摘要：以擬南芥蛋白質(zhì)作“種子”在蓖麻（Riciuns communis L.）的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中搜索，結(jié)合關(guān)鍵字搜索方法，獲得10個(gè)蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)，通過生物信息方法對(duì)這些蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，10個(gè)蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)外顯子的數(shù)目和內(nèi)含子的位點(diǎn)較保守；氨基酸殘基數(shù)、分子量和等電點(diǎn)相差不大；疏水性/親水性和跨膜結(jié)構(gòu)分析表明，成員間在N-末端第25個(gè)氨基酸位點(diǎn)有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)；主要由α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲組成；三維結(jié)構(gòu)符合SDR超家族特點(diǎn)；NADPH結(jié)合區(qū)域、活性位點(diǎn)較保守，膜錨定區(qū)域和固醇結(jié)合區(qū)域差異較大。

關(guān)鍵詞：蓖麻（Riciuns communis L.）；油體固醇蛋白質(zhì)；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)：S565.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）11-2930-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.056

蓖麻（Riciuns communis L.）是大戟科（Euphorbiaceae）蓖麻屬（Ricicuns）一年或多年生雙子葉植物，廣泛生長(zhǎng)在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，是世界十大重要油料作物之一[1]。植物種子中有一種儲(chǔ)存營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的細(xì)胞器——油體[2-4]，其內(nèi)部主要成分為三酰甘油，外部則為磷脂單分子層及嵌入其內(nèi)的油體結(jié)合蛋白質(zhì)組成的半單位膜[5]。油體結(jié)合蛋白質(zhì)主要有三種——油脂蛋白質(zhì)、油體鈣蛋白質(zhì)和油體固醇蛋白質(zhì)。油脂蛋白質(zhì)由N-和C-末端兩個(gè)親水區(qū)域及中間疏水錨定區(qū)域組成。N-和C-末端暴露在油體表面，能夠提供空間位阻和負(fù)電斥力來維持油體的穩(wěn)定[5]。Chen等[6]在油體中發(fā)現(xiàn)了3種微量蛋白質(zhì)分別稱為Sop1、Sop2、Sop3。Sop1稱為油體鈣蛋白質(zhì)。油體鈣蛋白質(zhì)由N-端親水鈣結(jié)合區(qū)域、C-端親水性磷酸化區(qū)域和中間疏水錨定區(qū)域組成，可能在油體成熟、脂肪動(dòng)員和提高油體穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用[5]。Sop2、Sop3被稱為油體固醇蛋白質(zhì)-A和油體固醇蛋白質(zhì)-B[7]。油體固醇蛋白質(zhì)是一種羥基固醇脫氫酶，屬于SDR家族[8，9]。N-端的疏水區(qū)域由兩個(gè)親性α螺旋夾著一個(gè)疏水錨定結(jié)構(gòu)組成，在此疏水區(qū)域中部有Pro knob結(jié)構(gòu)[10]，其余部位分為NADPH、固醇結(jié)合區(qū)域和兩者之間的活性位點(diǎn)S-（12X）-Y-（3X）-K[10]。Sop3和Sop2蛋白質(zhì)的固醇結(jié)合區(qū)域不同[7]。近來發(fā)現(xiàn)油體蛋白質(zhì)也存在于根尖和芽等胚后組織中，推測(cè)在植物體內(nèi)還存在未被發(fā)現(xiàn)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[8]。本試驗(yàn)以擬南芥蛋白質(zhì)作“種子”在蓖麻的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中搜索，結(jié)合關(guān)鍵字搜索方法對(duì)蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期為該蛋白質(zhì)的鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 蓖麻基因組數(shù)據(jù)庫搜索

以“Steroid dehydrogenase”為關(guān)鍵字在蓖麻基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.phytozome.net/search.php）中搜索，下載基因、cDNA和蛋白質(zhì)序列；以6條擬南芥油體固醇蛋白質(zhì)[11]作為“種子”，分別在蓖麻數(shù)據(jù)庫（http：//www.phytozome.net/search.php）中進(jìn)行Blastp搜索，E設(shè)為1×10-30，獲得同源的油體固醇蛋白質(zhì)的基因、cDNA和蛋白質(zhì)序列，去除重復(fù)后，再利用NCBI保守結(jié)構(gòu)域分析工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi？）對(duì)所獲得的蛋白質(zhì)家族進(jìn)行鑒定，檢測(cè)是否有SDR（短鏈脫氫/還原酶超家族）的保守結(jié)構(gòu)域。

1.2 蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)采用Protparam軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)；內(nèi)含子、外顯子組成采用Spidey軟件進(jìn)行分析；疏水性/親水性采用ProtScal軟件進(jìn)行分析；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析采用GOR4軟件進(jìn)行分析；蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域采用TMHMM 2.0 Server軟件；信號(hào)肽結(jié)構(gòu)采用SignalP4.1 Server軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)；蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析與同源建模采用CPHmodels軟件和RasMol-Raindy軟件；進(jìn)化樹的構(gòu)建采用軟件ClustalW2軟件和MEGA 4.1軟件，所有軟件使用的都是其默認(rèn)值，部分分析軟件的網(wǎng)址見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 氨基酸序列的理化性質(zhì)分析 通過綜合分析，最終獲得11條完整的蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)基因，見表2。利用在線分析軟件Protparam對(duì)10種油體固醇蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，得到其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列的理化性質(zhì)，結(jié)果見表2。大部分蛋白質(zhì)成員外顯子數(shù)為3或6，氨基酸殘基數(shù)為317～352，分子量為35.286 0～39.918 9 kDa，等電點(diǎn)PI為5.35～9.57。不穩(wěn)定系數(shù)表明，有8種成員在植物內(nèi)可能階段性出現(xiàn)。親水性大部分都為正值，大部分成員都為親水蛋白質(zhì)。信號(hào)肽預(yù)測(cè)表明，這11個(gè)蛋白質(zhì)不存在信號(hào)肽。由于Slo11蛋白質(zhì)基因不完整，所以后續(xù)分析中只選擇其他10個(gè)蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)。

2.1.2 疏水性/親水性的預(yù)測(cè)和分析 采用ProtScale軟件對(duì)10個(gè)蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果（圖1）表明，以Slo1、Slo9為例，1～40區(qū)域有強(qiáng)烈的疏水性，可能為跨膜區(qū)域與油體內(nèi)部疏水的三酰甘油相接合處，其他區(qū)域無明顯規(guī)律。

2.1.3 跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析 利用在線軟件TMHMM 2.0 Server對(duì)10個(gè)蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，圖2結(jié)果表明，除了Slo5蛋白質(zhì)在氨基酸25、200位點(diǎn)各有一個(gè)跨膜區(qū)，其他9個(gè)蛋白質(zhì)（如Slo9）均只在25位點(diǎn)處有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。

2.2 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和分析

采用GOR4軟件分析蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)，結(jié)果如圖3所示，65～80、125～130、190～210、240～260范圍內(nèi)主要為α螺旋，45～55、170～180、220～230、285～290范圍內(nèi)主要為β折疊，其他部位沒有明顯的規(guī)律，從二級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性推測(cè)他們可能有相似的空間結(jié)構(gòu)。

2.3 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析與同源建模

利用CPHmodels軟件對(duì)10個(gè)蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)進(jìn)行同源建模，并用RasMol-Raindy軟件將結(jié)果進(jìn)行處理，結(jié)果見圖4。10個(gè)蛋白質(zhì)成員主體都為α螺旋夾著6～7個(gè)β片層的結(jié)構(gòu)，符合SDR超家族的特點(diǎn)，推測(cè)結(jié)構(gòu)包含了NADPH和固醇的結(jié)合區(qū)域以及活性位點(diǎn)，全部成員中在C-端都預(yù)測(cè)到了一個(gè)卷曲組成的長(zhǎng)鏈，可能與油脂固醇蛋白質(zhì)的功能有關(guān)。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

采用了ClustX 1.83軟件對(duì)篩選到的10個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行比對(duì)，采用MEGA 4.1中的Neighbor-Joining算法，自檢舉1 000次，構(gòu)建了10個(gè)成員的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖5所示。這10個(gè)成員可以分為2大類群，類群Ⅰ由6個(gè)成員組成，分別為Slo1、Slo2、Slo3、Slo4、Slo5、Slo6，類群Ⅱ由4個(gè)成員組成，分別為Slo7、Slo8、Slo9、Slo10。

2.5 相似性比對(duì)分析及保守區(qū)的獲得

利用在線程序ClustalW2進(jìn)行序列比對(duì)，找到10個(gè)蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)成員的保守區(qū)域。如圖6所示，活性位點(diǎn)和內(nèi)含子位置已在圖中標(biāo)出。預(yù)測(cè)1～40位為跨膜結(jié)構(gòu)，40～190位為NADPH結(jié)合區(qū)域，190～210位為活性位點(diǎn)區(qū)域，210位以后為固醇結(jié)合區(qū)域。NADPH結(jié)合區(qū)域保守性較好。固醇結(jié)構(gòu)區(qū)域保守性不高，預(yù)測(cè)這些蛋白質(zhì)成員和不同的固醇結(jié)合從而發(fā)揮多種生物學(xué)功能。位于NADPH和固醇結(jié)合區(qū)域之間的序列包含了活性位點(diǎn)S-（12X）-Y-（3X）-K，其中Y和K兩個(gè)位點(diǎn)高度保守，而S位點(diǎn)不是很保守。其中在Slo1、Slo2、Slo3、Slo7、Slo10中S被A取代，在Slo8中S被Q取代，在Sol9中S被L取代。內(nèi)含子位點(diǎn)顯示了Slo1、Slo2、Slo3、Slo4、Slo5、Slo6剪接位點(diǎn)保守，Slo8、Slo9、Slo10剪切位點(diǎn)保守，而Slo7內(nèi)含子位點(diǎn)最復(fù)雜，與其他9個(gè)成員不同。

3 小結(jié)

本試驗(yàn)通過系統(tǒng)地分析蓖麻基因組數(shù)據(jù)，共鑒定11個(gè)蓖麻油體固醇基因，其中10個(gè)具有完整的ORF，1個(gè)序列缺失。對(duì)10個(gè)蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、疏水性/親水性、跨膜結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系和相似性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)蓖麻油體固醇蛋白質(zhì)外顯子的數(shù)目和內(nèi)含子的位點(diǎn)較保守；氨基酸殘基數(shù)、分子量和等電點(diǎn)相差不大；疏水性/親水性和跨膜結(jié)構(gòu)分析表明，成員間在N-末端第25個(gè)氨基酸位點(diǎn)有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)；主要由α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲組成；三維結(jié)構(gòu)符合SDR超家族特點(diǎn)；NADPH結(jié)合區(qū)域、活性位點(diǎn)較保守，膜錨定區(qū)域和固醇結(jié)合區(qū)域差異較大。

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