摘要：為了考察蟾酥醇提取物的體外抗炎作用，用LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞建立細(xì)胞炎癥模型，采用Griess法測定蟾酥醇提取物對細(xì)胞上清液中的NO水平，ELISA法測定TNF-α、IL-lβ、IL-6含量，熒光法測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果顯示，蟾酥醇提取物對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞所分泌的炎癥因子（NO、TNF-α、IL-1β、IL-6）有明顯的抑制作用，與空白對照組相比明顯降低，同時(shí)蟾酥醇提取物極顯著降低LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平（P<0.01）。由此推測，蟾酥醇提取物通過抑制炎癥因子、降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平減輕細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，具有良好的抗炎作用。

關(guān)鍵詞：蟾酥醇提取物；RAW 264.7細(xì)胞；小鼠腹腔巨噬細(xì)胞；體外抗炎；炎癥因子

中圖分類號：R282.74 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2843-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.032

蟾酥別名又稱蛤蟆漿、蛤蟆酥、蟾酥眉脂[1]。蟾酥辛溫，有毒，具解毒、開竅醒神和止痛之功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，蟾酥具有抗腫瘤、抗放射、改善全身狀況、抗炎、恢復(fù)細(xì)胞免疫功能、提升白血球、緩解癌性疼痛等藥理作用[1]。蟾酥具有良好的抗炎作用，但是當(dāng)前針對蟾酥抗炎的報(bào)道多集中在蟾酥制劑的抗炎水平[2，3]，對蟾酥分類、分段提取物的抗炎研究并不多見。在前期研究中，筆者對蟾酥進(jìn)行了醇處理，獲得了主要成分為脂溶性華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的蟾酥醇提取物。因此，本研究的主要目的是以脂多糖（LPS）誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞建立炎癥細(xì)胞模型，初步探討蟾酥醇提取物的體外抗炎作用，為更進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

蟾酥醇提取物的制備：將蟾酥粉碎，取蟾酥粉末按質(zhì)量體積比加10倍量95%乙醇，浸泡7 d，離心，取上清液，過濾，濾液即為蟾酥醇提取物，經(jīng)HPLC檢測每1 mL含華蟾酥毒基和酯蟾毒配基分別為119.96 μg/μL和85.22 μg/μL。

細(xì)胞株：小鼠單核/巨噬細(xì)胞株RAW264.7購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞庫。

試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清、0.05%胰蛋白酶-EDTA均為Gibco產(chǎn)品；（MTT）、L-谷氨酰胺、LPS均為Sigma公司產(chǎn)品；活性氧試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；TNF-α、IL-lβ、IL-6細(xì)胞因子檢測試劑盒均購自于上海勁馬生物科技有限公司；PBS購自索萊寶生物科技有限公司；DMSO購自楚杰生物科技有限公司。

1.2 RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)

復(fù)蘇后的RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)為0.1的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。傳代3次以上，細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，即用于試驗(yàn)。

1.3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備

給小鼠腹腔注射6%無菌淀粉溶液，48 h后頸椎脫臼處死小鼠，于75%乙醇中浸2～3 min，剪開腹部，暴露腹膜，緩慢注入PBS，吸取腹腔液。重復(fù)灌洗2～3次，灌洗液1 000 r/min離心5 min，加入Tris-NH4Cl，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育10 min，1 000 r/min離心 5 min，用PBS洗1次，用無血清 RPMI-1640培養(yǎng)液洗1次，用 RPMI-1640完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，200 μm濾網(wǎng)過濾，計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色活細(xì)胞>95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL。

1.4 分組與處理

細(xì)胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至次日，棄上清，每孔加入400 μL或200 μL的不同劑量的蟾酥醇提取物（用培養(yǎng)液稀釋），在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h后加入10 μL終濃度為10 μg/mL的LPS。試驗(yàn)設(shè)蟾酥醇提取物（以華蟾酥毒基成分計(jì)）高劑量組（24 mg/L）、中劑量組（12 mg/L）、低劑量組（6 mg/L）、空白對照組、LPS對照組，每組4個(gè)重復(fù)。

1.5 MTT法檢測蟾酥醇提取物對細(xì)胞存活率影響的檢測

細(xì)胞以1×106個(gè)/mL的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板過夜，作用48 h后，每孔加入10 μL MTT（濃度為5 mg/mL），在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，棄上清，每孔加入100 μL DMSO，微振蕩10 min后測定OD490 nm。

1.6 Griess法測定細(xì)胞上清液中的NO水平

藥物作用細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞上清液。于96孔板中每孔加入50 μL細(xì)胞上清液，再分別加入 50 μL Griess ReagentⅠ和50 μL Griess ReagentⅡ，微振蕩搖勻，避光反應(yīng)10 min，測定OD450 nm。

1.7 ELISA法檢測細(xì)胞上清液中的TNF-α、IL-lβ、IL-6含量

藥物作用細(xì)胞24 h后取細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，測定TNF-α、IL-lβ、IL-6含量。

1.8 熒光法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平

按照活性氧檢測試劑盒說明書操作。藥物作用細(xì)胞8 h后，用PBS洗2～3次，每孔加稀釋1 000倍的探針液200 μL，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，棄去探針，PBS洗3次以上，每孔加500 μL PBS，用細(xì)胞刷把細(xì)胞刷下，吹勻，每孔取100 μL到熒光酶標(biāo)板，避光，用熒光酶標(biāo)儀（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm）測定熒光強(qiáng)度。

1.9 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間比較采用單因素ANOVA分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟾酥醇提取物對細(xì)胞存活率的影響

由圖1可知，蟾酥醇提取物在6～24 mg/L（最大濃度）范圍內(nèi)鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)無改變，各給藥組的OD490 nm與空白對照組比較無顯著差異，表明該藥物在此劑量范圍內(nèi)無顯著細(xì)胞毒性作用。

2.2 蟾酥醇提取物對細(xì)胞釋放NO的影響

由圖2可知，LPS刺激后，細(xì)胞上清液中產(chǎn)生了大量的NO，而高、中、低劑量的蟾酥醇提取物皆極顯著抑制NO的釋放（P<0.01）。

2.3 蟾酥醇提取物對細(xì)胞分泌TNF-α、IL-lβ、IL-6的影響

由圖3、圖4、圖5可知，空白對照組的兩種細(xì)胞上清液中的TNF-α、IL-lβ、IL-6水平較低，在添加了10 μg/mL LPS后濃度明顯增加，而當(dāng)有蟾酥醇提取物存在后，TNF-α、IL-lβ、IL-6的分泌受到明顯抑制，并存在一定的量效關(guān)系。

2.4 蟾酥醇提取物對細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

由圖6可知，LPS可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS，而藥物作用后，高、中、低劑量蟾酥醇提取物極顯著降低RAW264.7細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞的ROS水平（P<0.01），并存在一定的量效關(guān)系。

3 討論

LPS是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的組成成分，又稱內(nèi)毒素。內(nèi)毒素所致炎癥反應(yīng)是復(fù)雜的病理生理過程，多細(xì)胞因子通過調(diào)節(jié)促炎和抗炎系統(tǒng)之間的平衡而參與炎癥發(fā)生、發(fā)展過程。研究表明，經(jīng)LPS刺激后，機(jī)體首先表達(dá)TNF-α，然后引起巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌其他細(xì)胞因子[4]。在天然免疫中，LPS可直接刺激單核吞噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，而細(xì)胞因子可調(diào)節(jié)其他類型細(xì)胞功能，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中有重要作用。

Lang等[5]發(fā)現(xiàn)在活化的巨噬細(xì)胞，IL-10的分泌增加且抑制TNF-α、IL-1β、IL-6的合成。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)蟾酥醇提取物不同程度地抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的TNF-α、IL-1β、IL-6濃度，但這種抑制作用是否促進(jìn)了IL-10的合成還有待進(jìn)一步的研究。在急性和慢性炎癥中，NO是重要的致炎因子[6]。它是由一氧化氮合酶（NOS）催化合成。目前已知3種NOS，分別為神經(jīng)型（nNOS）、內(nèi)皮型（eNOS）和誘導(dǎo)型（iNOS）[7]。iNOS在炎癥和前致炎因子的誘導(dǎo)下表達(dá)量增高，并對炎癥過程產(chǎn)生重要影響。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)蟾酥醇提取物明顯抑制了NO的合成。由此推測蟾酥醇提取物的抗炎效應(yīng)與抑制炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生有關(guān)。

自由基是機(jī)體內(nèi)的一種不可缺少的活性元素，對生物體既有益又有害。正常情況下，生物體內(nèi)有一套完整的抗氧化體系，可以維持自由基的代謝平衡。但當(dāng)機(jī)體在某些疾病或外源性物質(zhì)入侵后，自由基代謝可能會發(fā)生異常，從而誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并可能導(dǎo)致組織細(xì)胞發(fā)生氧應(yīng)激性損傷[8-10]。本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，LPS可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，但當(dāng)蟾酥醇提取物存在時(shí)細(xì)胞內(nèi)ROS水平極顯著降低，初步推測蟾酥醇提取物可能是通過抗氧化的作用從而對抑制細(xì)胞的炎性反應(yīng)，改善細(xì)胞的狀態(tài)。

本研究結(jié)果顯示，與空白對照組相比，經(jīng)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞的炎癥因子TNF-α、IL-1、和NO的分泌水平明顯增加、細(xì)胞內(nèi)ROS水平極顯著升高，表明體外炎癥模型構(gòu)建成功。蟾酥醇提取物對LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞所釋放的炎癥因子（NO、TNF-α、IL-1β、IL-6）有明顯的抑制作用，同時(shí)極顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。由此表明，蟾酥醇提取物通過抑制炎癥因子、降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平減輕細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，具有良好的抗炎作用，且其抗炎效果具有一定的量效關(guān)系。其對炎癥因子的抑制作用為進(jìn)一步研究蟾酥醇提取物抗LPS機(jī)制打下良好基礎(chǔ)，也為蟾酥醇提取物進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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