亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        利用可視化膜芯片檢測9種轉(zhuǎn)基因玉米

        2016-12-31 00:00:00李永進(jìn)熊濤吳華偉楊亞珍
        湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2016年11期

        摘要:建立了一種可同時檢測9種轉(zhuǎn)基因玉米(Zea mays L.)的可視化膜芯片檢測方法。該方法利用紫外交聯(lián)技術(shù),將9種轉(zhuǎn)基因玉米特異性探針及內(nèi)源性玉米醇溶蛋白基因(Zein)探針和雜交質(zhì)控探針固定于尼龍膜表面制成檢測芯片。通過多重PCR同時擴(kuò)增多重靶標(biāo)片段,生物素化產(chǎn)物與檢測芯片雜交。陽性結(jié)果由鏈酶親和素-堿性磷酸酶及顯色底物NBT/BCIP的顯色反應(yīng)在芯片表面形成裸眼可見的點。應(yīng)用商業(yè)化轉(zhuǎn)基因玉米(Bt176、Bt11、MON810、GA21、T25、TC1507、DAS-59122、NK603、MIR604)、轉(zhuǎn)基因棉花(MON1445、MON15985)、轉(zhuǎn)基因大豆及非轉(zhuǎn)基因材料檢驗了芯片的性能,結(jié)果表明,制備的檢測芯片具有良好的特異性和重復(fù)性,檢測限為0.5%。芯片鑒定結(jié)果與PCR產(chǎn)物測序結(jié)果一致。

        關(guān)鍵詞:玉米(Zea mays L.);可視化檢測;膜芯片;轉(zhuǎn)基因作物

        中圖分類號:S513 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:0439-8114(2016)11-2926-04

        DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.055

        轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)入食品領(lǐng)域后,有關(guān)轉(zhuǎn)基因食品安全性的問題備受關(guān)注。為保護(hù)消費者的知情權(quán),中國、日本、韓國及一些歐盟成員國均頒布了食品標(biāo)簽相關(guān)法律法規(guī),要求對食品中成分進(jìn)行明確標(biāo)識(包括是否包含轉(zhuǎn)基因成分),這就需要建立簡便、快速、準(zhǔn)確的方法來滿足日常檢測的需求。目前,現(xiàn)有技術(shù)主要是基于PCR[1,2]或多重PCR結(jié)合電泳檢測的方法[3]、實時熒光定量PCR[4]及基于免疫學(xué)的ELISA[5]。由于DNA容易在各種生物樣本中獲得高度的穩(wěn)定性,基于PCR的方法更有優(yōu)勢。然而,傳統(tǒng)PCR方法只能針對單一基因進(jìn)行檢測。多重PCR雖可同時擴(kuò)增多重靶標(biāo),但很難在后續(xù)電泳檢測中區(qū)分大小相近的片段。同時,基于PCR的方法還存在檢測通量低的局限。基因芯片具有高通量、微型化、自動化的技術(shù)優(yōu)勢。近些年,有研究報道了應(yīng)用基因芯片結(jié)合多重PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因事件[6,7],但現(xiàn)有基因芯片技術(shù)主要以熒光為檢測手段,分析儀器昂貴,并對操作人員具有較高的技術(shù)要求。本研究擬建立一種基于膜芯片的可視化基因芯片檢測方法,該方法將堿性磷酸酶與底物之間的酶學(xué)顯色反應(yīng)引入檢測體系,使陽性結(jié)果在芯片表面形成裸眼可見的點,檢測結(jié)果可裸眼觀察,同時也可配套灰度掃描儀進(jìn)行定量分析。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        轉(zhuǎn)基因材料主要為種子和玉米粉,包括轉(zhuǎn)基因玉米(Bt176、Bt11、MON810、GA21、T25、TC1507、DAS-59122、NK603、MIR604)、轉(zhuǎn)基因棉花(MON1445、MON15985)、轉(zhuǎn)基因大豆(GTS40-3-2)及非轉(zhuǎn)基因材料。

        1.2 試劑及儀器

        植物基因組DNA提取試劑盒(DNeasy Plant Mini Kit)、多重PCR試劑盒(Multiplex PCR kit)均為Qiagen公司產(chǎn)品;核酸雜交試劑(DR. Chip DIY KitTM)為臺灣晶宇生物科技公司產(chǎn)品;點樣儀(晶芯SmartArrayer TM-16型)為北京博奧生物芯片有限公司產(chǎn)品;雜交尼龍膜為美國Pall公司產(chǎn)品;PCR儀(Bio-rad)、紫外交聯(lián)儀(Scientz03-Ⅱ型)為寧波新芝科技有限公司產(chǎn)品。

        1.3 引物及探針設(shè)計

        采用軟件Prime premier 5.0設(shè)計引物,共10對。為使PCR適用于加工過的材料,引物按以下原則選取:①擴(kuò)增產(chǎn)物長度在100~300 bp;②解鏈溫度在55~60 ℃;③適合多重PCR。引物5′端以生物素修飾。探針共12組(包含雜交陽性及陰性質(zhì)控探針),探針設(shè)計應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)在線設(shè)計工具(http:array.iis.sinica.edu.tw/ups/)獲得,同時,以玉米醇溶蛋白基因(Zein)作為內(nèi)源參照基因設(shè)計探針,以EV71病毒基因特異性探針作為雜交陽性質(zhì)控(生物素化EV71病毒基因PCR產(chǎn)物由DR. Chip DIY KitTM試劑盒提供),poly(T)30作為雜交陰性質(zhì)控,所有探針5′端以poly(T)15修飾。引物及探針序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物及探針序列見表1。

        1.4 膜芯片制備

        應(yīng)用芯片點樣儀將合成探針按預(yù)設(shè)模式點樣于尼龍膜上(圖1),陰性、陽性雜交質(zhì)控探針濃度為10 μmol/L,其他探針濃度為20 μmol/L。探針點好后自然風(fēng)干,于紫外交聯(lián)儀中交聯(lián),波長254 nm, 3 min。紫外交聯(lián)后用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)-0.05%Tween 20漂洗3次,再用去離子水漂洗3次,風(fēng)干密封,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.5 基因組DNA提取

        所有測試樣本基因組DNA用植物基因組DNA提取試劑盒(DNeasy Plant Mini Kit)提取,操作步驟參見試劑盒說明。應(yīng)用紫外分光光度計測定DNA的純度和濃度。

        1.6 多重PCR擴(kuò)增

        將樣本DNA濃度稀釋至50~100 ng/μL,于0.2 mL PCR反應(yīng)管中依次加入PCR緩沖液、dNTP、DNA模板、引物、Hotstar Taq酶,補充去離子水至30 μL,各組分濃度參照試劑盒說明書。多重PCR條件如下:94 ℃變性5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72℃ 30 s,35個循環(huán);72 ℃ 10 min。

        1.7 芯片雜交及結(jié)果判定

        PCR產(chǎn)物于PCR儀中95 ℃變性5 min后立即置于冰上,3 min后取5 μL與100 μL雜交緩沖液(雜交緩沖液含有雜交陽性質(zhì)控探針互補片段)混勻,加樣于芯片點樣區(qū),用蓋玻片封閉,于45 ℃雜交40 min。雜交完成后,用清洗液(DR. Chip DIY KitTM試劑盒提供)清洗2次,再滴加100 μL 1∶1 000稀釋的Streptavidin-AP孵育15 min,用清洗液清洗2次,加入50倍稀釋的底物NBT/BCIP,避光室溫反應(yīng)5 min后棄掉顯色液,用去離子水洗2次,吹干,裸眼觀察雜交結(jié)果。

        2 結(jié)果及分析

        2.1 芯片檢測的特異性

        芯片檢測特異性與探針特異性密切相關(guān),本研究應(yīng)用在線探針設(shè)計程序UPS設(shè)計了相關(guān)轉(zhuǎn)基因玉米的探針[8-10]。為了驗證芯片檢測的特異性,應(yīng)用制備的膜芯片檢測商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因材料(玉米、棉花、大豆)及非轉(zhuǎn)基因材料。為提高檢測效率,首先對作物種類進(jìn)行初篩。選擇玉米醇溶蛋白基因作為玉米的內(nèi)源參照基因,同時為驗證雜交過程的正常進(jìn)行,以EV71相關(guān)序列設(shè)計了雜交陽性質(zhì)控(其互補序列整合在試劑盒提供的雜交緩沖液中)。圖2為芯片檢測的鑒定結(jié)果,對應(yīng)探針位點、內(nèi)源參照基因位點和陽性質(zhì)控位點均有明顯的信號響應(yīng)。轉(zhuǎn)基因大豆、棉花及非轉(zhuǎn)基因材料除雜交陽性對照點外,無任何信號反應(yīng)。同時,對芯片鑒定的樣本也進(jìn)行了PCR產(chǎn)物測序比對分析,與芯片鑒定結(jié)果一致。結(jié)果表明,芯片具有良好的檢測特異性。為了進(jìn)一步檢驗芯片多重靶標(biāo)分析的能力,將不同轉(zhuǎn)基因株系基因組DNA混合進(jìn)行多重PCR,然后進(jìn)行芯片檢測,結(jié)果如圖3所示。

        由圖3可見,制備的檢測芯片可以進(jìn)行多靶標(biāo)的同時檢測。芯片上不同點之間信號強度存在一定差異,這是由于在多重PCR過程中不同引物對之間相互影響,導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率,但并不影響對多重靶標(biāo)的同時鑒定。

        2.2 芯片檢測的靈敏度

        為了確定芯片檢測的靈敏度,以Bt176為材料,將轉(zhuǎn)基因玉米Bt176與非轉(zhuǎn)基因玉米按不同比例混合(轉(zhuǎn)基因玉米占總混合材料0.1%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、10.0%),以此混合樣品提取DNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增,應(yīng)用檢測芯片進(jìn)行檢測。結(jié)果表明(圖4),隨著轉(zhuǎn)基因成分含量逐漸減少,雜交信號逐漸減弱,0.5%的轉(zhuǎn)基因Bt176就可以被檢測出來。

        2.3 芯片檢測的重復(fù)性

        為了測試芯片檢測的重復(fù)性,利用同批次及不同批次制備的芯片對同一個轉(zhuǎn)基因株系樣本Bt176進(jìn)行檢測,批內(nèi)及批間制備的芯片均成功鑒定,結(jié)果表明檢測芯片具有良好的重復(fù)性。

        3 小結(jié)

        本研究建立的可視化膜芯片技術(shù)可同時檢測9種轉(zhuǎn)基因玉米,減少了對昂貴儀器的依賴及對操作人員的技術(shù)要求,具有快速、準(zhǔn)確、廉價及簡便易行的特點,在轉(zhuǎn)基因作物檢測領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。

        參考文獻(xiàn):

        [1] 陽 麗,操志林.轉(zhuǎn)基因玉米種子的PCR檢測[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報,2014,26(4):98-99.

        [2] 易小平,賀萍萍,夏啟玉,等.定性PCR方法檢測轉(zhuǎn)基因玉米MON810轉(zhuǎn)化事件的研究[J].熱帶作物學(xué)報,2014,35(12):2384-2390.

        [3] 李 會,任志瑩,王 穎,等.多重 PCR法快速檢測轉(zhuǎn)基因玉米多種轉(zhuǎn)化體技術(shù)優(yōu)勢的比較分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2014,42(5):57-59.

        [4] 宋 君,雷紹榮,郭靈安,等.實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)基因玉米NK603品系特異片段的測量不確定度[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2013, 26(5):1769-1773.

        [5] 劉志浩,高麗麗,王新桐,等.轉(zhuǎn)基因玉米中膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2013,41(11):40-45.

        [6] 路興波,武海斌,王 敏,等.轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化體特異性寡核苷酸芯片檢測方法的研制[J].作物學(xué)報,2009,35(8):1432-1438.

        [7] 武海斌,孫紅煒,李寶篤,等.轉(zhuǎn)基因玉米多重PCR-基因芯片聯(lián)用的檢測方法[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2009,17(6):1075-1082.

        [8] CHEN S H,LO C Z,SU S Y,et al.UPS 2.0:Unique probe selector for probe design and oligonucleotide microarrays at the pangenomic/genomic level[J].BMC Genomics,2010,11(S4):1-7.

        [9] CHEN S H,LO C Z,TSAI M C,et al. The unique probe selector:A comprehensive web service for probe design and oligonucleotide arrays[J].BMC Bioinformatics,2008,9(S1):1-9.

        [10] LEU J H,LIU K F,CHEN K Y,et al. The novel white spot syndrome virus-induced gene,PmERP15,encodes an ER ste protein in black tiger shrimp,Penaeus monodon[J].Developmental Comparative Immunology,2015,49(2):239-248.

        国产精品一区二区AV不卡| 日本牲交大片免费观看| 国产欧美日韩a片免费软件| 国产午夜视频免费观看| 成人亚洲av网站在线看| 日韩日韩日韩日韩日韩日韩日韩| 日本无码人妻波多野结衣| 欧美亚洲高清日韩成人| 日韩精品有码中文字幕| 午夜视频在线观看一区二区小| 亚洲国产精品第一区二区| 亚洲免费天堂| 久久婷婷夜色精品国产| 寂寞人妻渴望被中出中文字幕| 好看的欧美熟妇www在线| 亚洲精品一二区| 亚洲精品综合一区二区| 亚洲国产精品无码久久一区二区 | 51看片免费视频在观看| 亚洲精品免费专区| 蜜臀av国内精品久久久人妻| 极品av一区二区三区| 亚洲精品乱码久久久久久金桔影视| 激情五月天伊人久久| 亚洲一区视频中文字幕| 中文无码人妻有码人妻中文字幕| 人人妻人人澡人人爽欧美二区| 亚洲一区区| 亚洲中文字幕第15页| 乱子伦在线观看| 狼人国产精品亚洲| 亚洲第一页在线观看视频网站| 日韩av无码社区一区二区三区| 无码精品国产va在线观看| 中国免费av网| 国产自拍在线视频91| 欧美日韩视频在线第一区| 久久精品这里只有精品| 日本一区二区三区免费| 免费无遮挡无码永久视频| 久久精品国产一区二区电影|