正常對(duì)照組大鼠腎臟組織TOLL受體4蛋白表達(dá)較弱,與正常對(duì)照組比較,模型組、小劑量吡格列酮組、大劑量吡格列酮組TOLL受體4表達(dá)明顯增強(qiáng),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較, 小劑量吡格列酮組、大劑量吡格列酮組TOLL受體4蛋白表達(dá)明顯減弱,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、3。

圖1 大鼠腎組織HE染色(HE，×400)Fig.1 HE staining of rat renal tissues(HE,×400)Note:A.Normal control group;B.Model group;C.Low-dose pioglitazone group;D.Large-dose pioglitazone group.

圖2 Western blot 免疫印跡檢測(cè)大鼠腎組織中TOLL受體4蛋白表達(dá)Fig.2 Expression of TOLL-like receptor 4 protein in rat renal tissues by Western blotNote:A.Normal control group;B.Model group;C.Low-dose pioglitazone group;D.Large-dose pioglitazone group.

圖3 大鼠組織TOLL受體4蛋白表達(dá)的比較Fig.3 Comparison of four groups′ expression of TOLL-like receptor 4 protein in rat renal tissuesNote:Compared with control group,*.P<0.05,compared with model group,#.P<0.05.A.Normal control group;B.Model group;C.Low-dose pioglitazone group;D.Large-dose pioglitazone group.

圖4 Western blot免疫印跡檢測(cè)大鼠腎組織ERK1/2表達(dá)變化Fig.4 Expression of ERK1/2 protein in rat renal tissues by Western blotNote:A.Normal control group;B.Model group;C.Low-dose pioglitazone group;D.Large-dose pioglitazone group.

圖5 大鼠腎組織ERK1/2表達(dá)的比較Fig.5 Comparison of four groups′ expression of ERK1/2 protein in rat renal tissuesNote:Compared with control group,*.P<0.05；compared with model group,#.P<0.05.

2.3 糖尿病大鼠腎臟組織中TOLL樣受體4/MAPKs信號(hào)通路被激活 Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，其余3組大鼠腎組織ERK1/2與p38MAPK磷酸化水平明顯升高(P<0.05)，其中模型組大鼠腎組織ERK1/2是正常對(duì)照組的5倍，而JNK水平變化不明顯(P>0.05)，見圖4～7。結(jié)果顯示糖尿病大鼠腎組織TOLL受體4/MAPKs信號(hào)通路處于激活狀態(tài)。

圖6 Western blot免疫印跡檢測(cè)大鼠腎組織p38MAPK表達(dá)變化Fig.6 Expression of p38MAPK protein in rat renal tissues by Western blotNote:A.Normal control group;B.Model group;C.Low-dose pioglitazone group;D.Large-dose pioglitazone group.

圖7 大鼠腎組織p38MAPK表達(dá)的比較Fig.7 Comparison of four groups′ of expression of p38MAPK protein in rat renal tissuesNote:Compared with control group,*.P<0.05；compared with model group，#.P<0.05.

圖8 Western blot免疫印跡檢測(cè)大鼠腎組織JNK表達(dá)變化Fig.8 Expression of JNK protein in rat renal tissues by Western blotNote:A.Normal control group;B.Model group;C.Low-dose pioglitazone group;D.Large-dose pioglitazone group.

2.4 鹽酸吡格列酮對(duì)糖尿病大鼠腎臟組織中TOLL受體4/MAPKs信號(hào)通路的影響 與模型組比較，發(fā)現(xiàn)鹽酸吡咯列酮干預(yù)組大鼠腎組織ERK1/2磷酸化水平降低 (P<0.05)，以10 mg/(kg·d)最明顯(P<0.05) 。此外，Western blot免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)干預(yù)組大鼠腎組織p38MAPK表達(dá)也有下降(P<0.05)，而JNK水平無明顯變化(如圖3、4、8、9)。

圖9 大鼠腎組織JNK表達(dá)的比較Fig.9 Comparison of four groups′ expression of JNK protein in rat renal tissuesNote:Compared with control group,*.P<0.05；compared with model group,#.P<0.05.

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腎組織TOLL受體4 的表達(dá)顯著提高，其激活后，主要通過兩條信號(hào)路徑：TOLL受體4/NF-κB 和TOLL受體4/MAPKs，調(diào)節(jié)各種免疫和炎癥介質(zhì)的基因表達(dá)[4]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾條并行的MAPKs有關(guān)的信號(hào)通路,分別為ERK1/2、JNK/SAPK和p38等[5]。研究表明絲裂原活化蛋白激酶(MAPK) 信號(hào)通路廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，導(dǎo)致一系列與糖尿病腎病相關(guān)的細(xì)胞因子、炎癥因子、趨化因子等的合成與釋放，加速了糖尿病腎病發(fā)生與發(fā)展[6，7]。我們研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠腎組織TOLL受體4/MAPKs信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，主要由TOLL受體4/MAPKs/ERK1/2與TOLL受體4/MAPKs/p38MAPK兩條下游信號(hào)通路參與糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展。

噻唑烷二酮類藥物(TZDs)鹽酸吡格列酮與胰島素抵抗、糖脂類代謝及肪細(xì)胞的分化關(guān)系密切，此外還具有抑制血管平滑肌細(xì)胞的增生和遷移，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞中促炎癥因子生成，抗動(dòng)脈粥樣硬化等生物學(xué)效應(yīng)[8-11]。但鹽酸吡格列酮是否對(duì)糖尿病大鼠腎臟組織TOLL受體4及其下游信號(hào)產(chǎn)生影響尚未見報(bào)道，研究在鹽酸吡格列酮干預(yù)下，糖尿病大鼠腎組織TOLL受體4蛋白表達(dá)明顯減弱，表明其能抑制TOLL受體4的活性[2]。為了進(jìn)一步探究TOLL受體4/MAPKs信號(hào)通路在鹽酸吡格列酮抗炎作用中的作用，測(cè)定了ERK1/2、JNK和p38MAPK的磷酸化水平。結(jié)果顯示同糖尿病腎病模型組相比，干預(yù)組可以有效地抑制ERK1/2和p38MAPK的磷酸化，綜合以上實(shí)驗(yàn) ，TOLL受體4/MAPKs信號(hào)通路激活后，可能參與了糖尿病腎病病理發(fā)生發(fā)展,我們初步可認(rèn)為鹽酸吡格列酮能作為TOLL受體4的內(nèi)源性藥物靶點(diǎn)，使TOLL受體4表達(dá)減弱，進(jìn)而減少ERK1/2和p38MAPK磷酸化來完成，延緩糖尿病腎病的進(jìn)展。綜上所述，初步證實(shí)了TOLL受體4/MAPKs/ERK1/2與TOLL受體4/MAPKs/p38MAPK信號(hào)通路的激活可能參與了糖尿病腎病病理進(jìn)程，但TOLL受體4/MAPKs信號(hào)通路激活后是如何進(jìn)一步影響糖尿病腎病的進(jìn)程有待研究證明。

[1] Bot A.In this issue:autoimmunity and innate immunity [J].Int Rev Immunol，2014，33(1):1-2.

[2] 余益本，吳移謀，文格波,等.鹽酸吡格列酮對(duì)糖尿病大鼠腎組織TLR4表達(dá)的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2014,30(8):793-796.

[3] Ma KL,Zhang Y,Liu J,etal.Establishment of an inflamed animal model of diabetic nephropathy[J].Int J Biol Sci，2014，10(2):149-159.

[4] 余益本，王建平.TLR信號(hào)通路研究進(jìn)展[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2012,28(12):1331-1334.

[5] Kyriakis JM,Avruch J.Mammalian MAPK signal transduction pathways activated by stress and inflammation:a 10-year update[J].Physiol Rev，2012，92(2):689-737.

[6] Siasos G,Tousoulis D,Siasou Z，etal.Shear stress,protein kinases and atherosclerosis[J].Curr Med Chem，2007，14(14):1567-1572.

[7] Blanc A,Pandey NR,Srivastava AK.Synchronous activation of ERK 1/2,p38mapk and PKB/Akt signaling by H2O2 in vascular smooth muscle cells:potential involvement in vascular disease [J].Int J Mol Med，2003，11(2):229-234.

[8] Zhang F,Kong D,Lu Y,etal.Peroxisome proliferator-activated receptor-γ as a therapeutic target for hepatic fibrosis:from bench to bedside[J].Cell Mol Life Sci，2013,70(2):259-276.

[9] 余益本,陳 欣，程 立，等.吡格列酮對(duì)載脂蛋白E-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化中Toll樣受體4/絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路的影響[J].中國(guó)心血管雜志，2014,19(6)：444-448.

[10] Jung UJ,Torrejon C,Chang CL,etal.Fatty acids regulate endothelial lipase and inflammatory markers in macrophages and in mouse aorta:a role for PPARγ[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2012，32(12):2929-2937.

[11] Ji Y,Liu J,Wang Z,etal.PPARgamma agonist,rosiglitazone,regulates angiotensin II-induced vascular inflammation through the TOLL4-dependent signaling pathway [J].Lab Invest，2009,89(8):887-902.

[收稿2016-03-03 修回2016-04-29]

(編輯 許四平)

Role of TOLL-like receptor 4/MAPKs pathway of renal tissue in diabetic rats by pioglitazone

NIE Xin,YU Yi-Ben,WEN Ge-Bo.

Department of Gerontology,the Dongfeng Hospital Affiliated to Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China

Objective:To study the role of TOLL-like receptor4/MAPKs pathway of renal tissue in the diabetic rats treated with piogitazone.Methods:The male Sprague Dawlry rats were randomly selected as the control group (n=8) and experimental group(n=32).The experimental rats were randomly divided into three groups.The expression of ERK1/2,JNK and p38MAPK,and levels of their phosphorylation in kidney were measured by Western blot in control group and experimental group.Results:The expression of TOLL-like receptor 4 in all renal tissue in the diabetic rats were significantlyincreased than those in control group (P<0.01).Compared with the control group.The activity of p-ERK1/2 and p38MAPK significantly increased in each experimental group (P<0.05),but the expression level of p-JNK was no statistical significance.TOLL-like receptor 4 could regulatory effect on the phorylation of ERK1/2 and p38MAPK.Compared with the model group,the expression of p-ERK1/2 and p38MAPK significantly decreased(P<0.05),moreover,these changes were more significant in high-dose treated group (P<0.05).Conclusion:Pioglitazone inhibits the expression of TOLL-like receptor 4 of renal tissue in the diabetic rats,and these effects may be related to TOLL-like receptor 4/ERK1/2 and TOLL-like receptor 4/p38MAPK pathways.

Pioglitazone;Diabetic nephropathy;TOLL-like receptor 4/MAPKs signaling pathway

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.009

聶 鑫(1970年-)，女，碩士，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的研究，E-mail：niexin1970@163.com。

及指導(dǎo)教師：余益本(1986年-)，男，碩士，主要從事糖尿病血管病變分子免疫機(jī)理方面的研究，E-mail：yuyiben@126.com。

R392.5

A

1000-484X(2016)12-1769-04

①南華大學(xué)病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衡陽(yáng)421001。

②南華大學(xué)國(guó)家臨床醫(yī)學(xué)研究中心，衡陽(yáng)421001。