李 偉 卓召振 駱姝琳 任凌雁 陳 琨 劉水和 袁 軍

(貴州省人民醫(yī)院中心實驗室，貴陽550002)

不同乳腺癌細胞系中TLR5和NLRC4受體的表達和定位①

李 偉 卓召振 駱姝琳 任凌雁 陳 琨 劉水和 袁 軍

(貴州省人民醫(yī)院中心實驗室，貴陽550002)

目的：探究TLR5和NLRC4受體在不同乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-435中的表達和定位情況，并探討重組鞭毛素蛋白對乳腺癌細胞TLR5受體的激活情況。方法：利用Real-time PCR法檢測MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-435細胞TLR5和NLRC4 mRNA表達水平，用流式細胞儀檢測MDA-MB-231、MCF-7細胞TLR5受體的表達和定位。純化重組鞭毛素蛋白即全長鞭毛素蛋白FliC(同時激活TLR5和NLRC4兩條通路)、FliCΔ90-97(不能激活TLR5通路)、FliC-L3A(不能激活NLRC4通路)、FliCΔ90-97:L3A(兩條通路都不激活)。用1μg/ml重組鞭毛素蛋白刺激MCF-7細胞，12 h后，ELISA法檢測IL-8的分泌。結果：MCF-7細胞TLR5 mRNA表達水平最高，約是MDA-MB-435細胞的1 700倍，MDA-MB-231細胞TLR5表達水平是MDA-MB-435的約200倍。TLR5在MCF-7細胞漿和胞膜上均有表達，而MDA-MB-231細胞只在胞漿中表達。激活TLR5通路的FliC和FliC-L3A能夠刺激MCF-7細胞分泌IL-8，而不激活TLR5通路的FliCΔ90-97和FliCΔ90-97:L3A則不能。結論：不同乳腺癌細胞系都表達TLR5和NLRC4，但是表達部位和表達水平不同。MCF-7細胞TLR5和NLRC4表達高于其他乳腺癌細胞系。乳腺癌細胞系表面的TLR5受體可以被鞭毛素蛋白激活，為進一步探討TLR5通路的激活在乳腺癌細胞增殖中的作用提供實驗基礎。

乳腺癌細胞系；TLR5；NLRC4

TLRs在癌癥進展中起著重要作用[1,2]。研究發(fā)現乳腺癌、宮頸癌、肺癌、前列腺癌等腫瘤細胞均有TLR的表達。TLRs的激動劑有可能促進腫瘤細胞的增殖，但是也有研究發(fā)現，不同的TLRs配體刺激TLR3、TLR4、TLR5、TLR7和TLR9，表現出不同程度的抗腫瘤效果[3-6]。鞭毛素是細菌鞭毛的重要構成組件，也是一種重要的PAMPs。鞭毛素蛋白作為TLR5和NLRC4的天然配體，激活TLR5介導的信號通路，啟動促炎基因的表達。先前的研究發(fā)現，TLR5激動劑-鞭毛素蛋白具有抑制腫瘤的功能[1,7-10]，鞭毛素蛋白和表達鞭毛蛋白的細菌在小鼠模型中表現了抗腫瘤效果[11,12]。但乳腺癌細胞系中是否存在鞭毛素蛋白的另外一個受體——NLRC4，目前尚無研究報道。不同乳腺癌細胞系包括高轉移的人乳腺癌細胞系MDA-MB-231和低轉移能力的人乳腺癌細胞系MCF-7中NLRC4受體表達情況目前并不十分清楚，本研究將探討不同乳腺癌細胞系MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-435中TLR5和NLRC4受體的表達情況，為利用鞭毛素蛋白進行抗腫瘤免疫，以及探討這兩條通路在介導鞭毛素蛋白抑制乳腺癌細胞增殖中的作用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑、儀器和細胞系 抗體TLR5-FITC(Abcam公司)；同型抗體IgG2a-FITC、DMEM 培養(yǎng)基(Gibco公司)；L-谷胺酰胺、氨芐青霉素和鏈霉素(北京索萊寶公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；0.25%胰蛋白酶(Hyclone)；人IL-8細胞因子檢測試劑盒(武漢博士德公司)。hTLR5F:TCCCTGAACTCACGAGTCTTT；hTLR5R：GGTTGTCAAGTCCGTAAAATGC。hNLRC-4F： GTGTTCTCCCACAAG-TTTG-A；hNLRC4R： AGTAACCATTCCCCTTGGTC；hGAPDH-F： GGAAGGTGAAGGTCGGAGTC；hGAP-DH-R：TCAGCCTTGACGGTGCCATG。所有引物均由上海生工合成。FACS AiriaTM流式細胞儀(BD公司)、BioRad iQ5 熒光定量PCR儀。MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-435細胞購自武漢博士德公司，Caco-2細胞、表達菌株FliC、FliC-L3A、FliCΔ90-97和FliCΔ90-97:L3A由中國科學院武漢病毒所鄢慧民研究員惠贈。

1.2.1 細胞培養(yǎng) MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-435細胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，每隔3～5 d進行傳代培養(yǎng)，待細胞進入對數生長期時，收獲細胞備用。

1.2.2 重組鞭毛素蛋白的表達和純化 方法見參考文獻[13]。

1.2.3 Real-time PCR法檢測乳腺癌細胞系TLR5和NLRC4 mRNA水平。首先，采用TRNzol總RNA提取試劑進行樣本RNA提取，實驗操作按產品說明書進行。然后，將總RNA逆轉錄成cDNA。最后，每個樣品3個復孔，實時熒光PCR反應。反應條件為：(95℃30 s，95℃ 5 s)×40 個循環(huán)，60℃ 30 s，60～95℃進行溶解曲線分析。根據CT值，結果采用2-ΔΔCT法進行數據的相對定量分析。

1.2.4 流式細胞術檢測乳腺癌細胞系胞膜和胞漿TLR5表達 胞膜TLR5的表達：用PBS洗滌不同乳腺癌細胞系，加入FcR受體阻斷劑孵育20 min后，1 500 r/min×5 min，PBS洗滌一遍，分別加入抗體TLR5-FITC和同型對照抗體孵育30 min后，1 500 r/min×5 min洗滌，用PBS重懸，用流式細胞儀進行檢測。用Flowjo軟件對結果進行分析，檢測不同乳腺癌細胞系TLR5的平均熒光強度，并用直方圖表示。

細胞膜和胞漿TLR5表達：用PBS洗滌不同乳腺癌細胞系，加入FcR受體阻斷劑孵育20 min后，PBS洗滌一遍，加入固定和破膜劑，孵育1 h后，2 000 r/min×5 min離心洗滌一次，分別加入抗體TLR5-FITC和同型對照抗體孵育30 min后，1 500 r/min×5 min洗滌后，用PBS重懸，用流式細胞儀進行檢測。用Flowjo軟件對結果進行分析，檢測不同乳腺癌細胞系TLR5的平均熒光強度，并用直方圖表示。

1.2.5 ELISA法檢測重組鞭毛素蛋白刺激MCF-7細胞后IL-8的分泌 MCF-7細胞加入96孔板，50 000個/孔，加入鞭毛素蛋白1 μg/ml，刺激12 h后收集上清，ELISA法檢測上清中IL-8濃度，方法見IL-8細胞因子檢測試劑盒。

1.3 統(tǒng)計學方法 實驗結果用GraphPad Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計處理。所得結果的比較采用One-way ANOVA和t檢驗共同分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同乳腺癌細胞系TLR5受體基因的表達 因為MDA-MB-435細胞表達TLR5和NLRC4水平很低，其他乳腺癌細胞TLR5 mRNA水平均與之相比，計算相對表達情況。結果顯示，MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-435細胞均表達TLR5受體，其中MCF-7細胞TLR5 mRNA表達水平顯著高于MDA-MB-435和MDA-MB-231細胞系(P<0.001)，約是MDA-MB-435細胞的1 700倍。MDA-MB-231細胞TLR5表達是MDA-MB-435的約200倍(圖1)。

2.2 不同乳腺癌細胞系中NLRC4受體基因的表達 熒光定量PCR結果顯示NLRC4受體在MCF-7和MDA-MB-231細胞均有相對高的表達，MCF-7細胞NLRC4的mRNA水平顯著高于MDA-MB-435和MDA-MB-231(P<0.001)，約是MDA-MB-435的11 000倍。MDA-MB-231細胞NLRC4的表達約是MDA-MB-435的2 000倍(圖2)。

“當前，名莊酒市場的最大問題是要獲得消費者的信賴?！敝屑Z酒業(yè)副總經理中糧名莊薈總經理李士祎在講話中表示，中國消費市場潛力巨大，在消費升級細分和中國進一步擴大開放進口的背景下，世界各地的名莊酒可以滿足不同的消費需求，給中國消費者提供更多的選擇空間。他建議市場各方攜手合作打造利益的共同體，共同推動名莊酒市場的健康有序發(fā)展。

2.3 MCF-7細胞TLR5受體胞漿和胞膜的表達水平 流式細胞術分析結果顯示，MCF-7細胞膜TLR5-FITC平均熒光強度為428，與同型對照相比顯著升高(P<0.01)。當加破膜固定劑之后進行胞內TLR5-FITC染色，與胞膜TLR5染色相比，MFI顯著升高(P<0.01)(圖3)，說明TLR5在MCF-7細胞膜和細胞漿均有表達。

2.4 MDA-MB-231細胞TLR5受體胞漿和胞膜的表達水平 MDA-MB-231細胞膜用TLR5-FITC染色后，平均熒光強度為189，與同型對照相(MFI為180)比沒有顯著變化(P>0.05)。當加透膜劑之后，MFI明顯升高(為420)(圖4)，說明MDA-MB-231細胞TLR5受體主要表達在其胞內。

2.5 重組鞭毛素蛋白刺激MCF-7細胞IL-8的分泌 用1 μg/ml鞭毛素蛋白刺激MCF-7細胞，12 h后收集上清檢測IL-8濃度。結果顯示，不激活TLR5的FliCΔ90-97和FliCΔ90-97：L3A均不能刺激MCF-7細胞產生IL-8，而激活TLR5通路的重組鞭毛素蛋白FliC和FliC-L3A刺激MCF-7細胞后IL-8分泌量顯著高于FliCΔ90-97和FliCΔ90-97：L3A(P<0.001)。見圖5。

圖1 不同乳腺癌細胞系中TLR5的表達Fig.1 Expression of TLR5 on different breast cancer cell lineNote: *.P<0.001.

圖2 不同乳腺癌細胞系中NLRC4的表達Fig.2 Expression of NLRC4 on different breast cancer cell lineNote: *.P<0.001.

圖3 MCF-7細胞TLR5受體胞漿和胞膜的表達水平Fig.3 Expression of TLR5 in cytoplasm and cytomember of MCF-7 breast cancer cell line

圖4 MDA-MB-231細胞TLR5受體胞漿和胞膜的表達水平Fig.4 Expression of TLR5 in cytoplasm and cytomember of MDA-MB-231 breast cancer cell line

圖5 重組鞭毛素蛋白刺激MCF-7細胞后IL-8的分泌Fig.5 Secretion of IL-8 in MCF-7 cell line after stimula-ted by recombinant flagellinNote: *.P<0.001.

3 討論

免疫細胞通過不同的模式識別受體識別不同的病原相關分子模式，這些模式識別受體包括TLRs、RLRs和NLRs等。在抗腫瘤方面，免疫細胞模式識別受體的激活有利于增強抗腫瘤免疫，清除癌細胞。另一方面，分泌的細胞因子又對腫瘤免疫微環(huán)境起到了不同的調控作用，包括炎性細胞的浸潤以及誘發(fā)多種腫瘤的發(fā)生。另外，腫瘤細胞也表達不同的模式識別受體，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，可以介導不同的配體激活相關信號通路，調節(jié)著腫瘤的增殖、侵襲和轉移。

鞭毛素蛋白有可能通過除TLR5通路外的另外一條通路NLRC4來參與介導鞭毛素蛋白的抗腫瘤效應。當NLRC4炎癥復合體激活后，能夠加工炎癥細胞因子IL-1β、IL-18、IL-33的前體，使它們成熟[14]。雖然，目前關于NLRC4通路與腫瘤關系的研究還較少，尚無明確的結論。但研究發(fā)現，在一些腫瘤類型中IL-1β和炎癥小體上調，IL-1β和炎癥小體在抗腫瘤免疫和誘導致瘤方面可能存在相反的效果。IL-1β通過刺激抗腫瘤免疫消除惡性細胞并增強化療效果。Chen等[15]發(fā)現，腫瘤炎癥小體來源的IL-1β可募集粒細胞，提高EB病毒引起的鼻咽癌無局部復發(fā)存活率。因此，NLRC4通路的激活可能與腫瘤的進展、預后有關。

本研究發(fā)現，不同乳腺癌細胞系都表達TLR5和NLRC4受體，但是表達部位和表達水平存在差異。MCF-7細胞TLR5mRNA表達最多，表達水平約是MDA-MB-435細胞的1 700倍，MDA-MB-231細胞TLR5表達是MDA-MB-435的約200倍。TLR5受體在MCF-7細胞漿和胞膜上均有表達，而MDA-MB-231細胞只在胞漿中表達[7]。提示鞭毛素蛋白不直接抑制MDA-MB-231細胞，可能需要加入轉染試劑使其進胞膜后才能夠激活TLR5通路而發(fā)揮作用。MCF-7細胞漿和胞膜除了表達TLR5受體，也表達高水平的NLRC4，說明鞭毛素蛋白有可能通過激活NLRC4而發(fā)揮抑制效果。有文獻報道，TLR5在介導鞭毛素抑制MCF-7細胞增殖的作用，并沒有考慮NLRC4通路。因此，本研究提示，需要綜合考慮兩條通路所介導的鞭毛素蛋白抗腫瘤效果。本研究利用分別激活TLR5和NLRC4的重組鞭毛素蛋白刺激MCF-7細胞，發(fā)現只有激活TLR5通路的MCF-7細胞能夠分泌IL-8，這說明IL-8的分泌依賴于TLR5通路的激活。表達在乳腺癌細胞系表面的TLR5受體可以被鞭毛素蛋白激活，也進一步證明了TLR5受體位于MCF-7細胞膜上，為我們深入探討TLR5通路的激活在乳腺癌細胞增殖中的作用提供實驗基礎。文獻報道，IL-8能夠抑制MCF-7細胞的凋亡[16]。而且乳腺癌患者IL-8的上調與較差預后相關[17,18]。提示在探討鞭毛素的抗腫瘤效果時，必須考慮其對乳腺癌細胞直接刺激后細胞因子分泌可能影響其抗腫瘤的效果。另一方面，鞭毛素蛋白通過TLR5通路刺激免疫細胞的激活，可能促進機體的抗腫瘤效應。

本研究提示，大部分乳腺癌細胞系表達TLR5和NLRC4受體，TLR5受體分布于乳腺癌細胞系的胞膜或者胞漿，位于胞膜的TLR5受體可以被鞭毛素蛋白激活而分泌炎癥因子IL-8。這兩種受體的激活在介導鞭毛素蛋白的抗腫瘤方面具有哪些作用，是促進乳腺癌增殖，還是抑制乳腺癌細胞增殖，促進其凋亡，需要進一步實驗探討。本研究為進一步探討乳腺癌細胞中TLR5和NLRC4通路的激活在腫瘤增殖中的作用提供實驗依據。

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[收稿2016-04-12 修回2016-06-01]

(編輯 張曉舟)

Expression and location of TLR5 and NLRC4 in different breast cancer cell lines

LI Wei,ZHUO Zhao-Zhen,LUO Shu-Lin,REN Ling-Yan,CHEN Kun,LIU Shui-He,YUAN Jun.

Central Laboratory of Guizhou Provincial People′s Hospital,Guiyang 550002,China

Objective:To explore the expression and location of TLR5 and NLRC4 on different breast cancer cell lines MDA-MB-231,MCF-7 and MDA-MB-435 and TLR5 activation in breast cancer cell line by recombinant flagellin .Methods:The mRNA level of TLR5 and NLRC4 in MDA-MB-231,MCF-7 and MDA-MB-435 cell were detected with quantitative Real-time PCR and TLR5 expression and location in MDA-MB-231 and MCF-7 cell were detected with Flow cytometry.Induction,expression,purification and identification of recombiant flagellin,including FliC (activating both TLR5 and NLRC4),FliCΔ90-97(unable to activate TLR5),FliC-L3A (unable to activate NLRC4),FliCΔ90-97:L3A (unable to activate both TLR5 and NLRC4).1 μg/ml recombinant flagellin were used to stimulate MCF-7 cell lines,12 h later,the supernate were collected,and ELISA was performed to assess the secretion of IL-8.Results:The mRNA level of TLR5 in MCF-7 cell was 1 700 folds higher than that of MDA-MB-435.TLR5 was expressed in MCF-7 cell surface and ctyosol,while expressed only in cytosol in MDA-MB-231 cell.FliC and FliC-L3A,which were able to activate TLR5 pathway,stimualted MCF-7 cell line to secret IL-8,but FliCΔ90-97 and FliCΔ90-97:L3A did not.Conclusion:TLR5 and NLRC4 have been expressed in different breast cancer lines,but there exists difference on the expression level and location of TLR5.Expression level of TLR5 and NLRC4 in MCF-7 cell were higher than other breast cancer lines.TLR5 receptor which is expressed on the surface of breast cancer cell can be activated by flagellin,and these work also provide us experimental basis to further understand the impact of TLR5 activation on breast cancer cell proliferation.

Breast cancer cell line;TLR5;NLRC4

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.12.007

①本文受貴州省衛(wèi)計委科學技術基金(gzwjkj2015-1-020)和貴州省人民醫(yī)院博士基金(GZSYBS[2015]11號)資助。

李 偉(1983年-)，男，博士，主要從事腫瘤免疫方面的研究，E-mail:lwcy2010@yeah.net。

及指導教師：袁 軍(1970年-)，女，博士，教授，主要從事移植免疫及腫瘤免疫方面的研究，E-mail:junyuan99430@163.com。

R730

A

1000-484X(2016)12-1761-05