摘要：研究清香型小曲白酒機械化酒釀造過程中的細菌多樣性，分析不同種屬的細菌釀造性能。優(yōu)選酒醅中微生物基因組的提取方法，優(yōu)化PCR擴增V3區(qū)核酸序列的程序和DGGE凝膠的電泳條件。PCR擴增V3區(qū)核酸序列的最佳退火溫度為54 ℃，120 V電泳8 h的DGGE凝膠有22條差異明顯的條帶，切膠PCR擴增，測序比對鑒定出22種細菌。種屬優(yōu)勢菌芽孢桿菌和乳酸桿菌為主要風味功能菌。雞葡萄球菌、人葡萄糖球菌、肺炎克雷伯菌、肉芽腫桿菌、食酸叢毛單胞菌為傾向有害菌。高溫糖化時期細菌的主要種類為耐熱的芽孢桿屬，肺炎克雷伯菌和肉芽腫桿菌在發(fā)酵階段侵入到酒醅中。

關(guān)鍵詞：清香型；小曲白酒；DGGE；細菌多樣性；釀造性能

中圖分類號：Q93-3；TS261.1；TS262.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2860-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.037

清香型小曲白酒釀造過程中的微生物有細菌、酵母菌和霉菌。不同種類的細菌對白酒品質(zhì)的影響不同，有的細菌產(chǎn)生的淀粉酶、酯化酶等對出酒率和酒的香味有重要影響[1]，有的細菌代謝產(chǎn)生酸類、醛類等物質(zhì)，這些物質(zhì)對香型的呈現(xiàn)和品格的提升具有重要意義。對新生產(chǎn)環(huán)境中細菌多樣性的系統(tǒng)研究是揭示白酒機械化釀造機理，指導實際生產(chǎn)，提升品質(zhì)、提高出酒率以及更好地發(fā)揮機械化效能必需的研究內(nèi)容。

近年來，隨著生物化學技術(shù)和分子生物學技術(shù)的發(fā)展，細菌多樣性的研究方法也在不斷發(fā)展，目前已有較多細菌多樣性研究方法，如傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法、Biolog法[2]、磷脂脂肪酸法[3]、分子生物學方法。隨著重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，分子生物學方法被廣泛用于細菌多樣性分析?，F(xiàn)代分子生物學技術(shù)能夠揭示DNA序列遺傳多態(tài)性，可以用于推斷系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，通過數(shù)據(jù)庫比較來鑒定未知細菌[4]，克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的限制，對樣品的分析比較全面、客觀，進而更精確地反映樣品信息。變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）被廣泛用于微生物多樣性的研究，如分析自然環(huán)境中細菌、藍細菌、古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多樣性，具有加樣量小、不需要培養(yǎng)、突變檢出率高、非同位素性、操作簡便快速等優(yōu)點。目前，對細菌的研究主要為酒曲和窖泥中細菌多樣性的分析，對整個釀造過程中細菌多樣性的研究鮮見報道。本試驗采用DGGE法對清香型小曲白酒機械化釀造整個過程中細菌的多樣性進行研究，為機械化釀造清香型小曲白酒設(shè)備的改進和工藝的優(yōu)化提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

清香型小曲白酒機械化生產(chǎn)過程中糖化和發(fā)酵酒醅，糖化取樣為8、24 h的酒醅，發(fā)酵取樣為0～15 d的酒醅，每天取1次樣。

1.2 方法

1.2.1 基因組提取 SDS-酚-氯仿抽提法，參照孟鎮(zhèn)等[1]的方法；試劑盒提取方法，采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的土壤基因組提取試劑盒提取總DNA，步驟參考說明書。

1.2.2 基因擴增條件優(yōu)化 采用適用于大多數(shù)細菌及土壤細菌的16S rDNA V3區(qū)的通用引物：引物341F（5′-TACGGGAGGCAGCAG-3′）、引物518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）、引物GC-341F（5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCC CCCGCCCGCCTACGGGAGCAGCAG-3′）。

PCR反應體系：5 μL 10×PCR Buffer（Mg2+ plus），4 μL dNTP Mixture（2.5 mmol/L），0.25 μL Taq酶 （5 U/μL），1 μL模板DNA，1 μL上游引物（20 μmol/L）， 1 μL下游引物（20 μmol/L），37.75 μL去離子水。

PCR擴增反應程序：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，退火溫度分別選取50、52、53、54 ℃， 退火45 s，72 ℃延伸1 min（30 個循環(huán)）；延伸72 ℃ 7 min，4 ℃保存。取8 μL PCR產(chǎn)物與2 μL SYBR GREENⅠ染液混合，點樣到0.7%的瓊脂糖凝膠上，于1×TAE緩沖液中75 V電泳40 min，電泳結(jié)束后，放入凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）顯影。

1.2.3 DGGE電泳條件優(yōu)化 DGGE電泳采用DCodeTM System Mutation Detection System（BIO-RAD）系統(tǒng)。電泳條件：先用注射針取20 μL按1∶1混合的PCR回收產(chǎn)物和2×Loading dye點樣進行恒壓電泳20 min，30%～70%的變性梯度，1×TAE電泳緩沖液，選取合適電壓和時間60 ℃恒溫電泳進行條件優(yōu)化。凝膠顯色采用銀染法。產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技有限公司測序，將序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中進行Blast分析，根據(jù)最相似的種屬確定微生物的種類。

1.2.4 細菌釀造功能分析 對于檢測出的細菌進行分析，初步了解其功能特性，對細菌釀造功能進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組提取

SDS-酚-氯仿抽提法適用于細菌基因組的提取，從試驗結(jié)果來看，該方法并不適用于酒醅中微生物基因組的提取，原因是酒醅中含有大量的淀粉、果膠質(zhì)等高分子量物質(zhì)，SDS-酚-氯仿抽提法不能有效地促進DNA與大分子量物質(zhì)的分離，因此提取效果較差。從圖1可知，SDS-酚-氯仿抽提法僅在發(fā)酵的8、10 d提取出微生物的基因組。由于發(fā)酵8、10 d淀粉等大分子被降解，所以SDS-酚-氯仿抽提法能提取出微生物基因組。提取的基因組中可能含有酵母菌和霉菌的基因組，但是由于引物的特異性，可以特異擴增出細菌的V3區(qū)核酸序列，而擴增不出酵母菌和霉菌的核酸序列。

由于土壤基因組提取試劑盒能有效地促進微生物基因組DNA與大分子量物質(zhì)的分離，能有效沉淀基因組DNA，所以提取效果較好。采用土壤基因組提取試劑盒提取的基因組DNA長度都大于20 kb，由于擴增的模板僅有230 bp左右，所以能滿足擴增的要求，并且該提取方法提取的基因組沒有彌散帶，電泳條帶僅有一條，說明提取時較好地保存了片段的完整性，其他樣品基因組的提取都采用土壤基因組提取試劑盒的方法提取。

2.2 引物擴增V3區(qū)的退火溫度優(yōu)化

從圖2可以看出，在設(shè)定的退火溫度52、53、54 ℃都能擴增出目的條帶，退火溫度為54 ℃時，擴增出的條帶最亮，這說明擴增的條帶DNA濃度大，符合DGGE上樣要求。當退火溫度為54 ℃時，條帶大小在230 bp附近，這與目的條帶大小較為接近，而且DNA含量較高，因此該溫度為最優(yōu)退火溫度。

以提取的所有樣品的基因組DNA為模板，采用帶GC的引物擴增產(chǎn)物，瓊脂糖電泳結(jié)果如圖3所示。所有樣品擴增的PCR產(chǎn)物條帶單一，亮度較亮，能滿足DGGE電泳的要求。

2.3 DGGE 電泳條件優(yōu)化

DGGE凝膠電泳條件受多種因素的影響，經(jīng)過多次條件優(yōu)化得到結(jié)果較好的兩個電泳條件：140 V電泳7 h和120 V電泳8 h，電泳結(jié)果如圖4所示。從圖4可知，電泳條件為140 V、電泳7 h得到的條帶寬度大，不能把電泳遷移距離小的條帶相互分離開，不能達到充分分離不同序列的目的。

120 V電泳8 h得到的條帶可以充分分離條帶，而且電泳條帶較多，這說明該條件可以用于樣品條帶中序列多樣性的分析，因此選擇120 V、電泳8 h的條件作為電泳的最佳條件。

2.4 DGGE條帶切割位點優(yōu)化

用最佳條件120 V電泳8 h，電泳條帶顯色后切割。條帶與膠孔底部的距離相同，表明是序列相同的條帶，條帶與膠孔底部的距離不同，則表明是不同的條帶。選取不同的條帶，切割清晰、亮度大、附近雜帶少的條帶。經(jīng)過分析，有22個不同的序列，切割序列的位置如圖5所示。從條帶分布來看，5、6、22號條帶對應的序列在發(fā)酵的不同階段含量有變化，表明這3個序列對應的細菌在釀造期間數(shù)量變化大，而且僅在釀造的某個階段存在。10號條帶在整個釀造過程中都有，而且在發(fā)酵后期對應的序列濃度增大，這表明該條帶對應的細菌數(shù)量在逐漸增加。

2.5 菌種比對結(jié)果

如表1所示，序列測序后對比鑒定得到22種細菌，其中可培養(yǎng)的有20種，不可培養(yǎng)的有2種。PCR-DGGE分析顯示，食果糖乳桿菌（Lactobacillus fructivorans）、龍舌蘭芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）、海洋細菌（Uncultured Oceanobacillus sp.）、枝芽孢桿菌（Virgibacillus）、腸桿菌科細菌（Enterobacteriaceae bacterium）、面包乳桿菌（Lactobacillus panis）、泛酸枝芽孢桿菌（Virgibacillus pantothenitus）、食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）及擬桿菌（Uncultured bacteroidetes）在整個釀造過程中都存在。

2.6 細菌釀造性能分析

經(jīng)比較分析，清香型小曲白酒中具有釀造功能的細菌有：雞葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、假單胞菌、肉芽腫桿菌、分散泛菌[5]、腸桿菌科細菌、云南微球菌[6]、發(fā)光桿菌、人葡萄糖球菌、食竇魏斯氏菌[7]。這些細菌在釀造過程中對提升酒的產(chǎn)量或質(zhì)量沒有作用，其自身的生長代謝消耗一定的營養(yǎng)物質(zhì)，其中雞葡萄球菌的代謝產(chǎn)物對酒品質(zhì)沒有影響，但菌株本身在特定條件下具有一定致病性[8]；肺炎克雷伯菌和肉芽腫桿菌的代謝產(chǎn)物對酒品質(zhì)沒有影響，但菌株本身產(chǎn)生非揮發(fā)性的毒素，在特定條件下具有一定致病性[9，10]；人葡萄糖球菌的代謝產(chǎn)物對酒品質(zhì)沒有影響，但菌株本身在特定條件下具有一定致病性[11]。

阿耶波多芽孢桿菌在發(fā)酵過程中分解纖維素，產(chǎn)酸、生香味物質(zhì)，產(chǎn)生香味物質(zhì)的前體物質(zhì)，產(chǎn)生淀粉酶等，對提升酒的產(chǎn)量或風味具有一定作用[12]；食果糖乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生乳酸；短纖丁酸梭菌產(chǎn)生丁酸，對風味物質(zhì)的形成具有一定作用；解淀粉芽孢桿菌具有葡萄糖苷酶、淀粉酶活性，能夠強烈抑制引起食品腐敗的真菌，產(chǎn)生風味前體類物質(zhì)；龍舌蘭芽孢桿菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)酸、香味物質(zhì)、香味物質(zhì)的前體物質(zhì)、淀粉酶等，菌株對提升酒的產(chǎn)量或風味具有一定作用[13]；枝芽孢桿菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生香味物質(zhì)、香味物質(zhì)的前體物質(zhì)；面包乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸；凝結(jié)芽孢桿菌能產(chǎn)生乳酸，對風味物質(zhì)的形成具有一定作用；食酸叢毛單胞菌不能發(fā)酵多數(shù)糖類，對真菌有一定的抑制作用；泛酸枝芽孢桿菌產(chǎn)生泛酸。

解淀粉芽孢桿菌、食酸叢毛單胞菌還具有抑制腐敗霉菌的作用，這些菌的存在可以減少腐敗霉菌侵入到釀造體系帶來的副作用。在細菌體系中，大部分是有益菌，對釀造有害的細菌沒有檢測到，這可能是觀音土曲不含耐熱的有害菌，或者是觀音土曲中的有害菌在糖化階段由于高溫環(huán)境大都被殺滅，而且釀造的低溫和相對較高的酒精度可抑制有害細菌的滋生。芽孢桿菌屬和乳酸菌屬是細菌的優(yōu)勢種屬。芽孢桿菌屬和乳酸菌屬細菌的釀造功能主要是產(chǎn)生香味成分或香味成分的前體物質(zhì)，是清香型小曲白酒風味形成的主要功能菌。

在發(fā)酵14 d和發(fā)酵7 d侵入到釀造體系的兩種傾向有害菌肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和肉芽腫桿菌（Klebsiella granulomatis）產(chǎn)生非揮發(fā)性的毒素，非揮發(fā)性的毒素在蒸餾階段滯留在酒醅中。蒸餾工藝具有把毒素與酒體分離的功能，從而確保酒的品質(zhì)安全。

3 小結(jié)與討論

研究結(jié)果表明，土壤試劑盒法提取酒醅中微生物基因組DNA效果較SDS氯仿抽提法好；PCR退火溫度選擇54 ℃，得到的條帶較亮；DGGE選擇電壓120 V電泳8 h能獲得最好的結(jié)果。在采用DGGE分析酒曲細菌區(qū)系組成時，在糖化和發(fā)酵階段都檢測到不可培養(yǎng)的細菌，與Zoetendal等[14]研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果也驗證了DGGE鑒定微生物的優(yōu)勢，可對不能培養(yǎng)或未培養(yǎng)的微生物進行鑒定分析。

參考文獻：

[1] 孟 鎮(zhèn)，徐澤江，鐘其頂，等.微生物群落多樣性分析方法在白酒工業(yè)中的應用研究進展[J].食品科學，2011，32（2）：97-100.

[2] GARLAND J L，MILLS A L. Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community-level sole-carbon-source utilization[J].Applied Environmental Microbiology，1991，57（8）：2351-2359.

[3] 鐘文輝，蔡祖聰.土壤微生物多樣性研究方法[J].應用生態(tài)學報，2004，15（5）：899-904.

[4] 張寶濤，王立群，伍寧豐，等.PCR-DGGE技術(shù)及其在微生物生態(tài)學中的應用[J].生物信息學，2006，4（3）：132-134.

[5] WU L，BIRCH R G.Characterization of Pantoea dispersa UQ68J： Producer of a highly efficient sucrose isomerase for isomaltulose biosynthesis[J].Journal of Applied Microbiology， 2004， 97（1）：93-103.

[6] 張 爽，潘華奇，任大明，等.海洋細菌B177的鑒定及活性物質(zhì)研究[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，2011，18（3）：26-29.

[7] 饒 瑜，常 偉，向文良，等.抗食品腐敗酵母的乳酸菌的篩選與鑒定[J].現(xiàn)代食品科技，2013，22（8）：1943-1947.

[8] 余道軍，陳岳明，俞少勇，等.雞葡萄球菌的生物學特性及快速鑒定[J].中國微生態(tài)學雜志，2008，15（2）：23-26.

[9] 李 彬.肺炎克雷伯菌的分子流行病學及分子耐藥機制研究[D].濟南：山東大學，2012.

[10] 蔡 林，張建中.用PCR-RFLP技術(shù)檢測皮膚感染性肉芽腫組織中的分支桿菌[J].北京大學學報（醫(yī)學版），2004，35（5）：34-36.

[11] 項 勛，段 綱，李志敏.牛體中人葡萄球菌的分離與鑒定[J].四川畜牧獸醫(yī)，2004，55（10）：33-35.

[12] 王 怡，何奉芹，羅 琳，等.釀造細菌分解纖維素的初步研究[J].中國釀造，2011，45（12）：32-35.

[13] 劉曉玲，王金晶，李永仙，等.產(chǎn)β-1，3-1，4-葡聚糖酶特基拉芽孢桿菌Bacillus tequilensis CGX5-1發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].食品與生物技術(shù)學報，2013，34（6）：12-15.

[14] ZOETENDAL E G，BEN-AMOR K，HARMSEN H J M，et al. Quantification of uncultured ruminococcus obeum-like bacteria in human fecal samples by fluorescent in situ hybridization and flow cytometry using 16s rRNA-targeted probes[J].Appl Environ Microbiol，2002，68（9）：4225-4232.