摘要：鹽脅迫是影響植物生長發(fā)育及產(chǎn)量的重要非生物因素。一定濃度的鹽分可以通過滲透脅迫、離子脅迫等不同程度地傷害植物的細(xì)胞膜透性，并產(chǎn)生次級氧化脅迫，從而造成植物自身代謝紊亂及部分蛋白合成受阻等現(xiàn)象。植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可通過將Na+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞外或者將其區(qū)隔化于液泡中來抵御環(huán)境中過高的Na+，從而維持細(xì)胞內(nèi)正常的Na+水平及pH 等。目前已經(jīng)從多種植物中克隆到編碼Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，將這些基因轉(zhuǎn)入鹽敏感植物可大大提高植物的耐鹽性，對于開發(fā)鹽堿地及提高農(nóng)作物的產(chǎn)量具有非常重要的意義。主要概述了植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分子生物學(xué)研究及其與耐鹽性之間的關(guān)系。

關(guān)鍵詞：鹽脅迫；Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；NHX基因；耐鹽性

中圖分類號：Q816；Q945.12 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）11-2727-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.11.002

盡管植物在生長發(fā)育過程中需要必要的營養(yǎng)礦物元素，但是如果土壤中含有過量的可溶性鹽則會對大部分植物造成傷害。目前，土壤鹽漬化已經(jīng)上升為一個(gè)全球性問題，應(yīng)該引起人們的高度關(guān)注。據(jù)聯(lián)合國教科文組織（UNESCO）和聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）不完全統(tǒng)計(jì)，全世界鹽堿地面積約為9.54億hm2。全國第二次土壤普查數(shù)據(jù)顯示，中國鹽漬土總面積約3 600萬hm2，占全國可利用土地面積的4.88%，耕地中鹽漬化面積達(dá)到920.9萬hm2，占全國耕地面積6.62%[1]。然而隨著鹽堿地的不斷增加，植物體內(nèi)也形成了一定的防御措施。對于鹽敏感植物來說，鹽脅迫影響植物生長的原因主要是Na+毒害[2]。研究表明，植物消除Na+毒害的有效策略之一是通過細(xì)胞質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Membrane Na+/H+ exchanger or antiporter）將Na+排出胞外或者通過液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Vacuolar Na+/H+ exchanger or antiporter）將細(xì)胞質(zhì)中過多的Na+區(qū)域化在液泡中，這樣一方面可以降低過多的Na+對細(xì)胞質(zhì)的毒害，另一方面又可以將Na+作為一種有益的滲透調(diào)節(jié)劑來降低細(xì)胞的滲透勢[3]，從而使植物更好地適應(yīng)鹽漬生境。因此，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在植物耐鹽過程中扮演著重要的角色，對于更好地開發(fā)鹽堿地以及提高農(nóng)作物的產(chǎn)量具有非常重要的意義。目前，對于Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研究已經(jīng)受到學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注，成為植物耐鹽研究中的一個(gè)新亮點(diǎn)。

1 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的發(fā)現(xiàn)及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)

1.1 質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的發(fā)現(xiàn)及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)

目前，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已經(jīng)在很多物種的膜系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)。其中，植物質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白最先是在大麥（Hordeum vulgare）根中被發(fā)現(xiàn)[4]，質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SOS1）位于質(zhì)膜上，該蛋白主要參與植物的Na+外排作用，是植物抵抗鹽離子毒害的首個(gè)屏障。

在質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列中，都存在一個(gè)特別保守的Na+結(jié)合區(qū)，但是與液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不同，在質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中并沒有發(fā)現(xiàn)氨氯吡脒（Na+通道阻斷物）結(jié)合位點(diǎn)。植物質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的N端具有高度疏水性，并可能含有10～12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，這些跨膜結(jié)構(gòu)域與動物或微生物的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相當(dāng)相似[5]。同時(shí)，質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還含有一個(gè)較長的（約700個(gè)氨基酸殘基）親水性C端，該結(jié)構(gòu)面向細(xì)胞質(zhì)，可以跟那些調(diào)控該蛋白活性的諸多蛋白相互作用，從而達(dá)到調(diào)節(jié)Na+/H+運(yùn)輸，適應(yīng)鹽漬環(huán)境的目的[6]（圖1）。

1.2 液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的發(fā)現(xiàn)及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)

1985年Blumwald等[7]首先在甜菜（Beta vulgaris）根部貯藏組織中發(fā)現(xiàn)了植物液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NHX1）。該蛋白分布于前液泡區(qū)的兩極和液泡膜上，主要參與植物Na+的區(qū)域化作用，這樣一方面可以降低過多的Na+對細(xì)胞質(zhì)的毒害，另一方面又可以將Na+作為一種有益的滲透調(diào)節(jié)劑來降低細(xì)胞的滲透勢，從而同樣達(dá)到適應(yīng)鹽漬環(huán)境的目的。之后隨著科研人員對液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的不斷探索，許多具有液泡膜Na+/H+交換活性的植物被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，如：濱藜（Atriplex patens）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、冰葉日中花（Mesembryanthemum crystallinum）、長春花（Catharanthus roseus）、棉花（Gossypium hirsutum）、甜菜（Beta vulgaris）、向日葵（Helianthus annvvs）等[8]。

Yamaguchi等[9]對擬南芥的拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析（圖2）。分析表明，AtNHX1可以分為12個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)較長的親水C端結(jié)構(gòu)域?？缒^(qū)為疏水區(qū)域，含有Na+結(jié)合的重要?dú)埢?，而且這些區(qū)域含有運(yùn)輸陽離子的結(jié)構(gòu)，其中的3個(gè)疏水區(qū)TM3、TM5和TM6均為非跨膜結(jié)構(gòu)。另外，擬南芥AtNHX1 N端面向于胞質(zhì)，而C端親水區(qū)則幾乎都處于液泡腔內(nèi)。

2 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能

2.1 質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能

隨著土壤鹽漬化面積的不斷擴(kuò)大，植物面臨著嚴(yán)峻的高濃度Na+的挑戰(zhàn)。植物本身消除Na+毒害的有效策略之一是通過細(xì)胞質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將Na+排出胞外。隨著對該蛋白的不斷深入了解，大多數(shù)研究表明，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對Na+的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)常常需要借助于H+-ATPase[3]。在植物體內(nèi)，質(zhì)膜H+-ATPase利用水解ATP所產(chǎn)生的能量將H+從細(xì)胞質(zhì)中泵出，從而產(chǎn)生跨膜的H+電化學(xué)勢梯度，進(jìn)而驅(qū)動質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將胞內(nèi)過量的Na+泵出細(xì)胞，以此來降低胞質(zhì)內(nèi)的Na+水平，減輕Na+對細(xì)胞質(zhì)的毒害作用。大量研究發(fā)現(xiàn)，酵母中去除Na+毒害的機(jī)制可能與植物相同，它們的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一致的[10]。擬南芥以及水稻的SOS1在缺失Na+外排功能的酵母突變體中超表達(dá)后，都顯著降低了其對Na+的敏感性[11]，由此可見，SOS1可以通過介導(dǎo)質(zhì)膜上的Na+/H+交換，從而將細(xì)胞內(nèi)的Na+外排出細(xì)胞以減少Na+在胞內(nèi)的積累。

質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白除了具有Na+外排作用還有其他的功能。Garciadeblas等[12]的研究表明，在SOS1介導(dǎo)的Na+外排過程中，K+可能會替代H+與Na+發(fā)生交換，在外排Na+的同時(shí)吸收K+，從而調(diào)控細(xì)胞K+的穩(wěn)態(tài)平衡。Oh等[13]發(fā)現(xiàn)一旦SOS1活性受抑制后，液泡膜上與Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因表達(dá)豐度會顯著上調(diào)，可見SOS1蛋白也會影響植物細(xì)胞中Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.2 液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能

通過對酵母質(zhì)膜Na+-ATPase功能缺失突變體pma1進(jìn)行的研究結(jié)果表明，面對鹽脅迫時(shí)酵母除了限制Na+內(nèi)流這一策略外，還存在胞內(nèi)的Na+區(qū)域化機(jī)制[14]。這一功能是通過液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白完成的。液泡的H+-ATPase（V-ATPase）和H+-PPiase可以產(chǎn)生跨液泡膜的H+電化學(xué)勢梯度，為Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白提供驅(qū)動力，進(jìn)而進(jìn)行離子的電化學(xué)運(yùn)輸，實(shí)現(xiàn)鹽的區(qū)隔化。H+-ATPase是決定植物耐鹽能力的關(guān)鍵因素之一，通常情況下，鹽脅迫初期液泡膜H+-ATPase基因表達(dá)增強(qiáng)，從而使其酶活性和泵運(yùn)質(zhì)子能力增強(qiáng)[15]。

Ohnishi等[16]在研究日本牽牛時(shí)發(fā)現(xiàn)，InNHX2除了賦予牽牛植株耐鹽性外，還參與了花瓣的pH調(diào)節(jié)。Apse等[17]研究發(fā)現(xiàn)，AtNHX1不但可以影響Na+/H+和K+/H+交換活性，而且可以影響植物的發(fā)育。

3 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)調(diào)控

依據(jù)高等植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對鹽脅迫的響應(yīng)形式不同，可將其分為3種[8]。第一種是無論是否有鹽處理植株都不表現(xiàn)出Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性，這可能是由于其體內(nèi)不含有Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，或者盡管體內(nèi)有這種蛋白存在，但是不能被激活所導(dǎo)致的。這一類植物往往是鹽敏感的甜土植物，如中型車前（Plantago media）；第二種則是無論是否有鹽處理植株都表現(xiàn)出Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性，即Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性是組成型表達(dá)的，只不過在鹽處理的情況下其活性會更高，這可能是由于鹽脅迫促使Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白合成增加而形成的。這一類植物主要是鹽生植物，如菊芋；第三種是只有在鹽處理的作用下才能檢測到Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性，即Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)活性是誘導(dǎo)型表達(dá)的，耐鹽的甜土植物多為這種類型，如大麥、向日葵和車前草。

Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)還有組織特異性[18]。有學(xué)者在研究堿蓬SsNHX1時(shí)發(fā)現(xiàn)，在鹽處理的情況下，SsNHX1在葉中的表達(dá)量要比在根中的高。對于獐茅、楊樹的研究也紛紛證實(shí)了這一點(diǎn)。

4 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分子克隆及序列分析

4.1 質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分子克隆及序列分析

隨著1992年Jia等[19]首次在粟酒裂殖酵母中克隆到了質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因SOD2之后，很多科研人員開始關(guān)注質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分子克隆，并獲得了很多編碼該蛋白的基因。Prior等[20]于1996年在啤酒酵母中克隆得到了質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NHA1；Watanabe等[21]在魯氏接合酵母中克隆得到了Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Z-SOD2；Iwaki等[22]在魯氏接合酵母中克隆得到了Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Z-SOD22；之后番茄的SlSOS1、集胞藻的SynNhaP、大葉補(bǔ)血草的LgSOS1、藍(lán)藻的ApNhaP也都相繼克隆出來。目前大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，高等植物的質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是單基因編碼的，由此可以推測，多數(shù)植物的質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能是一個(gè)單基因家族[11]。

研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)植物質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因都含有約3 410～3 500個(gè)核苷酸序列的開放閱讀框（Open reading frame，ORF），通?？梢跃幋a1 129～1 169個(gè)氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量估計(jì)為127 ku[23]。馬清等[11]通過對十幾種植物質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，不同植物之間，它們的質(zhì)膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白存在一定的差異性，尤其是在單子葉與雙子葉植物之間，這可能是由于它們在進(jìn)化上的某種分異性所導(dǎo)致的。

4.2 液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的分子克隆及序列分析

自Apse等[3]于1999年首次在擬南芥中克隆得到液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AtNHX1之后，相關(guān)研究人員相繼在其他植物中分別克隆到了編碼液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，如Hamada等[24]在北濱藜中克隆得到了Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因AgNHX1；Wu等[25]在棉花中克隆得到了GhNHX1；呂慧穎等[26]在番杏中克隆得到了TtNHX1；Zorb等[27]在玉米中成功克隆得到了6個(gè)Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ZmNHX1、ZmNHX2、ZmNHX3、ZmNHX4、ZmNHX5及ZmNHX6；Yu等[28]在小麥中克隆得到了TaNHX2；Hanana等[29]在葡萄中克隆得到了VvNHX1。到目前為止，在甜菜、互花米草、柑橘、甘藍(lán)型油菜、獐毛、蘆葦、月季紫、珍珠栗以及木欖等中也都已經(jīng)成功克隆出了NHX基因[30]。

許多研究表明，絕大多數(shù)植物液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因都含有約1 410～1 668個(gè)核苷酸序列的開放閱讀框，大約編碼470～556個(gè)氨基酸殘基，其分子質(zhì)量大概從47～179 ku不等[30]。由此可以推測，不同植物液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子質(zhì)量存在一定差異性，這可能是由于它們在進(jìn)化上的多樣性導(dǎo)致的。通過對液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行序列分析[24，26，27]，結(jié)果表明液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是一個(gè)高度異源的蛋白群體，它們有可能是從不同的祖先蛋白經(jīng)過趨同進(jìn)化而來。

5 Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展

隨著對Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的不斷探索，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，對Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行過量表達(dá)可以明顯提高植株的耐鹽性。1999年Apsem等[3]將AtNHX1基因轉(zhuǎn)入到擬南芥中并在其體內(nèi)進(jìn)行過量表達(dá)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株在200 mmol/L的NaCl中可以正常生長發(fā)育，之后將AtNHX1基因分別轉(zhuǎn)入到番茄、油菜、棉花以及獼猴桃中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)基因植株都能在200 mmol/L的NaCl處理下正常生長并結(jié)實(shí)，其中轉(zhuǎn)基因棉花還出現(xiàn)了產(chǎn)量增加并產(chǎn)生更多棉纖維的現(xiàn)象[31]。此外，在小麥中過量表達(dá)AtNHX1不僅提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性，而且獲得了更高的產(chǎn)量。目前，過量表達(dá)大豆、珍珠栗、堿蓬、水稻、鹽角草等的Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NHX基因所得到的轉(zhuǎn)基因植株也都表現(xiàn)出耐鹽性增強(qiáng)的現(xiàn)象[2]。

研究者分析認(rèn)為，同時(shí)過量表達(dá)多個(gè)基因可能會賦予轉(zhuǎn)基因植物更強(qiáng)的耐鹽性[30]。2006年Zhao等[32]將堿蓬SsNHX1以及擬南芥AVP1同時(shí)在水稻中進(jìn)行過量表達(dá)，結(jié)果得到的轉(zhuǎn)基因植株比單獨(dú)過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株具有更強(qiáng)的耐鹽性，諸多科學(xué)家的研究也都得到了類似的答案。因此，通過轉(zhuǎn)基因和育種技術(shù)相結(jié)合的方法來培育抗旱耐鹽作物新品種是可行的。

6 展望

土壤鹽漬化已經(jīng)成為一個(gè)全球性重要的環(huán)境問題，在嚴(yán)重的鹽堿地區(qū)，植物幾乎不能生存，鹽分過多會使植物受到生理干旱、離子毒害、生理代謝紊亂等多種危害，從而給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了重大損失。在植物耐鹽過程中，Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白無疑起到了至關(guān)重要的作用。它不僅可以降低Na+的毒害，而且是保持細(xì)胞離子均衡以及調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢的關(guān)鍵因子。隨著土壤鹽漬化問題日益加重，利用分子生物學(xué)手段來克隆耐鹽基因，并將其轉(zhuǎn)移到非抗鹽的作物中，以培育出耐鹽的轉(zhuǎn)基因新品種顯得尤為重要。這不僅可以在一定程度上開發(fā)利用鹽堿土地，而且對于提高農(nóng)作物的產(chǎn)量具有非常重要的意義。

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