摘要：從牛蒡（Arctium lappa L.）根際土壤中分離到1株具有較高反硝化能力的好氧細(xì)菌YB000，對該菌株采用生理生化及分子生物學(xué)方法進(jìn)行了鑒定，并且對該菌株進(jìn)行了以提高反硝化性能為目的的紫外誘變。結(jié)果表明，分離自牛蒡根際的反硝化細(xì)菌經(jīng)鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），該菌株于距離30 W紫外燈30 cm處照射240 s可獲得具有較強脫氮能力且遺傳性狀穩(wěn)定的誘變菌株YB004和YB005，其脫氮能力分別達(dá)到93.43%、92.03%。

關(guān)鍵詞：好氧反硝化細(xì)菌；牛蒡（Arctium lappa L.）；根際土壤；篩選；鑒定；紫外誘變

中圖分類號：X172 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）13-3305-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.13.010

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展、含氮工業(yè)廢水的排放及農(nóng)業(yè)中化肥的過量施用，導(dǎo)致水體氮素含量嚴(yán)重超標(biāo)而影響水體的使用安全[1，2]。氮素超標(biāo)是導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化的重要原因之一，生物脫氮可有效去除水體中的氮元素[3]。傳統(tǒng)的生物脫氮包括硝化和反硝化兩個過程，反硝化脫氮能將硝酸鹽氮或亞硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮，從根本上解決水體中氮素超標(biāo)的問題。反硝化細(xì)菌是能夠引起反硝化作用的細(xì)菌，多為異養(yǎng)、兼性厭氧細(xì)菌[4]，但近期研究表明，一些微生物在較高的氧分壓條件下也能表現(xiàn)出反硝化能力[5-8]。好氧反硝化作用實現(xiàn)了硝化和反硝化作用的同時進(jìn)行，不僅簡化了生物脫氮流程、降低了投資成分，而且還表現(xiàn)出了傳統(tǒng)廢水處理方法所無法比擬的優(yōu)勢，如硝化過程無需加堿中和、脫氮效率高、對氨態(tài)氮耐受能力強等[9]。所以好氧反硝化作用是生物脫氮的全新途徑，好氧反硝化菌的發(fā)現(xiàn)為該途徑的充分應(yīng)用提供了可能。本研究從牛蒡（Arctium lappa L.）根際土壤分離純化出1株具有較高反硝化性能的好氧細(xì)菌，并對該菌進(jìn)行了以提高反硝化能力為目的的紫外誘變，以其獲得高效、穩(wěn)定的好氧反硝化細(xì)菌，為好氧反硝化在生物脫氮過程中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

分離自牛蒡根際。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：Taq DNA聚合酶、dNTPs、10×Amplification buffer購自生工生物工程（上海）有限公司。所用其余試劑均為分析純。

主要儀器：9700型PCR儀（Applied Biosystems公司）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad Gel Doc XR+美國伯樂）；DYCZ-40D型電泳儀（北京六一儀器廠）；HH.B11.600-S-II型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市晶玻實驗儀器廠）；7230G型可見分光光度計（上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司）；BBS-SSC型潔凈工作臺（上海京工實業(yè)有限公司）；HNY-100C型恒溫培養(yǎng)搖床（常州中誠儀器制造有限公司）；YXQ型手提式壓力蒸汽滅菌鍋（嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司）。

1.3 引物

16S rDNA引物A1序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；引物A2序列：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′，分別對應(yīng)大腸桿菌（Escherichia coli） 16S rDNA的8～27 bp和1 495～1 514 bp，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4 培養(yǎng)基

富集液體培養(yǎng)基：20%KNO3，2%MgSO4，10%K2HPO4，10%KH2PO4，50%檸檬酸鈉，pH 7.2～7.6。

富集固體培養(yǎng)基：20%KNO3，2%MgSO4，10%K2HPO4，10%KH2PO4，50%檸檬酸鈉，2%瓊脂，pH 7.2～7.6。

反硝化顯色固體培養(yǎng)基：10%葡萄糖，1%酒石酸鉀鈉，20%KNO3，2%K2HPO4，5%CaCl2，2%瓊脂，1%BTB（溴麝香草酚蘭）乙醇溶液[10]。

1.5 方法

1.5.1 牛蒡根際土壤的采集 于江蘇省徐州市豐縣牛蒡種植基地，使用五點采樣法采集牛蒡根際土壤于無菌袋中避光、低溫保存。

1.5.2 反硝化細(xì)菌的富集培養(yǎng)及分離純化 準(zhǔn)確稱取土樣1.0 g于10 mL去離子水中，并在振蕩器上充分振蕩15 s。待土樣沉淀后取1 mL上清液接種于反硝化液體培養(yǎng)基，并于30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～14 d至培養(yǎng)基渾濁。

取1 mL上述富集培養(yǎng)菌液涂布于反硝化顯色固體培養(yǎng)基，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長出菌落，取單菌落接種在富集固體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。重復(fù)上述操作，直至獲得純菌種[11，12]。

1.5.3 反硝化細(xì)菌生理生化鑒定

1）革蘭氏染色。在干凈玻片上滴1滴去離子水，用接種針挑取少量菌落涂布于水中，風(fēng)干固定。加入結(jié)晶紫混合液作用1 min，水洗。碘液染色1 min，水洗，吸干。95%乙醇溶液脫色，水流洗脫至洗脫液無色（約30 s）。用番紅液染色2～3 min，水洗、風(fēng)干。挑取生長良好的菌落進(jìn)行染色，顯微觀察多個視野。

2）鞭毛染色。挑取少許菌苔，涂布在玻片上的無菌水中，風(fēng)干固定。滴加酸化的FeCl3溶液染色10 min，沖洗后將殘水瀝干，加2%AgNO3溶液染色30～60 s，加熱，冷卻后用去離子水沖洗。顯微觀察。

3）半固體瓊脂穿刺法。用接種針穿刺接種菌液于半固體培養(yǎng)基內(nèi)，30 ℃培養(yǎng)10 d，用透射光目測其生長狀況。

4）甲基紅試驗。接種菌液在加入甲基紅試劑的培養(yǎng)基中于30 ℃培養(yǎng)2～6 d，同時以不加入甲基紅試劑的培養(yǎng)基為對照。

5）V-P試驗。接種菌液于甲基紅培養(yǎng)液中，30 ℃培養(yǎng)6 d。取培養(yǎng)液和40%NaOH等量混合，加入少量肌酸作用10 min。

6）顯色培養(yǎng)。將富集培養(yǎng)液接種于反硝化顯色培養(yǎng)基中，劃線接種反硝化菌種，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。

1.5.4 反硝化細(xì)菌特殊生理生化鑒定

1）反硝化試驗。配制反硝化培養(yǎng)基，接種反硝化菌種，封管后以不含硝酸鉀的培養(yǎng)基作為對照。培養(yǎng)1～7 d，觀察含有硝酸鉀的培養(yǎng)基中有無生長和是否產(chǎn)生氣泡，如產(chǎn)生氣泡表示有反硝化作用產(chǎn)生氮氣，是陽性反應(yīng)，不產(chǎn)生氣泡則為陰性。

2）硝酸鹽還原試驗（格利斯試驗）。在干凈的白瓷板中倒入少許培養(yǎng)1、3、5 d的菌液，再各加1滴磺胺-乙酸溶液及α-萘酚-乙酸溶液，觀察其顏色變化。

3）氮元素檢測方法[13]。α-萘胺分光光度法測定亞硝酸鹽氮；納氏試劑分光光度法測定氨氮含量；酚二磺酸分光光度法測定硝酸鹽氮。

1.5.5 分子生物學(xué)鑒定

1）菌種DNA的提取與檢測。參照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行。取2 μL DNA樣品采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2）菌種16S rDNA基因PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系ddH2O 29.7 μL，10×Amplification buffer（不含Mg2+） 5 μL，dNTPs（2 mmol/L）5 μL，Mg2+（25 mmol/L）3 μL， A1（10 μmol/L）2 μL，A2（10 μmol/L）2 μL，基因組DNA（30 ng/μL）3 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.3 μL，反應(yīng)總體積50 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)35次；72 ℃ 延伸10 min。將100 μL PCR產(chǎn)物送交生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序。

1.5.6 菌種的紫外誘變 取50 μL菌液均勻涂布于反硝化固體培養(yǎng)基中，于距離30 W紫外燈下30 cm處進(jìn)行誘變。誘變時間分別為10、20、30、40、50、60、120、240、360、480、600 s。將誘變后的平板用黑布包裹后置于30 ℃通風(fēng)干燥培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。觀察固體培養(yǎng)基中菌落生長情況，確定誘變時間范圍，計算致死率。致死率=（未誘變的再生菌落數(shù)-誘變后的再生菌落數(shù)）/未誘變的再生菌落數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)特征分析

菌種經(jīng)反復(fù)富集、分離培養(yǎng)后，接種于分離培養(yǎng)基上，其菌落形態(tài)見圖1。從圖1可以看出，菌種菌落呈圓形、白色、邊緣整齊、表面光滑濕潤。

2.2 生理生化鑒定結(jié)果

菌種為革蘭氏陰性菌，有鞭毛，有運動性，甲基紅陰性，能發(fā)酵葡萄糖，V-P反應(yīng)呈陽性，可分解利用淀粉，菌液中有過氧化氫酶存在，具有硝酸鹽還原能力。菌種生理生化特征總結(jié)見表1。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 DNA電泳檢測 取2 μL DNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，D1、D2的條帶清晰，無斷裂、拖尾現(xiàn)象，說明提取的DNA較完整，可用其進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗。

2.3.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果見圖3。由圖3可以看出，該試驗菌采用引物A1、A2進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增，得到約 1 500 bp的片段，條帶單一，沒有其他雜帶，可用于測序。

在Genbank上查找其同源序列發(fā)現(xiàn)，該序列與銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CGL-2（登錄號EU147006）相似度達(dá)95.8%。

2.4 高脫氮性能菌株的紫外誘變篩選

2.4.1 紫外誘變時間的確定 將分離純化出的原始好氧反硝化菌株命名為YB000，將經(jīng)不同劑量的紫外線誘變處理后的YB000菌株單孢子菌懸液分別涂布于固體培養(yǎng)基平板上，每批單孢子菌懸液涂布3只平板。平板培養(yǎng)后計數(shù)存活菌落數(shù)，以不經(jīng)誘變的平板菌落數(shù)為對照，計算誘變致死率，結(jié)果見表2。從表2可以看出，隨著紫外線處理時間的延長，菌體的致死率隨之上升，照射360 s時達(dá)到81.7%，到600 s時達(dá)到100%。研究表明，致死率在80%左右的突變一般為正突變[15]，因此，本研究選用的誘變時間為360 s。

2.4.2 高脫氮性能菌株的篩選 菌株經(jīng)紫外誘變后，獲得6株生長較快的誘變菌株。對原始菌株（YB000）及誘變菌株（YB001-YB006）進(jìn)行液體搖瓶發(fā)酵（100 mL培養(yǎng)液/250 mL三角瓶），每天測定發(fā)酵液中硝酸鹽氮含量以確定菌株的脫氮能力，測定結(jié)果如表3所示。由表3可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，培養(yǎng)液中硝酸鹽氮的含量逐漸降低，后期逐漸趨于平緩。誘變菌株中YB003菌株、YB004菌株、YB005菌株脫氮能力較強，脫氮率分別達(dá)到80.72%、92.23%、91.81%。

2.4.3 菌株遺傳穩(wěn)定性檢測 對經(jīng)過誘變后獲得的突變菌株YB003、YB004和YB005利用群體傳代法進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析。發(fā)現(xiàn)YB004和YB005菌株的脫氮性能和遺傳特征穩(wěn)定，YB003菌株傳至第三代時，其脫氮性能顯著下降，說明YB003菌株遺傳性狀不穩(wěn)定。故選擇YB004和YB005菌株為高效脫氮誘變菌株。

2.4.4 誘變菌株與原始菌株脫氮能力的比較 對原始菌株YB000和誘變菌株YB004、YB005進(jìn)行脫氮能力比較，發(fā)現(xiàn)在相同培養(yǎng)條件下原始菌株的脫氮能力為63.78%，而YB004和YB005脫氮能力分別達(dá)到93.43%、92.03%，顯著高于原始菌株。說明經(jīng)紫外誘變選育獲得的誘變菌株的脫氮能力得到了較大幅度的提高。

3 小結(jié)與討論

1）物理誘變中紫外線誘變操作簡便，誘變時間易于控制，且作用相對溫和，因而是誘變育種的首選方式之一。本試驗結(jié)果也進(jìn)一步證實了紫外誘變這一優(yōu)勢。誘變后的黑暗處理必不可少，可防止發(fā)生光復(fù)活效應(yīng)。有報道稱，致死率在80%左右發(fā)生正向突變概率高[15]，也有報道表明致死率在90%～99%誘變效果好[16]。本試驗結(jié)果表明，致死率在80%左右獲得的反硝化細(xì)菌誘變株反硝化性能較好，主要由于反硝化細(xì)菌反應(yīng)活性及生長速度易受到外界條件的影響，在高致死率下菌種很難生長，因此在紫外誘變中，正向突變可能較多地出現(xiàn)在偏低劑量中。

2）具有反硝化功能的微生物分布非常廣泛，與系統(tǒng)分化無關(guān)，在近20年，Zumft[17]就記錄了130余種，有超過50個屬的生物具有反硝化功能。目前，更多的研究證實具有反硝化功能的微生物從遺傳距離很遠(yuǎn)的細(xì)菌到太古菌甚至是真菌中都有發(fā)現(xiàn)。因為存在多樣性，許多反硝化菌也執(zhí)行氮循環(huán)過程中的其他功能，例如氨氧化[如亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）、亞硝化螺旋菌屬（Nitrosospira）]和固氮[如根瘤菌屬（Rhizobium）、固氮螺菌屬（Azospirillum）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）]。因此，反硝化群落的研究并不像其他群落研究那樣容易，擁有反硝化功能的反硝化菌在進(jìn)化上沒有緊密的聯(lián)系，不適合用16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹來分析。因此，利用編碼反硝化酶的功能基因來研究反硝化菌應(yīng)是下一步研究的重點。根據(jù)生理生化和分子生物學(xué)試驗結(jié)果，結(jié)合細(xì)菌分類學(xué)手冊，判斷從牛蒡根際微生物中分離到的具有反硝化功能的試驗菌為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

參考文獻(xiàn)：

[1] 楊浩鋒，唐佳玙，胡安輝，等.一株反硝化細(xì)菌的分離鑒定及其反硝化特性[J].環(huán)境工程學(xué)報，2014，8（1）：366-371.

[2] 曾慶武，梁運祥，葛向陽.反硝化細(xì)菌的分離篩選及其反硝化特性的初步研究[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2008， 27（5）：616-620.

[3] 李恒楨，吳勝發(fā)，華桂芬，等.一株異氧硝化細(xì)菌的脫氮特性及其初步應(yīng)用[J].生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報，2014，30（3）：352-357.

[4] 方晶晶，馬傳明，劉存富.反硝化細(xì)菌研究進(jìn)展[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2010，33（6）：206-210，264.

[5] XIE S G， ZHANG X J， WANG Z S. Integrated study on biochemical mechanism in biofiher system[J]. Acta Scientiae Circumstantiae，2002，22（5）：557-561.

[6] DING A Z，F(xiàn)U J M，SHENG G Y. Evidence of aerobic denitrification[J].Chinese Science Bulletin，2000，45（3）：2779-2782.

[7] 高喜燕，劉 鷹，鄭海燕，等.一株海洋好氧反硝化細(xì)菌的鑒定及其好氧反硝化特性[J].微生物學(xué)報，2010，50（9）：1164-1171.

[8] 朱曉宇，王世梅，梁劍茹，等.兩株好氧反硝化細(xì)菌的分離鑒定及其脫氮效率[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2009，29（1）：111-117.

[9] 喬 楠，劉文超，張 賀，等.一株好氧反硝化菌的異氧硝化及脫氮性能[J].化工進(jìn)展，2010，29（4）：767-771.

[10] 郭艷微，張鳳君.好氧反硝化菌的誘變及固定化技術(shù)研究[D].長春：吉林大學(xué)，2007.

[11] 曹國民，趙慶祥，龔劍麗，等.固定化微生物在好氧條件下同時硝化和反硝化[J].環(huán)境工程，2000，18（5）：56-58.

[12] 馬 放，王春麗，王立立.高效反硝化聚磷菌株的篩選及其生物學(xué)特性[J].哈爾濱工程大學(xué)學(xué)報，2007（6）：631-635.

[13] 國家環(huán)?？偩?水和廢水監(jiān)測分析方法[M].第四版.北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002.276-279.

[14] J.薩姆布魯克，D.W拉塞爾.分子克隆實驗指南[M].黃培堂，譯.北京：科學(xué)出版社，2002.

[15] 諸葛建.工業(yè)微生物實驗技術(shù)手冊[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1994.145-147.

[16] 楊艷艷，劉曉艷，林 劍.60Co-γ輻照對琥珀酸產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的誘變選育[J].中國釀造，2009（6）：25-27.

[17] ZUMFT W G. Cell biology and molecular basis of denitrification[J]. Microbiol Mol Biol Rev，1997，61（4）：533-616.