朱詩乒 樓雅芳 蔡宛如?

·論著·

大黃素對急性肺損傷大鼠的肺泡灌洗液中TNF-α IL-1β的影響

朱詩乒 樓雅芳 蔡宛如?

目的評價(jià)大黃有效成分大黃素對急性肺損傷（ALI）的保護(hù)作用，探討其防治急性肺損傷的作用機(jī)制。方法SD大鼠40只隨機(jī)分為四組：空白對照組、模型組、溶劑組、大黃素組，每組各10只。采用氣管內(nèi)滴注內(nèi)毒素法制備ALI大鼠模型，溶劑組腹腔注射脂肪乳，大黃素組腹腔注射的劑量為10mg/kg，在造模前24h，造模，造模后24h內(nèi)行腹腔注射給藥，空白對照組不作任何處理。在造模后48h采集標(biāo)本，并且行肺組織HE染色，進(jìn)行肺泡灌洗液中總細(xì)胞數(shù)及中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，檢測其總蛋白含量及乳酸脫氫酶，采用酶聯(lián)免疫法檢測大鼠BALF中TNF-α、IL-1β的含量。結(jié)果相比較與模型組與溶劑組，大黃素組能顯著減輕肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)水腫，肺泡壁增厚，肺泡腔破壞程度。且可以降低肺泡灌洗液中的總細(xì)胞數(shù)和TNF-α、IL-1β（P＜0.05），但其對中心粒細(xì)胞比值及總蛋白含量影響不大（P＞0.05）；另外其可以引起B(yǎng)ALF中的LDH升高（P＜0.05）。結(jié)論大黃素對急性肺損傷存在一定的治療作用，這可能與其降低肺組織中TNF-α、IL-1β等促炎因子，從而降低肺泡灌洗液中的總細(xì)胞數(shù)有關(guān)，但其可以引起肺泡灌洗液LDH的升高。

急性肺損傷 大黃素 腫瘤壞死因子-α 白介素-1β

急性肺損傷（ALI）/急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是指心源性以外的各種肺內(nèi)、外致病因素導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性呼吸衰竭。病死率達(dá)30%～70%［1-2］。作者前期實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)證實(shí)中藥大黃或其復(fù)方中藥制劑可以顯著減輕肺損傷大鼠肺泡結(jié)構(gòu)的破壞，炎癥細(xì)胞的浸潤，減輕肺泡間隔水腫出血［3-5］。大黃素是中藥大黃的主要活性成分。相關(guān)研究證明大黃素可以對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)具有明顯的抑制作用。2012年4月至8月作者通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來評價(jià)大黃素對急性肺損傷的保護(hù)作用，探討其防治急性肺損傷的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠40只，清潔級，體重（200±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)合格證號：2011A033。

1.2 藥物與試劑 脂多糖（sigma公司進(jìn)口分裝）；異氟烷（魯南貝特制藥有限公司）；炎癥因子ELISA試劑盒（美國RND公司進(jìn)口分裝）；98%分析純大黃素（上海金穗生物科技有限公司）；脂肪乳（250ml：50g大豆油，3g卵磷脂）；TNF-α、IL-1βELISA試劑盒進(jìn)口分裝（聯(lián)科生物有限公司）；Bradford 法蛋白濃度定量試劑盒（聯(lián)科生物有限公司）；LDH測定試劑盒（聯(lián)科生物有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 大鼠灌胃器、燒杯、電子天平；液態(tài)霧化吸入裝置；高速低溫離心機(jī)；酶標(biāo)儀；37℃孵育箱；-20℃冰箱；-70℃冰箱；電爐、切片機(jī)：Leica2135、自動(dòng)脫水機(jī)：Tissue-Tek Vip、自動(dòng)包埋機(jī)：Tissue-Tek Tec、顯微鏡：Olympus Bx5040。

1.4 動(dòng)物分組及模型建立 40只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分組：空白對照組、模型組、溶劑組、大黃素組，每組10只。除了空白對照組外，其余各組均進(jìn)行急性肺損傷造模。造模方法：通過液態(tài)霧化吸入裝置將異氟烷霧化，霧化麻醉SD大鼠，將老鼠頸部除毛，用碘酒擦拭消毒。在距大鼠環(huán)狀軟骨約0.5cm處作約0.3cm切口，分離氣管；將LPS配置成3mg/ml溶液，用1ml針筒吸取LPS溶液，按照1.5mg/kg劑量，緩慢注射入大鼠氣管中。然后，迅速縫合切口，再次用碘酒將切口消毒。并將大鼠左右上下?lián)u晃，讓LPS溶液均勻分布于SD大鼠肺組織中，約1～2min后，大鼠會(huì)復(fù)蘇?？瞻讓φ战M進(jìn)行生理鹽水滴注處理。

1.5 給藥方法 將大黃素溶解于脂肪乳劑中，配置成1mg/ml溶液，在造模前24h，造模，造模后24h內(nèi)行腹腔注射給藥，給藥劑量為10mg/kg。

1.6 標(biāo)本采集 在造模后48h后，腹腔注射戊巴比妥溶液麻醉大鼠（劑量為3ml/kg），采集標(biāo)本。（1）支氣管肺泡灌洗液（BALF）：打開雙側(cè)胸腔，分離氣管及肺組織，于氣管隆突上方約1cm處作一小切口后插入22號套管針，用無菌手術(shù)縫合線進(jìn)行固定，結(jié)扎左上肺主支氣管，行右側(cè)及左下側(cè)支氣管肺泡灌洗。注入生理鹽水3ml，反復(fù)抽吸3次，回收BALF約2ml左右，回收率65%～70%，將灌洗后的肺泡液搖勻，抽取10μl后稀釋3倍，在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上進(jìn)行肺泡灌洗液總細(xì)胞數(shù)的計(jì)數(shù)；將剩余BALF放入離心管中，低速離心機(jī)3000r/min離心15min，取上清液，-80℃冰箱保存；將細(xì)胞沉淀涂片，進(jìn)行瑞氏染色，進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。（2）組織：取左肺上葉分剪三段，用于HE染色。

1.7 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測及方法 （1）組織病理檢查：肺組織經(jīng)10%福爾馬林溶液固定24h后入全自動(dòng)脫水機(jī)脫水、透明、浸蠟。經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后進(jìn)行HE染色，最終經(jīng)中性樹膠封固并在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理變化。（2）BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)：①細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)：將搖勻后的肺泡細(xì)胞灌洗液吸出10μl并稀釋3倍，用計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，通過公式計(jì)算出BALF液中的細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算公式如下：細(xì)胞數(shù)/ml=四大格細(xì)胞總數(shù)×4×3÷104。②細(xì)胞分類計(jì)數(shù)：將離心后的細(xì)胞沉渣用移液槍吸出約1ml，平鋪于載玻片上，待其風(fēng)干后，進(jìn)行瑞氏染色，計(jì)算其中性粒細(xì)胞數(shù)、淋巴細(xì)胞數(shù)及單核細(xì)胞比例。（3）大鼠BALF中TNF-α、IL-1β含量：將大鼠BALF放入離心管中，低速離心機(jī)3000r/min離心15min，取上清液，-80℃冰箱保存，經(jīng)解凍后，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測大鼠BALF中TNF-α、IL-1β含量。（4）肺泡灌洗液中總蛋白含量的測定：將大鼠BALF放入離心管中，低速離心機(jī)3000r/min離心15min，取上清液，-80℃冰箱保存，經(jīng)解凍后，采用Bradford 法蛋白濃度定量試劑盒檢測大鼠BALF中總蛋白含量。（5）肺泡灌洗液中乳酸脫氫酶（LDH）的測定：將大鼠BALF放入離心管中，低速離心機(jī)3000r/min離心15min，取上清液，-80℃冰箱保存，經(jīng)解凍后，按LDH測定試劑盒說明書，取樣本10pl，加入各試劑，混勻后在37℃水浴中保溫30s，在340nm處讀取初始吸光度，同時(shí)開始記時(shí)，在精確1、2、3min時(shí)，分別讀取吸光度，確定每分鐘平均吸光度變化（△A/ min），計(jì)算樣本中LDH的活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，正態(tài)分布數(shù)據(jù)用One-way ANOVA檢驗(yàn)，予以方差齊性檢驗(yàn)，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，使用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色鏡下觀察 （1）空白組：未見明顯改變，肺泡結(jié)構(gòu)多數(shù)保持完整，肺泡壁無水腫，肺間質(zhì)少見炎性細(xì)胞浸潤。（2）模型組：肺間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)少量炎性細(xì)胞，肺間質(zhì)水腫，肺泡間隔增寬，肺泡腔結(jié)構(gòu)破壞、融合，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)炎性出血。（3）溶劑組：肺間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)少量炎性細(xì)胞，肺間質(zhì)水腫，肺泡間隔增寬，肺泡腔結(jié)構(gòu)破壞、融合，肺泡腔及肺間質(zhì)內(nèi)炎性出血。與模型組相似。（4）大黃素干預(yù)組：肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)水腫，肺泡壁增厚，肺泡腔破壞程度均比模型組有所減輕，各組間比較不明顯（見圖1）。

圖1 肺組織HE染色鏡下觀察

2.2 各組大鼠BALF總細(xì)胞數(shù)、N、總蛋白含量、IL-1β、TNF-α、LDH的比較 見表1。

表1 各組大鼠BALF中總細(xì)胞數(shù)比較（x±s）

3 討論

ALI是以大量彌漫性炎癥細(xì)胞肺內(nèi)浸潤、肺微血管通透性增加、肺泡和肺實(shí)質(zhì)內(nèi)高度水腫及低氧血癥為特征的常見臨床綜合征。ALI的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，迄今尚未完全闡明，隨著失控的炎癥反應(yīng)引起多臟器功能障礙綜合征理論的出現(xiàn)，使人們對ALI的發(fā)病機(jī)制轉(zhuǎn)向?qū)ρ装Y損傷的認(rèn)識。細(xì)胞因子是有機(jī)體產(chǎn)生的小分子可溶性的蛋白質(zhì)，能夠影響機(jī)體細(xì)胞的行為和特征?？煞譃榇傺滓蜃雍涂寡滓蜃?，其中TNF-α和IL-1β是炎癥損傷中比較常見的促炎因子。

ALI/ARDS中，復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)和其他促炎化合物發(fā)動(dòng)并增強(qiáng)了炎癥反應(yīng)，過激的炎癥反應(yīng)給機(jī)體帶來了不可避免的損傷［6］。其中以TNF-α和IL-1β為著。TNF-α在創(chuàng)傷后炎癥中是一具始動(dòng)和關(guān)鍵性作用的促炎免疫分子，其能聚集激活中性粒細(xì)胞（PMN），導(dǎo)致呼吸爆發(fā)加劇肺損傷，其主要通過肺泡細(xì)胞的溶解，炎癥細(xì)胞在肺內(nèi)遷移以及血管內(nèi)皮損傷等多種途徑引起肺損傷［7-9］。而IL-1β與其具有協(xié)同作用，其共同作用在炎癥早期就能引起肺泡細(xì)胞的破壞，炎癥細(xì)胞在肺泡內(nèi)的募集，從而加重肺泡蛋白滲出，肺實(shí)質(zhì)的水腫，引起呼吸膜的增厚，另外激活的PMN釋放大量氧自由基［10］，直接損傷肺泡上皮及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致肺毛細(xì)血管破壞，肺泡上皮細(xì)胞變性壞死，毛細(xì)血管滲漏，血漿及纖維蛋白及肺泡組織內(nèi)的乳酸脫氫酶（LDH）從毛細(xì)血管滲出至肺泡，促成ALI的發(fā)生。

前期的研究證實(shí)大黃及其中藥復(fù)方（如芪冬活血飲）可以顯著減輕肺損傷大鼠肺泡結(jié)構(gòu)的破壞，炎癥細(xì)胞的浸潤，減輕肺泡間隔水腫出血。其保護(hù)機(jī)制與減少前炎癥因子TNF-α的分泌，增加抗炎因子IL-10分泌，調(diào)節(jié)抗炎和促炎因子之間的平衡；減少M(fèi)DA含量、增加SOD含量，具有抗氧化作用有關(guān)［3-5］。但其具體中藥單體的結(jié)果作用尚不明確，大黃素是大黃有效成分中最重要的單體。既往研究認(rèn)為，大黃素對抗炎、抗腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移、抑制肝臟和腎臟纖維化等均有較強(qiáng)的藥理作用。研究［11-12］報(bào)道，大黃素對胰腺炎的治療作用是多層面的，除通過誘導(dǎo)胰腺腺胞細(xì)胞凋亡、減輕胰腺局部病損作用外，可能還具有誘導(dǎo)PMN凋亡，而發(fā)揮其治療胰腺炎作用。通過誘導(dǎo)PMN凋亡，減少PMN在多種組織器官內(nèi)的積聚，對于預(yù)防或減輕胰腺炎并發(fā)SIRS、MODS具有深遠(yuǎn)意義。

在本資料中，大黃素可以有效降低BALF中總細(xì)胞數(shù)的含量。另外，其對BALF中中性粒細(xì)胞比值及肺泡總蛋白量中均有降低作用，表明其可以有效的減少炎癥細(xì)胞的募集和肺泡滲出，這主要反映在組織病理學(xué)上，可以看到蒿本內(nèi)酯組大鼠的肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)水腫，肺泡壁增厚，肺泡腔破壞程度得到改善。作者認(rèn)為，與其能有效降低BALF的促炎因子（TNF-α和IL-1β）有關(guān)。相比較與溶劑組，大黃素可以降低BALF中總細(xì)胞數(shù)的含量，但其不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），這可能和單體的濃度相關(guān)，如增加單體的給藥濃度，可能所有組別的均值將會(huì)下降，且在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在差異。另外大黃素在BALF中中性粒細(xì)胞比值上雖然無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但其均值仍較溶劑組低，在肺泡灌洗液的蛋白含量中也是如此。在BALF的促炎因子中，大黃素?zé)o論是對TNF-α，還是IL-1β均存在降低的作用（P＜0.05）；另外，大黃素組可以引起肺泡灌洗液中LDH的升高，且較溶劑組還要高，這一點(diǎn)需要引起關(guān)注。因此，大黃素可以通過降低肺泡灌洗液中的總細(xì)胞數(shù)及TNF-α和IL-1β來治療急性肺損傷，但其能引起LDH的顯著升高。

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ObjectiveIn this study，to explore the rapeutic effect of the Angelica monomer “Emodin”in acute lung injury by animal experiments.Methods40 SD rats were randomly divided into seven groups：control group，model group，solvent group，and Emodin groups.Each group have 10 rats.ALI rat model prepared by Using intratracheal instillation of LPS，the solvent group by intraperitoneal injection of fat emulsion，the monomer groups by intraperitoneal injection of dose 10mg/kg in 24 hours before modeling，modeling，and 24 hours after modeling. Nothing was given in blank control group.Samples were collected 48 hours after modeling，then do lung tissue H & E staining，count the total number of cells and the rato of neutrophil in the bronchoalveolar lavage fl uid. Detect of the total protein content and lactate dehydrogenase，the enzyme-linked immunosorbent assay in BALF and various tissues of TNF-α，IL-1βcontent in BALF are also assay by ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）.ResultsCompared with the model group and the solvent group，Emodin signifi cantly reduced the infi ltration of pulmonary interstitial infl ammatory cell，edema of interstitial pulmonary，also the thickening of alveolar wall，the alveolar damage. and the total number of cells，TNF-α，IL-1βin bronchoalveolar lavage fl uid（P＜0.05）.But neutrophil ratio and total protein content not affected（P＞0.05）；In addition，it can cause the BALF LDH increased（P＜0.05）.ConclusionThe therapeutic effect of Emodin in acute lung injury may relate its decreasing important pro-infl ammatory cytokines in lung tissue like TNF-α and IL-1βwhich reduce the total number of cells in BALF. But it can cause elevated LDH in BALF.

Acute lung injury Ligustilide Tumor necrosis factor-α Interleukin-1β

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012ZGG002）

310007 杭州市中醫(yī)院呼吸科（朱詩乒 樓雅芳）310005 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院（蔡宛如）

*通信作者