摘要：從污染水域篩選獲得了1株可在含有100 mg/L Cd2+的培養(yǎng)基上生長的耐鎘菌株Cd-t1。通過形態(tài)觀察、16S rDNA擴增及系統(tǒng)發(fā)育分析，將其初步鑒定為嗜堿性假單胞菌（Pseudomonas alcaliphila）。不同Cd2+濃度處理下菌株的生長曲線顯示，各濃度Cd2+處理延緩了該菌株的生長時期。進一步利用掃描電鏡、能譜分析與質(zhì)粒消除試驗發(fā)現(xiàn)，該菌株的Cd2+耐受性與其形態(tài)適應(yīng)性變化和C、N、O、P、Na、K、Ca等元素含量的改變相關(guān)，并決定于質(zhì)粒上的鎘耐受基因。

關(guān)鍵詞：鎘污染；假單胞桿菌；16S rDNA；能譜分析；掃描電子顯微鏡

中圖分類號：Q939.99 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2765-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.014

有色金屬采選和冶煉、鎘化合物工業(yè)、電池制造業(yè)等排放的含鎘廢水使中國部分地區(qū)耕地土壤受到不同程度的鎘污染[1，2]，而這些土壤中的鎘會通過食物鏈向人類轉(zhuǎn)移并在肝臟蓄積[3，4]。鎘在與含巰基、羥基的蛋白質(zhì)分子結(jié)合后，會通過血液循環(huán)轉(zhuǎn)移到腎臟，引起肝、腎等內(nèi)臟器官及血液循環(huán)系統(tǒng)損傷，并致癌和致突變[5，6]。因此，鎘污染的治理和修復(fù)具有十分重要的現(xiàn)實意義。但是，用于重金屬污染治理的傳統(tǒng)物理和化學(xué)方法費用高、能耗大，并易造成二次污染。而生物修復(fù)法作為新興的重金屬修復(fù)技術(shù)備受關(guān)注。其中，微生物特別是細菌以其數(shù)量眾多、代謝活動旺盛在重金屬的生物吸附中具有較好的應(yīng)用前景[7]。

本研究從鎘污染水域中分離獲得1株耐鎘菌株Cd-t1，在利用形態(tài)觀察結(jié)合16S rDNA序列分析了其系統(tǒng)發(fā)育地位后，對不同Cd2+濃度處理下的菌株生長狀況、形態(tài)特征及元素的積累狀況進行了檢測和觀察，并對鎘耐受基因進行了初步的定位，以期為進一步的基因克隆及構(gòu)建高效耐鎘菌株奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株的篩選

試驗水樣于2011年8月取自渭河楊凌段。樣品接種于含30 mg/L CdCl2的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上（牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，NaCl 1.5%，瓊脂粉2%，pH 7.2），以平板劃線法分離菌株，培養(yǎng)獲得單菌落。將其命名為Cd-t1，并接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上保存、備用。

1.2 菌株的16S rDNA鑒定

依據(jù)文獻[8]提取菌株Cd-t1的基因組DNA，利用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′進行16S rDNA擴增，引物由Takara公司合成。使用TaKaRa premix TaqTM擴增目的片段，PCR反應(yīng)體系（50 μL）為：PCR Premix 25 μL，上下游引物（10 pmol）各0.5 μL，模板（300 ng/μL）1 μL，16S-free H2O 23 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性60 s，55 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，共進行30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)照相。

PCR產(chǎn)物送Takara公司測序，測序結(jié)果在NCBI上進行BLAST分析，并利用MEGA 4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 不同鎘濃度處理下菌株的生長曲線

挑取Cd-t1單菌落在分別含有0、10、20、30、40、50 mg/L CdCl2的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中于28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。期間，每2 h取樣并在600 nm下測定吸光度，檢測細菌生長狀況。每種處理3個重復(fù)，計算平均值。

1.4 菌株的掃描電鏡觀察

菌株Cd-t1在分別含有0、20、40、60、80、100 mg/L CdCl2的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)后，參考郭瑞軍等[9]的方法，挑取單菌落進行掃描電鏡樣品制備。樣品經(jīng)2.5%戊二醛固定4 h后，經(jīng)0.1 mol/L PBS（pH 7.2）洗滌3次（每次10 min），梯度濃度乙醇50%-70%-83%-95%-100%干燥（每級15 min，其中無水乙醇干燥兩次），乙酸異戊酯置換10 min后，用CO2臨界點干燥儀干燥、噴金，并在場發(fā)射掃描電子顯微鏡（Hitachi S-4800）下觀察菌體形態(tài)和照相。

1.5 菌株的能譜分析

利用X射線能譜分析儀（EDAX GENESIS XM2 SYSTEM 60x）對菌株Cd-t1微區(qū)進行能譜分析，檢測C、N、O、Na、Mg、Al、Si、P、Pt、Cd、K、Ca元素相對含量（質(zhì)量分數(shù)），加速電壓為15 kV。試驗重復(fù)3次，計算平均值。

1.6 質(zhì)粒的消除

參考段學(xué)軍等[6]的方法進行質(zhì)粒消除試驗。將分離得到的菌株Cd-t1接種于含有20 mg/L SDS的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，43 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。再蘸取菌液，在含30 mg/L Cd2+或不含Cd2+的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上劃線，于28 ℃恒溫過夜培養(yǎng)，觀察菌落生長情況。每處理3個重復(fù)，以未進行質(zhì)粒消除的菌株Cd-t1作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的16S rDNA分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

經(jīng)反復(fù)劃線純化后，篩選得到1株在含30 mg/L Cd2+的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上生長良好的菌株，命名為Cd-t1。其菌落呈白色，表面光滑濕潤，邊緣整齊，較黏稠，不易挑起。

以菌株Cd-t1基因組DNA為模版，采用細菌通用引物進行16S rDNA擴增，在1 500 bp左右可觀察到明顯條帶（圖1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序得到1 406 bp序列，在Genebank注冊后（KP319030），進行序列相似性分析。結(jié)果顯示，菌株Cd-t1與嗜堿性假單胞菌（Pseudomonas alcaliphila）、蒙氏假單胞菌（P. monteilii）等假單胞菌屬（Pseudomonas）菌株16S rDNA序列同源性較高。采取MEGA 4.0軟件包中Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株Cd-t1與嗜堿性假單胞菌（P. alcaliphila）聚為一支（圖2），同源性達到99%。因此，可初步將菌株Cd-t1鑒定為嗜堿性假單胞菌。

2.2 不同鎘濃度處理下假單胞桿菌的生長曲線

從圖3可以看出，在不同Cd2+濃度處理下，菌株Cd-t1都呈現(xiàn)較為平滑的生長曲線。但菌株Cd-t1進入生長穩(wěn)定期的時間比對照明顯滯后，而且Cd2+濃度越高，滯后作用越明顯，尤其是在50 mg/L Cd2+處理下，菌株Cd-t1的滯后期達到72 h以上。當菌株Cd-t1在Cd2+濃度50～100 mg/L范圍內(nèi)培養(yǎng)時，菌株仍可達到對數(shù)生長期，但滯后作用明顯加強（數(shù)據(jù)未顯示）。但是在穩(wěn)定期，對照與不同Cd2+濃度處理的OD600 nm值差異較小。這表明菌株Cd-t1可能具有較強的Cd2+耐受能力，不同濃度的Cd2+處理可能主要延緩了菌株Cd-t1的生長時期。

2.3 不同鎘濃度處理下假單胞桿菌的形態(tài)特征

分別取在含有0、20、40、60、80、100 mg/L Cd2+的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)的菌株Cd-t1，置掃描電鏡下觀察其形態(tài)改變。當培養(yǎng)基中添加有Cd2+時，菌株Cd-t1的生長密度較對照明顯下降，說明不同濃度的Cd2+處理均延緩了菌株的生長。此外，當Cd2+濃度在60 mg/L以下時，菌株Cd-t1的形態(tài)和對照相比沒有明顯改變，都呈桿狀；當Cd2+濃度為80和100 mg/L時，菌株Cd-t1形態(tài)呈米粒狀，短而圓，同時，菌株表面粗糙，有褶皺（圖4）。這說明較低的Cd2+濃度對菌株Cd-t1形態(tài)發(fā)育影響較小，而較高的Cd2+濃度會影響菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2.4 高濃度鎘處理下假單胞桿菌的元素相對含量

為進一步研究菌株Cd-t1對Cd2+的吸附狀況和其他元素的相對含量變化，利用X-射線能譜儀檢測了高濃度（80和100 mg/L）Cd2+處理下微區(qū)的C、N、O、Na、Mg、Al、Si、P、Pt、Cd、K、Ca等元素的相對含量。結(jié)果表明，除Mg、Al元素部分處理未檢出，Si含量測定易受載玻片影響外，Cd、C、N、O、P、Pt元素含量增加，而Na、K、Ca元素含量下降（圖5、表1）。其中，C、N、P元素的增幅最為明顯，在Cd2+處理濃度為80 mg/L時分別達到對照的1.31、1.79、7.09倍；在Cd2+處理濃度為100 mg/L時分別達到對照的1.42、2.36和8.14倍。在Cd2+處理濃度為80 mg/L時，Na為對照的80.88%，K為對照的77.08%，Ca為對照的39.02%；在Cd2+處理濃度為100 mg/L時，Na為對照的77.39%，K為對照的56.25%，Ca為對照的39.58%。

2.5 質(zhì)粒的消除

在利用SDS進行質(zhì)粒消除后，菌株Cd-t1在不含Cd2+的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上生長良好，但在含有30 mg/L Cd2+的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上不能生長；而未進行質(zhì)粒消除試驗的菌株Cd-t1在含有和不含Cd2+的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上均生長良好（圖6）。這說明菌株對于Cd2+的耐受性是由質(zhì)粒決定的，在質(zhì)粒消除后，菌株對Cd2+的耐受性隨之消失。

3 討論

假單胞菌屬是具有重金屬抗性的最重要的細菌類群之一。目前，已在水稻根際[10]、污染土壤[11]、污染水域[12]、污染河泥[13]等處分別分離到耐鎘的假單胞菌屬菌株。這些假單胞菌可能利用其對重金屬的抗性，將鎘等重金屬在體內(nèi)進行富集[14，15]。作者從鎘污染水域中通過連續(xù)的平板劃線獲得1株耐鎘菌株Cd-t1，通過形態(tài)觀察和16S rDNA序列分析將其鑒定為嗜堿性假單胞菌。然而，關(guān)于嗜堿性假單胞菌鎘耐受性的報道較少。為進一步確認篩選的嗜堿性假單胞菌的鎘耐受性及生長特征，在不同Cd2+濃度處理下檢測了菌株的生長情況。結(jié)果顯示，嗜堿性假單胞菌Cd-t1在Cd2+濃度0～100 mg/L范圍內(nèi)培養(yǎng)時均可良好生長，顯示了較好的鎘耐受性。掃描電鏡結(jié)果顯示，在較高濃度的Cd2+處理后，菌株生長未受到明顯抑制，但菌株形態(tài)發(fā)生了適應(yīng)性的變化。

為進一步研究嗜堿性假單胞菌Cd-t1在Cd2+處理下的元素組成狀況，采用能譜分析儀對微區(qū)內(nèi)樣品進行了化學(xué)元素的測定分析。其中，Cd、C、N、O、P、Pt元素含量增加，而Na、K、Ca元素含量下降。研究發(fā)現(xiàn)，嗜堿性假單胞菌能夠在堿性條件下分解有機物的同時，產(chǎn)生吩嗪-1-羧酸介體（Phenazine-1-carboxylic acid，PCA），該介體起到電子穿梭的作用，將有機物中的能量全部以電子的形式轉(zhuǎn)移到外電路，實現(xiàn)電子從有機物到電極的傳遞過程[16]，在此過程中還原銅、鎘等多種重金屬離子。當Cd2+占據(jù)鈣離子通道并進入細胞后，會干擾細胞鈣代謝、破壞胞內(nèi)的離子平衡狀態(tài)，使胞內(nèi)的Na+、K+等金屬離子運輸?shù)桨鈁17]。在離子運輸?shù)倪^程中，由于假單胞桿菌極強的溶磷能力[18]，促使磷和細胞膜上的特殊蛋白質(zhì)結(jié)合進入細胞[19]。

綜上所述，本研究篩選獲得了1株Cd2+耐受性較強的菌株Cd-t1，并通過16S rDNA擴增等方法將其初步鑒定為嗜堿性假單胞菌。掃描電鏡、能譜分析和質(zhì)粒消除試驗結(jié)果顯示，該菌株對Cd2+的耐受性與其形態(tài)適應(yīng)性變化和相關(guān)離子濃度改變有關(guān)，并決定于質(zhì)粒上的鎘耐受基因。這些研究為進一步闡明該菌株的Cd2+耐受機制、Cd2+耐受基因的克隆和精確定位，以及構(gòu)建和改造Cd2+耐受菌株并高效凈化環(huán)境Cd2+污染奠定了基礎(chǔ)。

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