摘要：研究了超聲波-微波協(xié)同提取何首烏[Fallopia multiflora（Thunb.） Harald.]多糖的最佳工藝條件，以何首烏多糖提取率為綜合指標(biāo)，考察料液比、提取次數(shù)、超聲時間、微波時間4個因素對提取效果的影響，在此基礎(chǔ)上，利用中心組合試驗設(shè)計對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，最佳工藝條件為料液比1∶21（g∶mL），超聲時間15 min，微波時間3 min，提取1次，在此條件下多糖實際提取率可達(dá)19.74%。

關(guān)鍵詞：何首烏[Fallopia multiflora（Thunb.） Harald.]；多糖；微波；超聲波；提取

中圖分類號：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2867-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.039

何首烏[Fallopia multiflora （Thunb.） Harald.]既是中國名貴中藥材，又是食療保健佳品[1]。按其炮制方法不同分為生首烏和制首烏。生首烏味苦、澀，性平，具有解毒、消癰、潤腸通便的功效；制首烏苦、甘、澀，性溫，具有補肝腎、益精血、烏須發(fā)等功效[2]。多糖廣泛存在于植物、微生物和海藻中。近年來，對制何首烏多糖的生物活性的評價研究表明，制何首烏多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老、降血脂及抗老年癡呆癥等功效[3-5]，開展對何首烏多糖提取工藝的研究對中國何首烏資源的綜合利用、產(chǎn)品的商業(yè)化生產(chǎn)等具有重要意義。

超聲波-微波協(xié)同提取法充分利用超聲波振動的空化作用以及微波的高能作用，使何首烏樣品各點受到的作用一致，降低目標(biāo)物多糖與樣品基體的結(jié)合力，加速多糖從固相進(jìn)入溶劑的過程[6-8]。本試驗根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理，采用響應(yīng)面分析法對制何首烏多糖的超聲波-微波協(xié)同提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為制何首烏資源的深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

何首烏，購于聊城市藥店；葡萄糖（AR），濃硫酸（AR），苯酚（AR），無水乙醇（AR）。

QE-200型高速中藥粉碎機(jī)，武義縣屹立工具有限公司；賽多利斯萬分之一電子天平，北京聯(lián)合科儀科技有限公司；KQ3200型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；常壓微波合成/萃取儀，新儀微波化學(xué)科技有限公司；SB-2000型水浴鍋，上海愛朗儀器有限公司；UV-1800型紫外分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 何首烏多糖提取工藝流程 何首烏→粉碎過篩（20目）→80%乙醇溶液預(yù)處理（料液比1∶6，g∶mL，70 ℃恒溫水浴，攪拌1 h）→抽濾→通風(fēng)干燥→何首烏粉末→加入一定量的去離子水→超聲波處理→微波處理→抽濾→濾液定容→測定吸光度。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖25.1 mg，置于250 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為0.100 4 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL分別置于10 mL容量瓶中，加入去離子水補至1.0 mL，各加5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，然后迅速加入濃硫酸5.0 mL，充分搖勻后，室溫下放置20 min。以去離子水為空白，在490 nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到葡萄糖濃度（C，mg/mL）與吸光度（A）的線性回歸方程C=0.098 5A-0.012 7（R2=0.999 1），其中A與濃度C之間在0～0.08 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.2.3 何首烏多糖提取率的測定 何首烏多糖提取率采用以下公式計算：

何首烏多糖提取率=CV/M×100%

式中，C為提取液中多糖濃度；V為提取液的最終體積；M為何首烏樣品的質(zhì)量。

1.2.4 單因素試驗 分別考察料液比、提取次數(shù)、超聲時間和微波時間對何首烏多糖提取率的影響。①稱取3.0 g何首烏粉末，固定超聲時間15 min，微波時間3 min，按不同料液比1∶10、1∶15、1∶18、1∶20、1∶25（g∶mL，下同）加入去離子水，提取1次，測定提取液中多糖含量；②稱取3.0 g何首烏粉末，固定料液比1∶10，微波時間3 min，超聲時間分別為5、10、15、20、25 min，提取1次，測定提取液中多糖含量；③稱取3.0 g何首烏粉末，固定料液比1∶10，超聲時間15 min，微波時間分別為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 min，提取1次，測定提取液中多糖含量；④稱取3.0 g何首烏粉末，固定料液比1∶10，超聲時間15 min，微波時間3 min，分別重復(fù)提取1、2、3、4、5次，測定提取液中多糖含量。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理，選擇料液比、超聲時間、微波時間、提取次數(shù)4個因素，采用四因素三水平響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝[9-11]，試驗因素與水平見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 料液比對何首烏多糖提取率的影響 由圖2可知，隨著料液比的增大，何首烏多糖提取率也逐漸升高，在料液比達(dá)到1∶20時，多糖提取率最高。一般來說，增大溶劑的量有助于目標(biāo)成分的提取，固液接觸面積增加，提取率提高；但是料液比過大會造成溶劑和能源的浪費，且后續(xù)濃縮和純化壓力增大。從節(jié)能和提高工作效率的角度考慮，溶劑用量不宜過大。因此，料液比取1∶20為宜。

2.1.2 超聲時間對何首烏多糖提取率的影響 由圖3可知，超聲時間對何首烏多糖提取率的影響較為明顯，在5～15 min范圍內(nèi)，隨著時間的延長提取率明顯升高，當(dāng)超聲時間達(dá)到15 min時，提取率最大，超過15 min后提取率開始急劇下降。這是因為超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化效應(yīng)以及高速攪拌作用可以加快植物的溶脹和破碎，使得有效成分溶解率增加，提取率也相應(yīng)增大。但超聲時間過長，會使體系溫度增加，一部分多糖被破壞。因此，選擇超聲時間15 min為宜。

2.1.3 微波時間對何首烏多糖提取率的影響 由圖4可知，隨著微波時間的增加，何首烏多糖提取率不斷升高，當(dāng)微波時間為3.0 min時，多糖提取率最高；而微波時間達(dá)到3.0 min后，提取率隨微波時間的增加而降低，這可能是由于長時間高溫破壞了多糖的結(jié)構(gòu)，使得提取率降低。在實際提取過程中要考慮時間效率和成本因素，所以微波時間取3.0 min為宜。

2.1.4 提取次數(shù)對何首烏多糖提取率的影響 由圖5可知，隨著提取次數(shù)的增加，何首烏多糖提取率也隨之增加。提取2次的多糖提取率明顯增大，何首烏多糖已基本提取完全；當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到3次以后，提取率變化不明顯，因此，選擇提取2次為宜。

2.2 何首烏多糖提取工藝優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 為進(jìn)一步優(yōu)化何首烏多糖的提取條件，根據(jù)響應(yīng)面分析因子和水平，以料液比（A）、超聲時間（B）、微波時間（C）、提取次數(shù)（D）為自變量，以制何首烏多糖提取率為響應(yīng)值，采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗，試驗方案與結(jié)果見表2。

2.2.2 數(shù)學(xué)模型的建立及顯著性檢驗 采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行多元回歸分析，得到何首烏多糖提取率與提取工藝各因素變量的二次回歸方程：Y=-106.237 00+2.532 73A+3.172 80B+47.482 67C+0.804 00D-0.015 200AB+0.014 000AC-0.020 500AD-0.046 000BC+0.041 500BD+1.405 00CD-0.053 327A2-0.092 127B2-8.432 67C2-0.765 67D2。

回歸方程中各變量對響應(yīng)值影響的顯著性由P值來判斷，P值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高，回歸分析結(jié)果見表3，回歸模型可信度分析結(jié)果見表4。

由表3可知，模型中的一次項B、二次項CD的影響達(dá)到顯著水平（P<0.05），一次項A、D，二次項A2、B2、C2、D2的影響均達(dá)到極顯著水平（P<0.01），進(jìn)一步說明各因素對響應(yīng)面的影響不僅僅是簡單的線性關(guān)系。各因素對何首烏多糖提取率的影響大小順序依次為A、D、B、C，即料液比、微波時間、提取次數(shù)、超聲時間。

由表4可知，該回歸模型相關(guān)系數(shù)R2=0.929 1，說明響應(yīng)值何首烏多糖提取率有92.91%來源于所選變量，即料液比、超聲時間、微波時間、提取次數(shù)。由方程顯著性檢驗可知，該方程的模型擬合程度良好；失擬性分析表明，該回歸方程無失擬性因素存在，且校正擬合度與預(yù)測擬合度在合理的水平內(nèi)具有一致性，因此回歸模型與實測值能較好地擬合；該試驗的變異系數(shù)為3.79%，說明該模型的可靠性良好；信噪比為11.621，遠(yuǎn)大于4，說明該模型的精密度良好。綜上所述，該回歸方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實關(guān)系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。

結(jié)合回歸數(shù)學(xué)模型分析，對上述二次回歸方程求解，得到最佳提取條件為料液比1∶21.27，超聲時間15.48 min，微波時間3.08 min，提取次數(shù)1.45次，在此條件下何首烏多糖提取率為19.82%?？紤]到實際工藝條件的可操作性，將參數(shù)調(diào)整為料液比1∶21，超聲時間15 min，微波時間3 min，提取次數(shù)1次。

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件處理數(shù)據(jù)，所得等高線與三維響應(yīng)曲面見圖6～圖11。由等高線圖的形狀和疏密可以直觀地看到各因素交互作用對響應(yīng)值的影響。

2.3 最佳工藝條件下的驗證試驗

為了驗證模型的有效性，進(jìn)行重復(fù)驗證試驗，所得何首烏多糖平均提取率為19.74%，與理論預(yù)測值19.82%相差不大，表明預(yù)測值與實際值之間具有較好的擬合性，回歸數(shù)學(xué)模型可以很好地預(yù)測不同條件下的提取率，具有一定的實用價值。

3 小結(jié)

本試驗以何首烏為原料，采用超聲波-微波協(xié)同提取技術(shù)對多糖提取工藝進(jìn)行分析，采用中心組合試驗和響應(yīng)面分析法進(jìn)行工藝優(yōu)化，并建立了超聲波-微波協(xié)同提取何首烏多糖提取率與料液比、超聲時間、微波時間和提取次數(shù)關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，由此模型獲得了適宜的工藝參數(shù)：料液比1∶21，超聲時間為15 min，微波時間為3 min，提取次數(shù)1次。在此條件下多糖提取率可達(dá)19.74%，與理論值19.82%相差不大，說明該回歸方程模型具有較好的實際應(yīng)用價值。

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