摘要：以模式生物果蠅為模型，研究了谷胱甘肽（1 mmol/L）對氯化汞（400 μmol/L）致果蠅腸損傷的影響。結(jié)果表明，谷胱甘肽對氯化汞所致果蠅腸道損傷有一定的保護作用。1 mmol/L 谷胱甘肽顯著抑制 400 μmol/L氯化汞所致果蠅腸道上皮活性氧的產(chǎn)生、細胞凋亡以及腸道干細胞的分裂。

關(guān)鍵詞：氯化汞；果蠅；谷胱甘肽

中圖分類號：Q969.44 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2849-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.034

氯化汞（HgCl2）是一種常見的重金屬污染物。HgCl2可致包括神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟、腸道在內(nèi)的多種組織和器官損傷。目前研究認為活性氧（ROS）的產(chǎn)生以及氧化損傷是汞中毒造成組織損傷的主要機制之一[1]。谷胱甘肽（GSH）是生物體內(nèi)存在的一種含有巰基的化合物，具有抗氧化、清除自由基、解毒等功能。

相比于其他的模式生物而言，果蠅具有繁育周期短、易于飼養(yǎng)、遺傳手段豐富等眾多優(yōu)勢。這些優(yōu)點使得果蠅成為研究遺傳學和發(fā)育生物學最為理想的模型[2]。序列分析顯示果蠅是與人類關(guān)系最為密切的無脊椎模式生物[3，4]。超過70%的人類基因在果蠅上都可以找到其同源物[5]。因此，近年來果蠅成為研究毒理學的優(yōu)秀模型[6]。Chen等[7]研究證實模式生物果蠅以其獨特的生物學優(yōu)勢可以用于汞中毒的機制研究。研究表明，氯化汞（HgCl2）可致果蠅腸道上皮ROS產(chǎn)生異常并造成腸上皮氧化損傷[7]。本研究以模式生物果蠅為模型探討外源性抗氧化劑GSH對HgCl2所致果蠅腸道損傷中的影響，以期為研究HgCl2中毒的作用機制和防治措施提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

試驗用果蠅品系為w1118。將上述果蠅品系用標準玉米培養(yǎng)基飼養(yǎng)，在25 ℃、相對濕度60%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

試驗用一抗為Rabbit anti phospho histone H3（PH3）（Millipore），二抗為Goat anti rabbit IgG-Alexa Fluor 488（Invitrogen）。果蠅腸道上皮細胞內(nèi)活性氧檢測采用2，7二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCF-DA）活性氧檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所），細胞凋亡檢測采用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（Millipore）。利用Nikon A1R-si激光共聚焦顯微鏡進行圖像采集。

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)試驗 收集150只3日齡成年果蠅，在空的培養(yǎng)管中饑餓2 h，然后隨機分為對照組，HgCl2處理組，GSH和HgCl2共處理組，每組50只果蠅，雌雄各半。將上述各組果蠅分別轉(zhuǎn)移到鋪有3 cm× 2 cm濾紙的培養(yǎng)管中。對應上述各組濾紙分別添加50 μL的5%蔗糖水、400 μmol/L HgCl2、1 mmol/L GSH和400 μmol/L HgCl2混合液。HgCl2和GSH用5%的蔗糖溶解。濾紙每天更換2次，飼喂3 d后解剖果蠅腸道用于后續(xù)試驗。

1.2.2 免疫熒光染色 解剖腸道，用4%甲醛溶液固定30 min，吸棄甲醛，用PBS洗滌2次，然后加入500 μL 0.1% PBST溶液，通透10 min，PBS洗滌3次。一抗孵育4 ℃過夜，PBS洗滌3次，每次10 min。添加熒光二抗，室溫避光2 h。吸棄二抗，PBS洗滌3次。DAPI孵育10 min。吸棄DAPI，PBS洗滌3次，每次10 min。

1.2.3 活性氧和細胞凋亡檢測 解剖果蠅腸道，然后按照TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（Millipore）說明書進行細胞凋亡檢測；按照DCF-DA活性氧檢測試劑盒說明書進行細胞活性氧檢測。

1.2.4 統(tǒng)計分析 統(tǒng)計每只果蠅中腸平均PH3陽性細胞數(shù)以及每條中腸的同一指定區(qū)域內(nèi)（100 μm×100 μm）TUNEL陽性的細胞數(shù)目。使用Image J軟件計算果蠅平均每條中腸的同一指定區(qū)域內(nèi)（150 cm×150 cm）DCF-DA熒光信號強度。用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用單因素方差分析（ANOVA）進行組間差異的顯著性檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 GSH對果蠅腸道細胞凋亡的影響

由圖1可知，HgCl2飼喂3 d后凋亡的果蠅腸道上皮細胞數(shù)量顯著高于蔗糖處理組，而飼喂HgCl2和GSH共處理組的果蠅腸道上皮細胞凋亡數(shù)顯著低于HgCl2處理組（P<0.05）。

2.2 GSH對果蠅腸道活性氧產(chǎn)生的影響

ROS的產(chǎn)生是生物應對各種刺激的一種重要保護機制。果蠅腸道內(nèi)ROS的產(chǎn)生可以抵抗病原菌的侵襲。但是腸道內(nèi)ROS過度產(chǎn)生會造成腸道組織損傷甚至引起果蠅死亡[8]。由圖2可知，HgCl2處理可顯著提高果蠅腸道上皮細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。HgCl2和GSH共處理組的果蠅腸道上皮細胞ROS產(chǎn)生顯著低于HgCl2處理組（P<0.05）。

2.3 GSH對果蠅腸道干細胞細胞分裂的影響

果蠅腸道干細胞是存在于腸內(nèi)的一類能夠分裂和分化的細胞。腸道干細胞的分裂對于維持果蠅腸道正常的形態(tài)以及功能至關(guān)重要。磷酸化組蛋白H3（PH3）是用于鑒定處于分裂期細胞的特異性標記物。由圖3可知，HgCl2處理組果蠅腸道細胞分裂顯著快于對照組。HgCl2和GSH共處理組的果蠅腸道上皮細胞分裂顯著低于HgCl2處理組（P<0.05）。

3 討論

汞是毒性很強的重金屬，它在機體內(nèi)不僅能與GSH等抗氧化物結(jié)合，降低體內(nèi)消除消除自由基的能力，而且會造成機體內(nèi)自由基異常產(chǎn)生并引起組織器官的氧化損傷[9]。本研究以果蠅腸道為模型研究外源性GSH對HgCl2所致的果蠅腸道氧化損傷中的作用，發(fā)現(xiàn)GSH可以顯著抑制HgCl2所致的腸道上皮細胞的凋亡以及ROS的產(chǎn)生，這些結(jié)果表明外源性GSH對HgCl2所致的果蠅腸道氧化損傷具有一定程度的保護作用。

同哺乳動物一樣，果蠅腸道在應對體內(nèi)外各種生物、物理、化學刺激時會加快干細胞分裂以應對組織損傷[10，11]。因此，在一定程度上腸道干細胞分裂狀況可以作為腸道損傷的重要參考指標[7]。本試驗結(jié)果顯示，HgCl2和GSH共處理的果蠅腸道細胞分裂情況顯著低于HgCl2處理組，該結(jié)果進一步表明還原型GSH顯著降低了HgCl2所致的腸道損傷。

目前，汞中毒的作用機制尚不清楚，但已有研究表明，ROS的產(chǎn)生是汞中毒的重要機制之一。汞可以造成細胞內(nèi)ROS異常生成同時抑制機體的抗氧化系統(tǒng)并最終造成組織器官的氧化損傷[12]。GSH是機體內(nèi)存在的一種重要的水溶性抗氧化物質(zhì)，是機體抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分。本試驗中外源性GSH在HgCl2所致的果蠅腸道氧化損傷中顯示的保護作用很可能是因為外源性GSH與汞直接結(jié)合形成穩(wěn)定的復合物，從而抑制了汞的毒性并對GSH代謝酶的活性起到了保護作用。

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