摘要：通過生物信息學分析確定水稻（Oryza sativa L.）OsVDAC5的可溶性肽段，將相應的編碼區(qū)克隆于pGEX-4T-1原核表達載體中，進行IPTG誘導表達和GST親和層析純化，利用SDS-PAGE和Western Blot檢測目的蛋白。結果表明，成功構建的pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表達載體，經(jīng)過體外IPTG誘導，在35 kDa處可檢測到可溶性目的蛋白，并獲得外源蛋白表達的最適溫度為15 ℃和最佳誘導時間為8 h；經(jīng)過GST親和層析，SDS-PAGE可檢測到較為單一的蛋白條帶，得到純化的GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白。

關鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）；OsVDAC5；可溶性表達；親和層析

中圖分類號：S511；Q816 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2921-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.054

電壓依賴性陰離子通道蛋白（Voltage-dependent anion channels，VDAC）是線粒體外膜上具有高度保守性的孔狀蛋白，由一種小的多基因家族編碼，廣泛存在于真核生物中[1]，并在能量代謝、細胞凋亡、物質運輸和信號轉導過程中起著決定性作用[2-4]。VDACs最早從草履蟲（Paramecium aurelia）線粒體外膜上分離得到[5]。哺乳動物中主要有3種VDAC亞型[6]，真菌中主要有2種亞型[6]，而在植物中，煙草中至少有3種VDAC亞型，大豆、蒺藜苜蓿、百脈根和擬南芥中至少有5種不同的亞型[7-10]，水稻中存在8個VDAC基因[11]。與哺乳動物和真菌相比，植物中有更多的VDAC異型體，表明植物VDAC具有多種不同的功能，但它們都有著相同的離子選擇性和電壓依賴性特性，并且具有相似的電生理學特征，說明VDAC在結構和功能上具有一定的保守性[12]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)植物VDAC在植物的生長和發(fā)育階段以及在生物和非生物脅迫響應方面都發(fā)揮著重要作用[10，13，14]。擬南芥中AtVDAC3能同葉綠體蛋白AtTrx m2相互作用，參與ROS信號通路，以應答鹽脅迫[15]；AtVDAC1能同CBL1相互作用，在種子萌發(fā)與植物發(fā)育過程中負調控植物對外界溫度的應答[13]。超表達OsVDAC3顯著提高了水稻的抗鹽性和抗旱性[16]。前期研究表明，OsVDAC5基因在YTA水稻生殖生長期達到最高表達水平[17]，表明OsVDAC5基因可能在水稻YTA的生殖發(fā)育期發(fā)揮重要功能。

在體外以大腸桿菌為宿主菌高效表達外源基因時，表達蛋白常常在細胞內凝集，形成包涵體。以包涵體形式存在的蛋白質分子無定形，呈非水溶性，無生物活性，為后續(xù)研究帶來諸多不便[18]。VDAC蛋白為線粒體外膜蛋白，在原核表達時由于無法形成正確的次級鍵，大多以包涵體形式存在。雖然可以通過包涵體蛋白變性、復性等方法獲得可溶性蛋白，但蛋白質的復性效率低，得到的可溶性蛋白常常會在結構上發(fā)生改變，不利于后期進一步研究蛋白質的功能[19]。研究表明，全長的OsVDAC5基因在體外表達時以包涵體形式存在[20]，因此，本研究擬通過生物信息學分析，將OsVDAC5基因截短為可溶性肽段，構建pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）基因片段的原核表達載體進行體外表達，以獲得可溶性目的蛋白，為OsVDAC5互作蛋白的研究及其在水稻生長發(fā)育過程中的生物學功能分析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 原核表達載體pGEX-4T-1、大腸桿菌菌株DH5α、BL21（DE3）以及pET-32a-OsVDAC5質粒均由中南民族大學武陵山區(qū)特色資源植物種質保護與利用湖北省重點實驗室提供。

1.1.2 試驗試劑 限制性內切酶Quick CutTM BamH Ⅰ、Quick CutTM Xho Ⅰ，T4-DNA連接酶，Ex Taq酶，DL15 000和DL2 000 DNA Marker，GST Fusion Protein Purification Kit均購自Takara公司。DNA凝膠回收和清潔試劑盒均購自Axygen公司。Page RulerTM Prestained Protein Ladder購自Thermo公司。GST Tag Mouse Monoclonal Antibody及二抗羊抗鼠購自Abbkine公司。超敏ECL化學發(fā)光即用型底物購自武漢博士德生物工程有限公司。引物合成及測序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.1.3 試驗儀器 C1000 Touch Thermal Cycler 型PCR儀和凝膠成像分析儀，購自美國Bio-RAD公司；Model 1 000分子雜交箱，購自美國Robbins Scientific Corporation；752N型紫外可見分光光度計，購自上海精科公司；Centrifuge 5415D、5417R和5810R離心機，購自德國Eppendoff公司；CR22G型高速離心機，購自日本Hitachi公司；Soniprep 150型超聲破碎儀，購自日本SANYO公司；半干式碳板轉移電泳槽、DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和膠片觀察燈，購自北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 OsVDAC5跨膜結構預測 利用生物信息學分析方法和不同在線生物學軟件（PRED-TMBB：http：//bioinformatics.biol.uoa.gr/PRED-TMBB/；BOCTOPUS： http：//boctopus.cbr.su.se/）對OsVDAC5蛋白質的二級結構及跨膜情況進行初步預測和分析。

1.2.2 pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表達載體的構建 根據(jù)OsVDAC5基因序列，以BamHⅠ和XhoⅠ作為酶切位點設計引物，以pET-32a-OsVDAC5質粒為模板，擴增目的片段。引物為Fw（5′CGCGGATCCATGAGCAAAGGCCCAGC3′）、Rv（5′CC GCTCGAGAGATTCACTATCAATCTTGACATCA3′）。采用20 μL體系進行PCR反應，各反應物濃度：15.3 μL ddH2O，2 μL 10×Ex Taq Buffer，1 μL dNTP（2.5 mmol/L），0.3 μL Fw（10 mmol/L），0.3 μL Rv（10 mmol/L），1 μL稀釋100倍的pET-32a-OsVDAC5質粒，0.1 μL Ex Taq酶。

PCR反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，重復34個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴增反應完成后使用AxyPrep DNA清潔試劑盒對PCR產(chǎn)物進行清潔回收，詳細操作參考試劑盒說明書，并進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ同時雙酶切目的片段和pGEX-4T-1空載體，37 ℃酶切3～4 h，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進行切膠回收。用T4連接酶連接雙酶切后的目的基因和pGEX-4T-1載體，16 ℃連接過夜并轉化DH5α感受態(tài)細胞，涂LB（含Amp+）平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單克隆，采用堿裂解法提取質粒，進行PCR擴增和雙酶切鑒定，將對應陽性克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序分析。

1.2.3 GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白誘導表達

1）融合蛋白的誘導。將pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）重組質粒和pGEX-4T-1空載體轉化BL21（DE3）表達菌株，涂LB（含Amp+）平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。分別挑取單克隆于3 mL含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，第二天按1∶100的比例（V/V）接種于5 mL含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600 nm為0.6左右，加入1 mol/L IPTG至終濃度為0.7 mmol/L，分別于10、15、25、37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)誘導蛋白表達，分別在誘導4、6、8 h時取樣5 mL，檢測誘導溫度和誘導時間對可溶性蛋白表達的影響。同時，誘導不加IPTG的pGEX-4T1-OsVDAC5（1-75aa）和加IPTG的pGEX-4T1空載體的BL21菌株作為陰性對照。

2）融合蛋白的SDS-PAGE檢測。將誘導表達的菌液轉入10 mL離心管中，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，向菌體中加入1 mL預冷的1×PBS（pH 7.4）緩沖液，緩慢用槍頭吹打菌體使菌體重懸，冰水混合物中進行超聲波細胞破碎，每管破碎10 s，間隔10 s，共破碎2～3 min，收集空載體混合液。其余蛋白混合液于4 ℃，12 000 r/min離心15 min，分別收集蛋白上清液。向蛋白沉淀中加入1 mL蛋白沉淀變性液（10 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L尿素，pH 8.0）室溫放置1 h，期間混勻2～3次，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，收集蛋白上清液，即為沉淀液。取出各樣品200 μL，加入適量的5×SDS PAGE Loading buffer混合均勻，100 ℃煮沸10 min，80 V恒壓進行12% SDS-PAGE檢測?？捡R斯亮藍染色液染色3 h后換脫色液，進行脫色觀察。

3）融合蛋白的Western Blot檢測。對15、25、37 ℃條件下誘導8 h的蛋白上清液和沉淀液點樣進行Western Blot檢測。半干式轉膜儀80 mA恒流轉膜2.5 h后，加入40 mL蛋白封閉液室溫封閉1 h，按1∶5 000的比例（V/V）向封閉液中加入GST抗體， 4 ℃振蕩過夜，第二天按1∶10 000的比例（V/V）向封閉液中加入二抗羊抗鼠，孵育箱內25 ℃振蕩孵育1.5 h后進行ECL化學發(fā)光檢測。

1.2.4 GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白的純化 采用金斯瑞GST Fusion Protein Purification Kit對蛋白進行親和層析。向層析柱中加入2 mL Glutathione Resin懸浮液，用10 mL預冷的1×PBS（pH 7.4）緩沖液平衡層析柱，將3 mL破碎后蛋白上清液加入層析柱，4 ℃緩慢振蕩孵育過夜。第二天收集流出液，加入32 mL預冷1×PBS（pH 7.4）緩沖液洗脫未和谷胱甘肽結合的蛋白，每次加入4 mL，孵育3 min，收集最后一次洗脫液。最后加入7 mL 10 mmol/L還原型GSH洗脫柱子上的蛋白，每次加入1 mL，孵育5 min，收集洗脫液。取出各樣品100 μL，加入適量的5×SDS PAGE Loading buffer混合均勻，100 ℃煮沸10 min，80 V恒壓進行12%SDS-PAGE檢測。考馬斯亮藍染色液染色3 h后換脫色液，進行脫色觀察。

2 結果與分析

2.1 OsVDAC5跨膜結構預測

前期構建了全長OsVDAC5基因原核表達載體，但是表達的蛋白以包涵體的形式存在，因此本研究利用生物信息學軟件預測了OsVDAC5的跨膜方式，將PRED-TMBB和BOCTOPUS這兩個專門預測蛋白質二級結構中β折疊結構的生物學軟件的預測結果進行對比（圖1）。預測結果表明，OsVDAC5在線粒體外膜上可能分別以十二次跨膜（PRED-TMBB）或十八次跨膜（BOCTOPUS）的結構存在，而且OsVDAC5蛋白的N端和C端有可能均位于線粒體雙層膜之間的膜間隙內。因此，僅保留OsVDAC5蛋白75個氨基酸殘基，構建只含N端75個氨基酸的pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表達載體。

2.2 pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表達載體的構建

PCR擴增鑒定pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）重組質粒，檢測到目的基因的大小為250 bp。利用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切重組質粒，檢測到大小為5 000、250 bp的兩個條帶，與預期的條帶大小相同。將構建好的載體測序，測序結果100%匹配，表明pGEX-4T-1-OsVDAC5（1-75aa）原核表達載體構建成功（圖2）。

2.3 SDS-PAGE檢測GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白誘導表達

將陽性重組質粒熱激轉化BL21表達菌株，經(jīng)過IPTG誘導后，用12%SDS-PAGE檢測表達產(chǎn)物，經(jīng)過考馬斯亮藍染色，可觀察到在10、15、25、37 ℃誘導表達條件下，4、6、8 h時在35 kDa的上清液和沉淀中均有蛋白表達，其大小與預測的GST-OsVDAC5（1-75aa）的蛋白產(chǎn)物大小相同，且不同溫度在8 h時蛋白的表達量較4、6 h高，15 ℃時上清液中的表達量較沉淀高。結果表明，OsVDAC5（1-75aa）基因在pGEX-4T-1系統(tǒng)中得到了高效表達，其表達產(chǎn)物為部分可溶性蛋白（圖3）。

2.4 Western blot檢測GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白誘導表達

用GST單抗對10、15、25、37 ℃誘導表達條件下誘導8 h的蛋白進行Western blot檢測，IPTG誘導后的pGEX-4T1-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白在35 kDa左右處的上清液和沉淀中均出現(xiàn)單一的信號條帶，而未加IPTG誘導的pGEX-4T1-OsVDAC5（1-75aa）和空載體蛋白樣品在35 kDa左右處未見表達（圖4）。此結果進一步表明pGEX-4T1-OsVDAC5（1-75aa）載體構建成功，且GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白可在上清液中高效表達。

2.5 GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白的純化

GST融合蛋白與固定的谷胱甘肽（GSH）通過硫鍵共價親和，利用谷胱甘肽與谷胱甘肽巰基轉移酶（GST）之間酶和底物的特異性作用力，使得帶GST標簽的GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白能夠與凝膠上的谷胱甘肽結合，從而將該蛋白與其他蛋白分離開。由于GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白在上清液中高效表達，因此通過10 mmol/L還原型GSH洗脫后進行SDS-PAGE檢測，在35 kDa處可觀察到較為單一的蛋白條帶，得到純化的可溶性GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白（圖5）。

3 小結與討論

在植物中VDACs高度保守，但對不同VDAC的特定功能知之甚少。OsVDAC5互作蛋白的研究對揭示OsVDAC5蛋白的功能有重要意義。同時，進行體外Pull-down試驗時通常需要可溶性的VDAC蛋白。因此，獲得外源表達的可溶性蛋白至關重要。

試驗室前期構建了帶有His標簽的pET-32a-OsVDAC5和pET-302a-OsVDAC5原核表達載體以及帶有GST標簽的pGEX-4T-1-OsVDAC5原核表達載體，但是體外表達的OsVDAC5融合蛋白幾乎都以包涵體的形式存在，暫時無法純化出可溶性的目的蛋白[20]，即全長的OsVDAC5基因在體外可能較難表達可溶性蛋白。因此，通過生物信息學的方法分析OsVDAC5的二級結構及跨膜區(qū)域，將OsVDAC5基因截短為只含N端的75個氨基酸進行體外表達。通過優(yōu)化表達條件，結果獲得了純度較為理想的可溶性GST-OsVDAC5（1-75aa）融合蛋白，也為OsVDAC5互作蛋白的研究和其在水稻中相關功能的研究奠定了基礎。

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