王 強,王 娟,張慧君,李 寧,唐亞萍,王柏柯, 楊生保,楊 濤,帕提古麗,余慶輝*
(1 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所/新疆園藝作物生物技術(shù)與分子育種重點實驗室,烏魯木齊830091;2 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所,烏魯木齊830091;3 淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,安徽淮北235000)
番茄幼苗鹽脅迫響應(yīng)蛋白質(zhì)組分析
王 強1,王 娟2,張慧君3,李 寧1,唐亞萍1,王柏柯1, 楊生保1,楊 濤1,帕提古麗1,余慶輝1*
(1 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所/新疆園藝作物生物技術(shù)與分子育種重點實驗室,烏魯木齊830091;2 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所,烏魯木齊830091;3 淮北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,安徽淮北235000)
采用營養(yǎng)液栽培,以鹽敏感型番茄品種M82為試材,利用雙向電泳(2-DE)研究鹽脅迫處理下幼苗葉片蛋白質(zhì)的表達(dá)譜,并采用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF-MS)技術(shù)進(jìn)行差異蛋白質(zhì)的分離及質(zhì)譜鑒定。結(jié)果表明:(1)鹽脅迫處理下,利用2-DE獲得差異顯著蛋白點20個,其中17個蛋白質(zhì)點豐度上調(diào)表達(dá),3個蛋白質(zhì)點豐度下調(diào)表達(dá)。(2)通過質(zhì)譜分析和蛋白質(zhì)NCBInr數(shù)據(jù)庫檢索,共鑒定出19個差異蛋白,分別為果糖-二磷酸醛縮酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶等及3個功能未知蛋白;這些鑒定出的差異蛋白質(zhì)與能量代謝、光合作用、蛋白合成、氧化還原平衡等過程相關(guān),暗示所分離鑒定的蛋白可能參與了番茄的鹽脅迫響應(yīng),為進(jìn)一步研究番茄抗逆機制奠定基礎(chǔ)。
番茄;鹽脅迫;蛋白質(zhì)組;基質(zhì)輔助激光解析飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜
蛋白質(zhì)作為重要的生命大分子,在參與及調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用,植物適應(yīng)逆境環(huán)境的過程中伴隨著蛋白質(zhì)組分的明顯改變[1-2]。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)成功用于植物對逆境脅迫應(yīng)答的研究,為新的抗逆基因(或蛋白)的鑒定開辟了方向,基于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究對于揭示蛋白質(zhì)與脅迫響應(yīng)之間的關(guān)系具有重要意義。目前關(guān)于番茄鹽脅迫逆境的研究大多集中在生長發(fā)育、生理生化、基因調(diào)控和轉(zhuǎn)錄表達(dá)等方面對非生物脅迫響應(yīng)機制的研究[3-4]。但是從蛋白質(zhì)組學(xué)水平進(jìn)行番茄鹽脅迫條件下蛋白質(zhì)表達(dá)變化的研究較少。作者前期通過對試驗條件的摸索,已經(jīng)建立了一套適于番茄葉片蛋白質(zhì)的雙向電泳體系[5]。利用這一體系,通過對番茄葉片蛋白進(jìn)行雙向電泳分析,獲得鹽脅迫下番茄蛋白質(zhì)差異表達(dá)譜,分析番茄幼苗葉片的蛋白質(zhì)差異表達(dá),結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF-MS)和數(shù)據(jù)庫搜索鑒定這些特異差異表達(dá)蛋白,推測其在植物鹽脅迫過程中的功能,從蛋白質(zhì)水平探討番茄幼苗對鹽脅迫的響應(yīng)機制。
1.1 材 料
以番茄品種M82為供試材料,于2014年4月種植于新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院安寧渠綜合試驗基地,幼苗4片真葉時處理。對照(CK),正常營養(yǎng)液水培;鹽脅迫處理,在正常營養(yǎng)液中直接添加分析純NaCl使?fàn)I養(yǎng)液中的NaCl濃度達(dá)到200 mmol/L;每個處理10株幼苗,重復(fù)3次。處理24 h后選取待測材料同一部位的葉片,每處理和對照分別設(shè)置3次重復(fù),進(jìn)行蛋白含量測定及雙向電泳凝膠分析。
1.2 方 法
1.2.1 蛋白質(zhì)的提取 蛋白質(zhì)提取采用改良的三氯乙酸/丙酮沉淀法參照Gallardo等[6]并略作修改;采用Bradford[7]的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量;雙向電泳時蛋白質(zhì)上樣量為100 mg,使用18 cm pH 4~7 IPG膠條,參照Bio-Rad膠條使用說明書設(shè)置等電聚焦程序,每根18 cm膠條限制電流為50 μA,上樣總體積為500 μL,凝膠染色方法采用改良的考馬斯亮藍(lán)染色法[8]。
1.2.2 圖像與數(shù)據(jù)分析 采用GE Healthcare凝膠掃描儀對凝膠進(jìn)行圖像掃描,凝膠圖像用PDQuest8.0軟件進(jìn)行蛋白點檢測及圖像分析,獲得凝膠之間蛋白質(zhì)點匹配信息及相對表達(dá)量信息。表達(dá)量變化達(dá)到3.0倍以上且差異顯著(P< 0.05)的點被認(rèn)為是差異表達(dá)蛋白點。
1.2.3 蛋白質(zhì)酶解與質(zhì)譜鑒定 在膠上切取差異蛋白點,用MilliQ水清洗3次,50 μL碳酸氫銨(100 mmol/L NH4HCO3)進(jìn)行脫色,用50 μL MilliQ水處理5 min。加入50 μL含50%乙腈的水溶液處理5 min,棄去多余溶液,加入100%乙腈處理5 min。加入5 μL含10 ng胰蛋白酶的碳酸氫銨溶液(25 mmol/L NH4HCO3),用20 μL碳酸氫銨溶液進(jìn)行覆蓋,37 ℃酶解16 h。MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜(基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜儀)分析用MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀。
1.2.4 數(shù)據(jù)搜索 合并一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù),產(chǎn)生peak list文件,利用MASCOT(http://www.Matrixscience.com)對NCBInr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)檢索,酶解過程采用的酶為胰蛋白酶,最大允許錯切位點為1,可變修飾設(shè)置為carbamidomethylation(半胱氨酸),固定修飾為oxidized(甲硫氨酸),一級質(zhì)譜容差為0.15 Da,二級質(zhì)譜為0.25 Da,MASCOT檢索P≤0.05的結(jié)果被認(rèn)為鑒定成功。
2.1 鹽脅迫下番茄幼苗差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜的分析
鹽脅迫下,番茄幼苗葉片蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜如圖1所示。其中, A圖為對照葉片的雙向電泳圖譜, B圖為鹽脅迫處理后番茄幼苗葉片的雙向電泳圖譜, 圖1,C為利用PDQuest8.0軟件,對圖1,A、B進(jìn)行差異比對蛋白圖譜。結(jié)果顯示每塊膠上大約有1 000個可重復(fù)的蛋白質(zhì)點,獲得的蛋白質(zhì)點標(biāo)記清晰、分離效果好。鹽脅迫后,有20個蛋白點的表達(dá)豐度在處理與對照間存在顯著差異表達(dá)。
2.2 鹽脅迫下番茄幼苗差異蛋白質(zhì)的豐度變化
PDQuest8.0軟件分析結(jié)果表明,一些蛋白點在鹽脅迫處理前后的表達(dá)豐度存在明顯的差異,這些變化反映了番茄葉片蛋白表達(dá)對于鹽脅迫的應(yīng)答。以蛋白質(zhì)豐度變化在3.0倍以上作為檢測閾值,進(jìn)一步確定了在鹽脅迫處理后,番茄葉片中有20個蛋白點發(fā)生了顯著差異的豐度變化(表1)。其中,豐度上調(diào)的有17個,下調(diào)的有3個。獲得對照組與鹽處理組蛋白質(zhì)表達(dá)情況,圖2箭頭所指為試驗中確定的部分差異顯著表達(dá)的蛋白質(zhì)。
2.3 鹽脅迫下番茄差異表達(dá)蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定及功能分類
為進(jìn)一步確認(rèn)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的種類和功能,對20個差異蛋白點經(jīng)挖點、酶解以及MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜鑒定,獲得了這些蛋白點的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF)和二級質(zhì)譜圖譜(MS/MSS)。并結(jié)合MASCOT軟件檢索NCBInr蛋白數(shù)據(jù)庫,20個差異蛋白點中有19個成功鑒定,蛋白質(zhì)鑒定成功率約為95%。鑒定成功的19個蛋白點均來源于番茄的相關(guān)蛋白(表2)。從表中可以看出,在成功鑒定的19個蛋白質(zhì)中,蛋白點0010和0107都為果糖-二磷酸醛縮酶,蛋白點8311和8312都被鑒定為甘油醛-3-磷酸脫氫酶,這些蛋白點在膠上的分布位置不同,但分別被鑒定為相同蛋白,有的分子量相近或等電點相近,可能是同一個家族蛋白的不同形式,也可能與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄翻譯后存在修飾有關(guān),如蛋白酶降解、糖基化和磷酸化修飾等結(jié)果造成的。這一現(xiàn)象在大豆種子[9]、大豆葉片[10]中均有報道。
對鑒定成功的19個差異蛋白點進(jìn)行生物學(xué)功能分類,有16個蛋白質(zhì)分別參與能量代謝、光合作用、轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、氧化還原平衡等代謝途徑(表2),其中,與能量代謝相關(guān)蛋白質(zhì)點最多(6個),占總差異表達(dá)蛋白質(zhì)總數(shù)的31.6%,其次是參與光合作用、轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、氧化還原平衡相關(guān)蛋白質(zhì)。有3個蛋白點0801、0904、5716有質(zhì)譜圖但經(jīng)搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫無功能,這很有可能是由于番茄的蛋白質(zhì)組序列沒有很好的注釋。
表1 鹽脅迫下番茄幼苗差異表達(dá)蛋白質(zhì)的豐度變化
注:+ 表示蛋白質(zhì)表達(dá)量上調(diào)倍數(shù),- 表示蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào)倍數(shù)
Note: +indicates the up regulated fold of protein expression, -indicates the down regulated fold of protein expression
表2 鹽脅迫下番茄幼苗差異表達(dá)蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜鑒定
本研究利用雙向凝膠電泳技術(shù)對番茄幼苗鹽脅迫下蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行分析,通過差異蛋白質(zhì)組比較、數(shù)據(jù)庫檢索后發(fā)現(xiàn),20個差異表達(dá)蛋白點中有19個被成功鑒定,這些差異蛋白質(zhì)主要參與能量代謝、光合作用、蛋白合成、氧化還原平衡等生物學(xué)過程,表明這些蛋白可能參與了番茄的鹽脅迫響應(yīng)。
3.1 能量代謝相關(guān)蛋白
已有研究表明植物受到鹽脅迫后,一些基礎(chǔ)代謝,如能量代謝受到影響,通過建立一個新的平衡以抵抗外界環(huán)境[11]。果糖-二磷酸醛縮酶在葉綠體中高效表達(dá),催化卡爾文循環(huán)中果糖-1,6-二磷酸和景天庚酮糖-1,7-二磷酸的合成反應(yīng)[12]。果糖-二磷酸醛縮酶存在于細(xì)胞質(zhì)中,參與糖酵解過程。在各種非生物脅迫的逆境條件下,Konishi等[13]報道果糖-二磷酸醛縮酶可激活糖酵解途徑,這一過程與赤霉素刺激水稻根系生長有關(guān)。也有研究表明,鹽脅迫下,甜土植物與糖酵解和碳水化合物代謝有關(guān)的果糖-二磷酸醛縮酶正經(jīng)歷氧化脅迫,能量需求增加[14-15]。本實驗結(jié)果顯示果糖-二磷酸醛縮酶(0010和0107)受到鹽脅迫刺激表達(dá)上調(diào),可能與鹽分產(chǎn)生的氧化應(yīng)激有關(guān)。
甘油醛-3-磷酸脫氫酶是糖酵解途徑中光合生物在逆境下物質(zhì)和能量代謝途徑的重要酶,不但釋放能量,在機體缺氧條件下維持生命活動,而且也直接參與很多植物對環(huán)境脅迫的適應(yīng)。本研究中甘油醛-3-磷酸脫氫酶(8311、8312)存在上調(diào)表達(dá),當(dāng)植物受到鹽堿脅迫后,甘油醛-3-磷酸脫氫酶表達(dá)量增加,說明植物細(xì)胞內(nèi)正進(jìn)行著旺盛的呼吸代謝,將糖氧化分解成丙酮酸,并釋放大量能量,用于維持植物生長發(fā)育以及抵抗外界脅迫[16-17]。
S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)參與植物的硫代謝,催化甲硫氨酸和ATP反應(yīng)生成S-腺苷甲硫氨酸(SAM),S-腺苷甲硫氨酸是植物體內(nèi)轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)的甲基供體及乙烯和多胺合成的前體[18]。作為輔助因子參與蛋白質(zhì)、多糖、核酸和脂肪酸的轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)。已有很多研究表明:乙烯[19]、多胺[20]等與植物的逆境調(diào)控都有密切關(guān)系,逆境脅迫下,這些大分子的必要甲基化修飾,可以減輕脅迫條件下的氧化損傷和氧化降解,進(jìn)而維持自身的穩(wěn)定。也有研究認(rèn)為鹽脅迫番茄懸浮細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平上SAMS的調(diào)節(jié)作用,不同的SAMS基因在鹽脅迫下的變化是不一樣的,有些受誘導(dǎo),有些受抑制[21]。本研究中,蛋白點5509被鑒定為S-腺苷甲硫氨酸合成酶,該蛋白點受到鹽脅迫的誘導(dǎo),上調(diào)作用更為顯著,可能與鹽脅迫下SAMS的誘導(dǎo)表達(dá)與植物需要更多的SAM有關(guān)。
甘氨酸脫氫酶參與植物的光呼吸,光呼吸被認(rèn)為有利于植物在脅迫條件下維持電子傳遞,因此能阻止光抑制的產(chǎn)生[22]。有人用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法也發(fā)現(xiàn)低溫脅迫促進(jìn)豌豆線粒體中甘氨酸脫氫酶P亞基的降解[23]。甘氨酸脫氫酶(7802)在鹽脅迫下被降解可能影響番茄的光呼吸,這可能是番茄對鹽脅迫敏感的一個原因。
3.2 光合作用相關(guān)蛋白
在植物光合作用中,鐵氧還原蛋白(Fd)從光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)中接受電子,再將電子傳遞到Fd:NADP+氧化還原酶,使NADP+還原,生成的還原力NADPH主要用于卡爾文循環(huán)中CO2的固定和葉綠體的其他代謝過程[24]。Fd是植物光合電子傳遞鏈中的一個關(guān)鍵傳遞體,在光合作用中與它所依賴的酶相互作用,調(diào)控著電子傳遞的方向,進(jìn)而影響植物的光合作用[25]。有研究認(rèn)為黃瓜葉片在低溫弱光下光系統(tǒng)Ⅰ鐵硫蛋白(PsaC)的抑制效應(yīng)并不引起PSⅡ損傷,而是會引起PSⅠ的失活[26-27]。目前有研究發(fā)現(xiàn)PsaC在組裝成PSⅠ的過程中需要PsaD和PsaE[28],但PsaC會在不依賴這兩者的情況下獨自丟失[29]。本實驗成功鑒定到鐵氧還原蛋白(0012)、光系統(tǒng)Ⅰ鐵硫蛋白(8005),在鹽脅迫下,番茄葉片表達(dá)量明顯提高,可能通過光合電子傳遞鏈及PSⅠ在逆境中調(diào)節(jié)光合效率。葉綠素a/b結(jié)合蛋白(2103)是一種捕光復(fù)合物,在光合作用中作為光受體捕獲或釋放激發(fā)態(tài)光能,對促進(jìn)光合作用十分重要。在本實驗中葉綠素a/b結(jié)合蛋白質(zhì)上調(diào)表達(dá),可能這個光合作用蛋白參與了番茄的鹽脅迫,在細(xì)胞遭受鹽脅迫時起應(yīng)激保護(hù)作用。
3.3 轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白
前人研究認(rèn)為FtsH類蛋白前體能夠合成與FtsH蛋白序列和功能相似的蛋白質(zhì)[30]。FtsH能夠編碼膜結(jié)合的金屬蛋白酶而調(diào)控?zé)峒さ鞍椎霓D(zhuǎn)錄,通過提高其表達(dá)量促進(jìn)環(huán)境因子應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)熱激蛋白的形成。該基因在擬南芥中響應(yīng)熱脅迫的抗性發(fā)揮了關(guān)鍵作用[31]。本研究成功鑒定到FtsH類蛋白前體(4709)、ATP依賴鋅金屬蛋白酶FtsH2(2707),在鹽脅迫下,表達(dá)量明顯提高。說明在鹽脅迫條件下FtsH類蛋白形成一種抵抗鹽脅迫的機制,ATP依賴鋅金屬蛋白酶FtsH2可能通過提高其表達(dá)量促進(jìn)鹽脅迫因子應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)熱激蛋白的形成。
3.4 蛋白合成相關(guān)蛋白
本研究還發(fā)現(xiàn)一些與蛋白合成相關(guān)的差異表達(dá)蛋白,如真核生物翻譯起始因子5A (5104)。eIF5A是公認(rèn)的維持細(xì)胞活性必不可少的翻譯起始因子,參與維持細(xì)胞活性、蛋白質(zhì)合成、mRNA凋亡、植物的衰老和DNA復(fù)制等生物學(xué)過程[32],Rausell等[33]對植物的研究表明,鹽脅迫下eIF1A能夠增強蛋白質(zhì)的翻譯能力,對細(xì)胞的生存起重要作用。宋平等[34]研究表明,e1F4A是一種依賴于RNA的ATP酶,能促使mRNA與預(yù)起始復(fù)合物結(jié)合。本研究鑒定的eIF5A受鹽脅迫的影響而上調(diào)表達(dá),暗示著鹽脅迫下,蛋白合成途徑可能受到影響,番茄幼苗通過增強蛋白質(zhì)的翻譯能力,來抵御鹽脅迫下可能受到的傷害。翻譯調(diào)控蛋白60s酸性核糖體蛋白(0014),除參與蛋白質(zhì)生物合成之外,還具有調(diào)控植物發(fā)育的功能。研究發(fā)現(xiàn),許多核糖體蛋白既具有結(jié)構(gòu)上的功能,同時又是翻譯過程中必不可少的因子[35]。
3.5 氧化還原平衡相關(guān)蛋白
通過基因表達(dá)的調(diào)節(jié),很多功能性蛋白的活性和豐度發(fā)生了改變,它們共同作用,越來越多的證據(jù)表明氧化還原平衡是連接脅迫感受和生理調(diào)節(jié)的一個橋梁[36]。二氫硫辛酰胺脫氫酶(7705)作為一種黃素蛋白氧化還原酶,屬黃素蛋白氧化還原酶家族[37],以FAD為輔基接受質(zhì)子與電子催化二硫鍵的形成。主要分布在線粒體中,參與甘氨酸代謝。吡啶核苷酸二硫化物氧化還原酶(5508),屬于吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶家族,催化依賴硫氧還蛋白NADPH的還原反應(yīng)。
除以上具有已知功能的蛋白質(zhì)外,2-DE檢測到patellin-3-like(0801),LOC101245558(0904),LOC101268540(5716)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索后發(fā)現(xiàn)為功能未知蛋白質(zhì),可能是由于蛋白質(zhì)信息在數(shù)據(jù)庫中較少等原因造成,未來可結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜和數(shù)據(jù)庫的增加等進(jìn)行進(jìn)一步功能分析,為探索番茄鹽脅迫的機理提供更多線索。另外,植物的抗鹽脅迫分子機制比較復(fù)雜,不僅包括翻譯水平還涉及轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。因此,下一步還要結(jié)合基因轉(zhuǎn)錄以及RNA轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控等方面來進(jìn)行更全面的研究。番茄在鹽脅迫條件下,能量代謝、光合作用等多個生理過程協(xié)同響應(yīng)鹽脅迫,啟動了防御反應(yīng),增強了基礎(chǔ)代謝、能量轉(zhuǎn)換、光合作用、轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、氧化還原過程以適應(yīng)環(huán)境的變化,這些綜合的變化使得番茄能夠適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境。
[1] JORRIN N J,MALDONADO A M,ECHEVARRIA Z S,etal. Plant proteomics update (2007-2008):second-generation proteomic techniques,an appropriate experimental design,and data analysis to fulfill MIAPE standards,increase plant proteome coverage and expand biological knowledge[J].Journalofproteomics,2009,72(3):285-314.
[2] KOSOVA K,VITAMVAS P,PRASIL I T,etal. Plant proteome changes under abiotic stress contribution of proteomics studies to understanding plant stress response[J].JournalofProteomics,2011,74(8):1 301-1 322.
[3] 徐佳寧,徐艷群,嚴(yán) 振,等.番茄對非生物脅迫響應(yīng)機制研究進(jìn)展[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,47(12):120-124.
XU J N,XU Y Q,YAN Z,etal. Research Progress of Tomato Responses to Abiotic Stress[J].ShandongAgriculturalSciences,2015,47(12):120-124.
[4] 王利民,黃東風(fēng),林 瓊,等.番茄作物抗鹽性研究進(jìn)展[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報,2015,30(10):1 019-1 026.
WANG L M,HUANG D F,LIN Q,etal. Recent advances in research on salt tolerance of tomato Plants[J].FujianJournalofAgriculturalSciences,2015,30(10):1 019-1 026.
[5] 王 強,王 娟,李 寧,等.適于番茄葉片蛋白質(zhì)組分析的雙向電泳優(yōu)化體系的建立[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,53(4):610-616.
WANG Q,WANG J,LI N,etal. Establishment of Two-dimensional Electrophoresis Optimization System for proteomic analysis of tomato leaves[J].XinjiangAgriculturalSciences,2016,53(4):610-616.
[6] GALLARDO K,JOB C,etal. Proteomic analysis ofArabidopsisseed germination and priming[J].PlantPhysiology, 2001,126:835-848.
[7] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding[J].AnalyticalBiochemistry,1976,72:248-254.
[8] WANG X C,LI X F,LI Y X. A modified coomassie brilliant blue staining method at nanogram sensitivity compatible with proteomic analysis[J].BiotechnolLett,2007,29:1 599-1 603.
[9] WANG L Q,MA H,SONG L R,etal. Comparative proteomics analysis reveals the mechanism of pre-harvest seed deterioration of soybean under high temperature and humidity stress[J].JournalofProteomics,2012,75(7):2 109-2 127.
[10] MA H Y,SONG L R,SHU Y J,etal. Comparative proteomic analysis of seedling leaves of different salt tolerant soybean genotypes[J].JournalofProteomics.2012,75(6):1 529-1 546.
[11] YAN S P, ZHANG Q Y, TANG Z C,etal. Comparative proteomic analysis provides new insights into chilling stress responses in rice[J].MolCellProteomics. 2006,5:484-496.
[12] TAIZ L,ZEIGER E. Plant physiology translation[M]. Beijing:Science Press. 2009.
[13] KONISHI H,KITANO H,KOMATSU S. Identification of rice root proteins regulated by gibberellin using proteome analysis[J].Plant,Cell&Environment,2005,28(3):328-339.
[14] NDIMBA BK,CLUVASA S,Simon WJ,etal. Identification of Arabidopsis salt and osmotic stress responsive using two-dimensional difference gel electresis and mass spectrometry[J].Proteomics,2005,5(16):4 185-4 196.
[15] SOBHANIAN H,AGHAEI K,KOMATSU S. Changes in the plant proteome resulting from salt stress:the creation of salt-tolerant crops[J].JournalofProteomics,2011,74(8):1 323-1 337.
[16] PLAXTON W C. The organization and regulation of plant glycolysis[J].AnnualReviewofPlantPhysiologyandPlantMolecularBiology.1996,47(1):185-214.
[17] 鄭 磊,劉關(guān)君,楊傳平,等.鹽脅迫下西伯利亞蓼蛋白質(zhì)雙向電泳分析及質(zhì)譜鑒定[J]. 哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報,2007,23(2):101-105.
ZHENG L,LIU G J,YANG CH P,etal. 2-DE analysis and mass spectrometry identification of proteins in polygumn sibiricum under salt stress[J],NaturalSciencesJournalofHarbinNormalUniversity,2007,23(2):101-105.
[18] Ma X L,WANG Z L,QI Y C,etal. Isolation of S-adenosylmethionine synthetase gene from Suaeda salsa and its differential expression under NaCl stress[J].ActaBotanicaSinicaChinese Edition, 2003,45(11):1 359-1 365.
[19] ZHANG Y, LYNCH J P,BROWN K. Ethylene and phosphorus availability have interacting yet distinct effects on root hair development[J].JournalExperimentalBotany, 2003,54(3):2 351-2 361.
[20] SHEN W,NADA K,TACHIBANA S. Involvement of polyamines in the chilling tolerance of cucumber cultivars[J].PlantPhysiology, 2000,124(3):431-439.
[21] VANBREUSEGEM F,DEKEYSER R,GIELEN J,etal. Characterization of a S-adenosylmethionine synthetase gene in rice[J].PlantPhysiol.,1994,105:1 463-1 464.
[22] WINGLER A,LEA PJ,QUICK WP,etal. Photorespiration:metabolic pathways and their role in stress protection[J].Philos.Traps.R.Soc.Lond.BBiol.Sci,2000,355,1 517-1 529.
[23] TAYLOR NL,HEAZLEWOOD JL,DAY DA,etal. Differential impact of environmental stresses on the pea mitochondrial proteome[J].Mol.Cell.Proteomics,2005,4:1 122-1 133.
[24] CECC ARELLI EA,ARAKAKI AK,CORTEZ N,etal. Functional plasticity and catalytic efficiency in plant and bacterial ferredoxin-NADP(H) reductases[J].Biochim.Biophys.Acta,2004,1698:155-165.
[25] 茍 萍,索菲婭,馬東建,等.高等植物鐵氧還蛋白的結(jié)構(gòu)與功能[J]. 生命的化學(xué),2007,27(1):51-53.
GOU P,SOPHIE,MA D J,etal. The structure and fuction of higher plant ferredoxin [J].ChemistryofLife,2007,27 (1):51-53.
[26] TERASHIMA I,F(xiàn)UNAYAMA S,SONOIKE K. The site of photo inhibition in leaves ofCucumissativusL.at low temperatures is photosystem I,not photosystem II[J].Planta,1994,193:300-306.
[27] SONOIKE K,TERASHIMA I,IWAKI M,etal. Destruction of photosystem I iron-sulfur centers in leaves ofCucumissativusL. by weak illumination at chilling temperatures[J].FEBSLett,1995,3(62):235-238.
[28] ANTONKINE M,JORDAN P,F(xiàn)ROMME P,etal. Assembly of protein subunits within the stromal ridge of photosystem I. Structural changes between unbound and sequentially PSI-bound polypeptides and correlated changes of magnetic properties of the terminal iron sulfur clusters[J].J.Mol.Biol.,2003,327:671-697.
[29] RAJAGOPAL S,JOLY D,GAUTHIER A,etal. Protective effect of active oxygen scavengers on protein degradation and photochemical function in photosystem I sub membrane fractions during light stress[J].FEBSLett,2005,272(4):892-902.
[30] LINDAHL M,TABAK S,CSEKE L,etal. Identification,characterization,and molecular cloning of a homologue of the bacterial FtsH protease in chloroplasts of higher plants[J].JournalofBiologicalChemistry,1996,271(46):29 329-29 334.
[31] CHEN J,BURKE J J,VELTEN J,etal. FtsHl l protease plays a critical role in Arabidopsis thermotolerance[J].ThePlantJournal,2006,48(1):73-84.
[32] 袁金橋,顏賢忠.真核生物翻譯起始因子5A的結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J]. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,2009,33(3):267-271.
YUAN J Q,YAN X ZH.Structure and function of eukaryotic initiation factor 5A:recent progress in research[J].BulletinoftheAcademyofMilitaryMedicalSciences,2009,33(3):267-271.
[33] RAUSELL A,KANHONOU R,YENUSH L,etal. The translation initiation factor eIF1A is an important determinant in the tolerance to NaCl stress in yeast and plants[J].ThePlantJournal,2003,34(3):257-267.
[34] 宋 平,張競男,胡咖瑞,等.食蟹猴瘧原蟲中一個真核翻譯起始因子4A (eIF4A)同源蛋白的cDNA克隆,表達(dá)和ATP酶活性測定[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,2004,20(3):294-304.
SONG P,ZHANG J N,HU J R,etal. cDNA cloning,expression and ATPase assay of a putative eIF-4A ofPlasmodiumcynomolgi[J].ChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiology,2004,20(3):294-304.
[35] 顧志敏,王建飛,黃 驥,等.水稻胞質(zhì)糖體蛋白基因OsRPS7的克隆與序列分析[J].遺傳,2004,26(2):181-185.
GU Z M,WANG J F,HUANG J,etal. Molecular cloning and sequence analyzing of cytoplasmic ribosomal protein gene OsRPS7 from rice (OryzasativaL) [J].Hereditas,2004,26(2):181-185.
[36] FOYER CH,NOCTOR G .Redox homeostasis and antioxidant signaling:A metabolic interface between stress perception and physiological responses[J].PlantCell,2005,17,1 866-1 875.
[37] MORAN J F,SU Z H,Sarath G,etal. Molecular cloning,functional characterization,and subcellular localization of soybean nodile dihydrolipoamide reductase[J].PlantPhysiology,2002,128:300-313.
(編輯:宋亞珍)
Proteome Analysis of Tomato Seedlings in Response to Salt Stress
WANG Qiang1,WANG Juan2,ZHANG Huijun3,LI Ning1,TANG Yaping1,WANG Baike1,YANG Shengbao1,YANG Tao1,Patiguli1,YU Qinghui1*
(1 Institute of Horticulture,Xinjiang Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Horticultural Biotechnology & Molecular Breeding of Xinjiang,Urumqi 830091,China;2 Institute of Economic Crops,Xinjiang Academy of Agricultural Sciences,Urumqi 830091,China;3 School of Life Science,Huaibei Normal University,Huaibei,Anhui 235000,China)
Nutrient solution culture was used to M82 tomato salt sensitive variety as experimental materials. With two-dimensional electrophoresis (2-DE), we studied the salt conditions and processing tomato seedlings under salt stress protein expression profile,and identified the differences of protein separation and mass spectrometry trough tandem time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF-MS) technology. The results showed that: (1) there were 20 protein spots presenting to express differentially after the total proteins were separated by 2-DE. The 17 proteins of all presenting spots were up-regulated,and 3 proteins were down-regulated. (2) Among the 20 protein spots,the annotations of the 19 differential expressed proteins were known by mass spectrometry and protein database retrieval,Identified differential proteins took part in fructose-bisphosphate aldolase,S-adenosyl-L-methionine synthetase,glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,etc,and three unknown functions of protein. These identified the differences of proteins involved in energy metabolism, photosynthesis,protein synthesis,redox balance and other related process,suggested that these proteins may be involved in the salt stress response of tomato,which lay a foundation for further research the mechanism to understand plant stress resistance.
tomato;salt stress;proteomics;MALDI-TOF/TOF-MS
1000-4025(2016)11-2226-07
10.7606/j.issn.1000-4025.2016.11.2226
2016-08-15;修改稿收到日期:2016-10-31
新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2014211B035);國家自然科學(xué)基金(31360482);農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(201303115)
王 強(1983-),男,碩士研究生, 副研究員,主要從事蔬菜栽培生理與逆境脅迫。E-mail:wangqiang201004@sina.com
*通信作者:余慶輝,博士研究生,研究員,主要從事加工番茄新品種選育和栽培。E-mail:yuqinghui98@sina.com
Q530;Q789
A