黃睿

(阿壩師范學(xué)院，四川 阿壩 624000)

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一個(gè)長度為393 bp的基因克隆

黃睿

(阿壩師范學(xué)院，四川 阿壩 624000)

本研究以蘆薈為質(zhì)料,從構(gòu)建的cDNA文庫中隨機(jī)遴選出一個(gè)克隆,提取質(zhì)粒后對其目的基因進(jìn)行測序分析。結(jié)果表明該基因長度為393 bp,共含有3個(gè)開放閱讀框，其中DNA的編碼鏈含有1個(gè)，DNA的模板鏈含有2個(gè)。

蘆薈; 基因克隆; cDNA文庫; 開放閱讀框

1 前言

1.1 蘆薈概述

蘆薈屬于百合科的一種草本植物，主要分布于非洲地帶，它是多年生百合科肉質(zhì)草本植物。其含有較為豐富的維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、活性酶以及對人身體非常有益的大量微量元素。它的主要成分是蘆薈蒽醌等，因蘆薈含有多種生物活性物質(zhì)，在中國民間就被當(dāng)作美容、護(hù)理頭發(fā)和治療皮膚疾病的天然藥物，蘆薈葉成簇狀生長，呈座狀或生于莖頂，葉常披針形或葉短又寬，邊緣有尖齒狀刺?；ㄐ虺尸F(xiàn)傘形、總狀、穗狀、圓錐形等，色呈紅、黃或具血色斑點(diǎn)，花瓣六片、雌蕊六枚。花被基部多連合成筒狀。根據(jù)近年來專家對蘆薈的生物學(xué)功效的研究結(jié)果，其主要功效包括：治愈炎癥;提高免疫力;增強(qiáng)胃腸功能，治療胃潰瘍;治療糖尿病;杭癌活性;杭微生物特性以及治療皮膚被輻射受傷，調(diào)節(jié)激素平衡等。此外還報(bào)道了蘆薈對患者可能存在一定的過敏性反應(yīng)[1]。

1.2 蘆薈分子生物學(xué)研究進(jìn)展

蘆薈在醫(yī)學(xué)治療、保健、美容、食用、觀賞等方面有一定的功效,近幾年來對蘆薈外用品的開發(fā)研究,倍受喜歡,應(yīng)用范圍日趨擴(kuò)大,成為全世界關(guān)注的藥食多用植物[2]。人們對蘆薈有關(guān)活性物質(zhì)成分的功能機(jī)制和結(jié)構(gòu)鑒定的研究將不斷深入,蘆薈的有效成分、生物活性物質(zhì)成分、藥用價(jià)值將不斷被發(fā)現(xiàn)和利用。因而蘆薈在臨床方面的應(yīng)用及其保健功能性食品的研制將取得許多新進(jìn)展.蘆薈產(chǎn)業(yè)的開發(fā)和進(jìn)一步的研究，對拓展綠色產(chǎn)品市場、發(fā)展生態(tài)經(jīng)濟(jì)、提高廣大人民的身體健康和生活質(zhì)量具有極其重要的意義。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

從蘆薈全長cDNA質(zhì)粒文庫中隨機(jī)遴選的一個(gè)克隆。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 質(zhì)粒提取

采用柱式質(zhì)粒小樣抽提試劑盒，試劑盒采用常規(guī)的堿裂解法裂解細(xì)胞，經(jīng)沉淀，離心除去基因組DNA、蛋白質(zhì)和RNA，經(jīng)吸附柱選擇性地吸附DNA，再通過簡單的洗滌步驟除去非特異性結(jié)合的雜質(zhì)，洗脫得到純度較高的質(zhì)粒[3]。按如下方法進(jìn)行：

(1)準(zhǔn)備工作

自備試劑：無水乙醇等。

A.試劑盒初次開啟，取1 ml Solution I至標(biāo)有RNase A的離心管中，吸打混勻后將其全部都加入Solution I中，混勻后在瓶身做好標(biāo)記。儲(chǔ)存于2-8°C。

B.Solution II和Solution III在低溫下可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，使用之前需要檢查，如果有沉淀，請?jiān)?7°C溫度下溶解沉淀，待冷卻至室溫后再使用。

C.按照瓶身標(biāo)簽上的說明在Wash Solution中加入4倍體積的無水乙醇，混和均勻后在瓶身做上標(biāo)記。于室溫條件下密封保存。切記每次使用結(jié)束后將瓶蓋蓋緊，減少Wash Solution中的乙醇的揮發(fā)。

D.提前將水浴鍋調(diào)至60°C備用。

(2)標(biāo)準(zhǔn)抽提步驟

A.在含合適抗生素培養(yǎng)基中接種目標(biāo)菌株，于37°C搖床充分振蕩培養(yǎng)12-16 h。

B.在菌體沉淀中加入250 μl Solution I，吸打或振蕩至徹底懸浮菌體。

C.加入250 μl Solution II，立即溫和顛倒離心管5-10次混勻，室溫靜置2-4min。

D.加入350 μl Solution III，立即溫和顛倒離心管5-10次以充分混勻。12,000 rpm 離心10 min。

E.將上清全部小心移入吸附柱，8,000 rpm 離心30 sec。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。

F.向吸附柱中加入500 μl Wash Solution，10,000 rpm 離心1 min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。重復(fù)步驟F一次。

G.將空吸附柱和收集管放入離心機(jī)，12,000 rpm 離心2 min。

H.將吸附柱放入潔凈的1.5 ml離心管中，在吸附膜中央加入30 μl ElutionBuffer，室溫靜置2 min，10,000 rpm 離心1 min，將所得到的質(zhì)粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2 電泳分析

A.制備瓊脂糖凝膠

稱取1g的瓊脂糖粉，放入錐形瓶中，加入100ml×TAE電泳緩沖液，放置微波爐或水浴內(nèi)加熱熔化，取出搖勻即為1%的瓊脂糖凝膠液。待凝膠液冷卻至60℃后加入溴化乙錠5ul，使其終濃度為0.5ul/ml。

B.膠板的制備

在制膠槽內(nèi)插入樣品梳，將瓊脂凝膠液倒入制膠槽中。待膠凝固后，取出梳子，將內(nèi)槽放入電泳槽內(nèi)。加入1×TAE電影緩沖液至電泳槽中，使其沒過凝膠表面1～2mm。

C.加樣

用移液器將之力DNA3ul與6×上樣緩沖液1ul混勻后加入加樣孔，記錄點(diǎn)樣順序。

D.電泳

接通電泳槽與電泳儀之間的電源，調(diào)節(jié)電壓值5V/cm，開始電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿1～2cm處，停止電泳。

E.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察

利用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶[4]。

2.2.3 測序及序列分析

由上海歐弗生物科技有限公司完成，序列分析用DNAMAN6.0軟件，開放閱讀框分析用ORFfinder軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)。

3 結(jié)果與分析

3.1 質(zhì)粒提取

提取出了所需的質(zhì)粒DNA。

3.2 電泳分析

電泳結(jié)果顯示，與核酸標(biāo)準(zhǔn)分子量參照物相比，在約4.7 kb位置有一目標(biāo)條帶，表明我們的質(zhì)粒DNA提取成功。

3.3 測序及序列分析

3.3.1 測序結(jié)果

測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件分析，結(jié)果如圖1所示。此序列長度為393個(gè)氨基酸。組成：105個(gè)腺嘌呤，76個(gè)胞嘧啶，94個(gè)鳥嘌呤，118個(gè)胸腺嘧啶，沒有其他的。成分：26.7%的腺嘌呤，19.3%的胞嘧啶，23。9%的鳥嘌呤，30.0%的胸腺嘧啶，沒有其他的。分子重量(kDa)：單鏈重121.63kDa，雙鏈重242.26kDa。

圖1 基因序列及堿基組成

3.3.2 開放閱讀框分析

結(jié)果如圖2所示。共含3個(gè)開放閱讀框，基中兩個(gè)來自負(fù)鏈，一個(gè)來自正鏈。

圖2 克隆基因的開放閱讀框分析

3.3.3 可能的開放閱讀框組成

因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)所測的為DNA編碼鏈，所以只可能是編號為正的那個(gè)開放閱讀框。其詳細(xì)分析結(jié)果如圖3所示。開放閱讀框區(qū)域?yàn)榭寺∑蔚牡?2到116個(gè)堿基區(qū)域，編碼34個(gè)氨基酸

開放閱讀框堿基的組成及其編碼多肽的氨基酸序列：

12 甲硫氨酸 谷氨酸 谷氨酸 谷氨酸 甲硫氨酸 精氨酸 精氨酸 賴氨酸 谷氨酰胺 精氨酸 谷氨酰胺 精氨酸 谷氨酰胺 谷氨酰胺 谷氨酸

57 丙氨酸 酪氨酸 谷氨酸 谷氨酸 谷氨酸 天冬氨酸 天冬氨酸 谷氨酸 脯氨酸 蘇氨酸 脯氨酸 丙氨酸 甘氨酸 纈氨酸 谷氨酰胺

102 半胱氨酸 丙氨酸 谷氨酰胺 谷氨酰胺 116

圖3 +1開放閱讀框堿基組成及其編碼多肽的氨基酸序列

4 討論

此克隆基因編碼的氨基酸有20種，其中含有8種人體不能合成的、必須通過食物供給的如賴氨酸：色氨酸：苯丙氨酸：蛋氨酸(甲硫氨酸)；蘇氨酸：異亮氨酸：亮氨酸：纈氨酸,所以蘆薈有很好的營養(yǎng)價(jià)值.此克隆基因編碼的氨基酸種精氨酸占得比例大,而精氨酸與脫氧膽酸制成的復(fù)合制劑(明諾芬)是主治梅毒、病毒性黃疸等病的有效藥物。并且組氨酸可作為生化試劑和藥劑，還可用于治療心臟病，貧血，風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等的藥物,所以蘆薈還有很好的藥用價(jià)值.據(jù)測定,以干物質(zhì)計(jì)算,在蘆薈葉片中蛋白質(zhì)含量約為9.5%左右.經(jīng)水解后可產(chǎn)生19種氨基酸[5],而蘆薈葉汁中的各種氨基酸含量的組成卻比較平衡,因此蘆薈被人們譽(yù)為21世紀(jì)最有希望的保健食品[6]。此克隆基因的開放閱讀框中起始密碼子中有atg兩個(gè)而終止密碼子有tag一個(gè)，其中-3開放閱讀框編碼的氨基酸最多有129個(gè)。

[1] 常秀蓮，馮詠梅，叢麗華，田康明，張華.蘆薈的生物學(xué)功效研究新進(jìn)展[J].食品科技，2007,5(4)：10-13.

[2] 孫振紅，魏凱，朱瑞良.蘆薈的功效及其在畜禽業(yè)的開發(fā)潛能[J].中國家禽，20016,21(8)：50-52.

[3] 李天東，羅英，李俊剛.蘆薈多糖生物活性研究進(jìn)展[J].綿陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，2(4)：11-55.

[4] 舒群芳，張明等.植物基因克隆的方法和策略[J].植物學(xué)通報(bào)，1999，16(1)：80-85.

[5] 田芳，牟善峰.亞鐵氰化鉀修飾鉑電極測組氨酸[J].中北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010,5(3)：499-503.

[6] 侯冬巖，回瑞華，李鐵純.蘆薈的研究進(jìn)展[J].鞍山師范學(xué)院學(xué)報(bào),2002,6(3)：54-59.

黃睿(1990.04-)，女，四川阿壩人，阿壩師范學(xué)院，研究方向：中學(xué)生物課堂教學(xué)、教研。

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1671-1602(2016)22-0199-02