丁海燕，訾曉雪

(大慶師范學(xué)院，黑龍江大慶 163712)

黑麥減數(shù)分裂染色體標(biāo)本制作實(shí)驗(yàn)研究

丁海燕，訾曉雪

(大慶師范學(xué)院，黑龍江大慶 163712)

為探索一套適合本科生在有限的課堂時(shí)間內(nèi)操作并且效果良好可用于后續(xù)的分帶、原位雜交方面研究的減數(shù)分裂染色體標(biāo)本制作技術(shù)，使用卡寶品紅、醋酸洋紅對(duì)黑麥花藥材料進(jìn)行染色，采用叔丁醇脫水揭片法和冰凍揭片法對(duì)制作好的臨時(shí)裝片進(jìn)行揭片，明確不同染色方法及不同揭片方法對(duì)標(biāo)本制作效果的影響。結(jié)果表明，卡寶品紅染色制得的標(biāo)本顏色飽滿(mǎn)鮮艷，適合本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)使用；醋酸洋紅染色獲得的標(biāo)本顏色淺紅，更適合原位雜交等研究使用。叔丁醇脫水揭片法在脫水過(guò)程中花粉材料易與載玻片分離，材料易丟失；低溫冷凍揭片法保證材料完好，操作簡(jiǎn)單。使用卡寶品紅染色與冷凍揭片法制得的減數(shù)分裂各個(gè)時(shí)期的永久標(biāo)本，染色體圖像清晰，分裂相動(dòng)態(tài)連續(xù)，可用于實(shí)驗(yàn)教學(xué)，也可用于原位雜交等方面的研究。

黑麥；減數(shù)分裂；染色體標(biāo)本

減數(shù)分裂過(guò)程中染色體行為的觀(guān)察是本科生遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的重要內(nèi)容，制得減數(shù)分裂各個(gè)時(shí)期的動(dòng)態(tài)連續(xù)的染色體標(biāo)本，是提高教學(xué)質(zhì)量的重要手段[1]。同時(shí)，制作良好的減數(shù)分裂染色體標(biāo)本，對(duì)原位雜交、染色體分帶等方面的研究也尤為重要[2]。前人在減數(shù)分裂染色體標(biāo)本制作方面的研究較多，如李森華[3]用卡寶品紅染色和冰凍機(jī)冰凍揭蓋片的方法，對(duì)黑麥減數(shù)分裂各時(shí)期的染色體行為進(jìn)行了研究；段增強(qiáng)等[4]改進(jìn)了傳統(tǒng)植物細(xì)胞減數(shù)分裂染色體制片技術(shù)，探索了用醋酸洋紅染色3～5 min，并反復(fù)加熱，然后烘干揭片的制片方法。但是較多的工作集中在用于顯帶、原位雜交等方面的染色體制片研究上，而針對(duì)本科生實(shí)驗(yàn)教學(xué)的染色體標(biāo)本制作方面的研究比較少，而且黑麥?zhǔn)沁z傳學(xué)實(shí)驗(yàn)的常用材料[5]，關(guān)于黑麥減數(shù)分裂染色體標(biāo)本制作的研究非常少。因此，本研究以黑麥為材料，使用卡寶品紅、醋酸洋紅對(duì)其花藥進(jìn)行染色，采用叔丁醇脫水揭片法和冰凍揭片法對(duì)制作好的臨時(shí)裝片進(jìn)行揭片，明確不同染色方法及不同揭片方法對(duì)標(biāo)本制作效果的影響，旨在探索適合本科生在有限的課堂時(shí)間內(nèi)操作并且效果良好可用于后續(xù)的分帶、原位雜交方面研究的減數(shù)分裂染色體標(biāo)本制作技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料為勝利黑麥。

1.2 試 劑

卡寶品紅染液[6]:3 g堿性品紅溶于100 mL 70%乙醇中，此為原液A。取原液A 10 mL，加入90 mL 5%的苯酚水溶液，充分混均后，置于37 ℃溫箱中2～4 h，此為原液B。取原液B 55 mL，加入甲醛、冰醋酸各6 mL充分混勻，此為原液C。配置染液時(shí)，取原液C 10～20 mL，加入80～90 mL 45%冰醋酸和1 g山梨醇。

1%醋酸洋紅染液[7]:150 mL 45%的冰醋酸，煮沸后停止加熱，加入1.5 g洋紅(進(jìn)口分裝)粉末，一邊加熱一邊攪拌至完全溶解，當(dāng)45%的冰醋酸的量減少時(shí)，再加入相應(yīng)量的45%的冰醋酸，煮沸約30 min，煮沸時(shí)將生銹的小鐵釘放入染色液一同煮。之后將染液在室溫下靜置冷卻，冷卻之后過(guò)濾，染液貯存于棕色瓶，貯存于4 ℃冰箱中。

叔丁醇脫水揭片法的四種溶液[8]:1、45%醋酸與95%乙醇以1∶1的比例混合；2、95%叔丁醇；3、95%乙醇與叔丁醇以1∶1的比例混合；4、叔丁醇。分別盛在編號(hào)為1～4的四個(gè)燒杯中。

其他藥品:70%乙醇、95%乙醇、鹽酸、45%冰醋酸、中性樹(shù)膠。

1.3 方 法

1.3.1 麥穗的選取與處理

黑麥旗葉還未完全展開(kāi)，距離第一節(jié)大約10 cm時(shí)，剪取花苞，將麥穗取出，卡諾固定液中4 ℃固定24 h，70%乙醇沖洗3次，置于70%乙醇中，在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹9]。

1.3.2 花藥的選擇

在取材時(shí)應(yīng)注意，同一穗上不同部位的小花中的花藥分裂時(shí)期有所不同，同一小花中的花藥所處的分裂期大致相同。在同一麥穗中一般以長(zhǎng)在中部的小穗最先發(fā)育，依次向上向下推移，每一小穗中各個(gè)小花的發(fā)育順序則由下向上推移，即第1朵小花比第2朵小花早一個(gè)分裂時(shí)期，但越到后來(lái)分裂時(shí)期越接近。如以花藥長(zhǎng)度來(lái)看，大致在3 mm左右時(shí)的花藥應(yīng)為黃綠色，綠色則太嫩，黃色則太老。同一朵小花中3個(gè)花藥幾乎處于同一分裂時(shí)期，一般選取較長(zhǎng)的花藥制片[10]。

1.3.3 花藥的染色與制片

從固定的花序中按由下到上的順序取幾個(gè)小花，用鑷子在每個(gè)小花中分別取出兩個(gè)花藥，一個(gè)放在1%醋酸洋紅染液中，另一個(gè)放在70%乙醇中，并均于4 ℃冰箱保存。經(jīng)醋酸洋紅染色的花藥要在至少一周后才可用于壓片[11]，而在70%乙醇中的花藥可以隨時(shí)取出壓片。70%乙醇中的花藥壓片方法如下:將花藥取出后放在載玻片上，用刀片切割下一小段花藥，先用竹簽輕輕按壓幾下，擠出花粉母細(xì)胞，將剩余的花藥放在另外一個(gè)載玻片上并滴加一滴45%醋酸防止干燥，將原載玻片上的一小段花藥滴上一滴卡寶品紅染液，染色3～5 min后加上蓋玻片，將刀片夾在蓋玻片與載玻片之間，左手食指按在蓋玻片的左下角，右手持一竹簽在花藥周?chē)脫?，待花藥中的花粉母?xì)胞分散后即可，之后把制片在酒精燈外焰上過(guò)幾次，但加熱時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng)，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則容易使材料烤焦，時(shí)間過(guò)短則之后在揭片時(shí)容易使材料脫離載玻片[12-13]，加熱后立即在蓋玻片上覆兩塊濾紙，用拇指垂直按壓制片[14]，注意在壓片過(guò)程中不要讓蓋玻片移動(dòng)。1%醋酸洋紅染液中的花藥壓片方法如下:將染色一周的花藥取出后，用刀片切取一小段花藥，滴一滴45%醋酸后加上蓋玻片，將刀片夾在蓋玻片與載玻片之間，之后，用與上文同樣的方法制片。

1.3.4 鏡檢及揭片

先在低倍鏡下找到具有分裂相的花粉母細(xì)胞，然后依次轉(zhuǎn)換到高倍鏡觀(guān)察辨認(rèn)該時(shí)期位于減數(shù)分裂的哪個(gè)時(shí)期。分裂相較好的臨時(shí)裝片要制作成永久裝片。首先要進(jìn)行脫片，脫片的目的是使臨時(shí)壓制的片子的蓋玻片與載玻片分離。本實(shí)驗(yàn)采用的脫片方法有兩種，即冷凍揭片法和叔丁醇脫水揭片法。冰凍揭片法[15]:把臨時(shí)壓制的片子放在-80 ℃的冰箱內(nèi)，使片子迅速凍結(jié)，2 h后用刀片迅速揭開(kāi)蓋片，以免片子上的水分融化，使材料丟失。叔丁醇脫水揭片法[16]:將臨時(shí)裝片的蓋玻片那面朝下，傾斜放在1號(hào)燒杯中，讓蓋玻片自然脫落，然后用鑷子夾取蓋玻片和載玻片，再依次在2～4號(hào)燒杯的溶液中處理。在每個(gè)燒杯中分別浸泡5 min左右取出。

1.3.5 干燥及封片

在蓋玻片與載玻片分離后，將載玻片有材料的一面朝上放置在培養(yǎng)皿中，于60 ℃的烘箱中干燥[17]。干燥10 h后，將一滴中性樹(shù)膠滴在載玻片上的材料上，取一干凈的蓋玻片輕輕附于其上，平放即可，切記不可壓片。做好的裝片放在干凈通風(fēng)處進(jìn)行干燥，待樹(shù)膠干燥后，即為永久裝片。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色方法對(duì)標(biāo)本制作效果的影響

實(shí)驗(yàn)比較了醋酸洋紅染色和卡寶品紅染色的效果。使用醋酸洋紅染色所得的永久片在顯微鏡下觀(guān)察時(shí)，染色體著色很淺，圖像呈淺紅色(圖1A)。使用卡寶品紅染色所得的永久片在顯微鏡下觀(guān)察時(shí)，染色體著色很深，圖像呈紫色，顏色鮮艷，易于觀(guān)察(圖1B)。醋酸洋紅染色周期較長(zhǎng)，一般至少7 d才能上色?？▽毱芳t染色時(shí)間很短，一般3～5 min即可，適合本科學(xué)生在遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)課中使用。

2.2 揭片技術(shù)對(duì)標(biāo)本制作效果的影響

實(shí)驗(yàn)比較了叔丁醇脫水揭片法與低溫冷凍揭片法對(duì)標(biāo)本制作效果的影響。叔丁醇脫水揭片法在許多文獻(xiàn)中都有所提及，但是通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，此法不易操作、難度較大，在脫水過(guò)程中花粉細(xì)胞便與載玻片分離，最終沒(méi)有通過(guò)這種方法得到永久片。低溫冷凍揭片法效果很好，只需將臨時(shí)裝片壓片后放入-80 ℃的冰箱中冷凍數(shù)小時(shí)之后取出揭片即可，而且方便、安全。實(shí)驗(yàn)所得的永久片全部由此法獲得。

2.3 第一次減數(shù)分裂標(biāo)本的制作

使用卡寶品紅染色、醋酸洋紅染色、低溫冰凍揭片的方法制作了黑麥第一次減數(shù)分裂標(biāo)本，效果良好。圖2D為醋酸洋紅染色的標(biāo)本效果，圖2中其他圖像為卡寶品紅染色的標(biāo)本效果。

第一次減數(shù)分裂時(shí)，同源染色體發(fā)生聯(lián)會(huì)，交叉互換。之后，同源染色體分開(kāi)，非同源染色體自由組合。此時(shí)期可分為:前期Ⅰ、中期Ⅰ、后期Ⅰ、末期Ⅰ。其中，前期Ⅰ又包括細(xì)線(xiàn)期、偶線(xiàn)期、粗線(xiàn)期、雙線(xiàn)期和終變期。細(xì)線(xiàn)期時(shí)染色質(zhì)凝縮成可見(jiàn)的細(xì)線(xiàn)(圖2A)。偶線(xiàn)期時(shí)同源染色體沿著縱長(zhǎng)方向配對(duì)(圖2B、圖2C)。偶線(xiàn)期早期階段和晚期階段是動(dòng)態(tài)連續(xù)的過(guò)程，但是學(xué)生在實(shí)驗(yàn)操作和觀(guān)察時(shí)卻往往不能同時(shí)看到，這樣的變化過(guò)程呈現(xiàn)給學(xué)生，加深了對(duì)染色體動(dòng)態(tài)變化的理解。粗線(xiàn)期同源染色體聯(lián)會(huì)基本完成，每個(gè)二價(jià)體都能清晰可見(jiàn)，此時(shí)染色體比偶線(xiàn)期要短，粗線(xiàn)期較早階段的染色體形態(tài)和較晚階段的染色體形態(tài)差異較大(圖2D、圖2E)，較晚階段的粗線(xiàn)期染色體形態(tài)與雙線(xiàn)期的較早階段很像，如果單獨(dú)觀(guān)察較難區(qū)分。雙線(xiàn)期時(shí)聯(lián)會(huì)復(fù)合體解體，同源染色體相互排斥，染色體出現(xiàn)或大或小的交叉(圖2F)。終變期時(shí)染色體繼續(xù)縮短變粗(圖2G)。中期Ⅰ時(shí)染色體排布在赤道板上，且每個(gè)染色體顆粒中包含四條染色單體，中期Ⅰ(圖2H、圖2I)較早的階段染色體形態(tài)與終變期的較難區(qū)分。后期Ⅰ時(shí)紡錘絲附著在著絲點(diǎn)上，同源染色體向兩極移動(dòng)(圖2J、圖2K)，此時(shí)可隱隱見(jiàn)到紡錘絲。末期Ⅰ時(shí)染色體達(dá)到兩級(jí)，赤道板處形成細(xì)胞板，一個(gè)性母細(xì)胞分裂形成兩個(gè)，每個(gè)新的細(xì)胞呈現(xiàn)月牙狀(圖2L)。

在實(shí)驗(yàn)教學(xué)課堂上，兩個(gè)連續(xù)動(dòng)態(tài)的染色體標(biāo)本同時(shí)呈現(xiàn)給學(xué)生，學(xué)生會(huì)深刻理解減數(shù)分裂過(guò)程的動(dòng)態(tài)連續(xù)性，會(huì)很容易區(qū)分和掌握它們的特征。

a:細(xì)線(xiàn)期；B:偶線(xiàn)期(早)；C:偶線(xiàn)期(晚)；D:粗線(xiàn)期(早)；E:粗線(xiàn)期(晚)；F:雙線(xiàn)期；G:終變期；H:中期Ⅰ(早)；I:中期Ⅰ(晚)；J:后期Ⅰ(早)； K:后期Ⅰ(晚)；L:末期Ⅰ。

a:Leptotene stages；B:Zygotene stages(early)；C:Zygotene stages(late)；D:Pachytene stages(early)；E:Pachytene stages(late)；F:Bifilar stages；G:Diakineses；H:Metaphase Ⅰ(early)；I:Metaphase Ⅰ(late)；J:Anaphase Ⅰ(early)；K:Anaphase Ⅰ(late)；L:Telophase Ⅰ.

圖2 第一次減數(shù)分裂的標(biāo)本圖像

Fig.2 Specimen images of meiosis Ⅰ

2.4 第二次減數(shù)分裂標(biāo)本的制作

使用卡寶品紅染色、醋酸洋紅染色、低溫冰凍揭片的方法制作了黑麥第二次減數(shù)分裂標(biāo)本。圖3D為醋酸洋紅染色的標(biāo)本效果，圖3中的其他圖像為卡寶品紅染色的標(biāo)本效果。

第二次減數(shù)分裂中，姐妹染色體分開(kāi)，非姐妹染色單體自由組合。第二次減數(shù)分裂包括:前期Ⅱ、中期Ⅱ、后期Ⅱ和末期Ⅱ。前期Ⅱ持續(xù)時(shí)間較短，表現(xiàn)為染色體逐漸縮短變粗(圖3A)，每條染色體中都包著兩條染色單體。中期Ⅱ時(shí)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)紡錘絲，每條染色體的著絲粒都排列在赤道板上，在顯微鏡下可見(jiàn)兩個(gè)呈半月形的中期細(xì)胞相鄰的排列在一起(圖3B)。后期Ⅱ時(shí)姐妹染色單體分開(kāi)，移向兩級(jí)在顯微鏡下可見(jiàn)兩個(gè)呈半月形的后期細(xì)胞相鄰的排列在一起(圖3C)。末期Ⅱ時(shí)姐妹染色單體移動(dòng)到細(xì)胞的兩級(jí)，在赤道板處形成細(xì)胞板，在顯微鏡下可見(jiàn)炸藥包結(jié)構(gòu)(圖3D)，即形成了四個(gè)子細(xì)胞。

a:前期Ⅱ；B:中期Ⅱ；C:后期Ⅱ；D:末期Ⅱ。

a:Prophase Ⅱ；B:Metaphase Ⅱ；C:Anaphase Ⅱ；D:Telophase Ⅱ.

圖3 第二次減數(shù)分裂的標(biāo)本圖像

Fig.3 Specimen images of meiosis Ⅱ

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)選用醋酸洋紅與卡寶品紅分別對(duì)分裂期相近的花藥染色，發(fā)現(xiàn)卡寶品紅染色方法尤其適合本科學(xué)生實(shí)驗(yàn)，前人研究使用卡寶品紅染色一般認(rèn)為需要10～15 min，而且有的研究者主張花藥材料要解離才染色效果好；本研究發(fā)現(xiàn)使用卡寶品紅染色時(shí)材料上色迅速，大約3～5 min就可將花藥染色，而且花藥材料也不需要預(yù)先解離就能很好的染色，值得一提的是用這種方法制片時(shí)，不能用整個(gè)花藥制片，要把黑麥花藥切分成若干小段，這樣就使得花藥壁里的花粉母細(xì)胞散落出來(lái)，很容易上色，無(wú)需解離。

在揭片方法上本研究發(fā)現(xiàn)叔丁醇脫水揭片法在操作過(guò)程中極其容易丟失材料，造成觀(guān)察的分裂相失真；低溫冷凍揭片法能夠保證材料的完好，利于研究與觀(guān)察。有研究者用加熱烘干的方法揭片，本研究對(duì)此種方法未進(jìn)行試驗(yàn)，在今后的研究中進(jìn)一步探討。

黑麥為二倍體植物，體細(xì)胞有14條染色體，染色體數(shù)較少，減數(shù)分裂各時(shí)期的分裂相易于觀(guān)察。而且黑麥花藥比較大，在操作時(shí)容易選取，材料不易丟失。減數(shù)分裂各個(gè)時(shí)期動(dòng)態(tài)連續(xù)的染色體標(biāo)本的制作，對(duì)于學(xué)生正確了解染色體在減數(shù)分裂各時(shí)期的行為特點(diǎn)具有重要意義。制作良好的染色體標(biāo)本也可用于后續(xù)的分帶、基因定位等研究。

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Study on Experimental Specimen Making of Meiotic Chromosome of Rye

DING Haiyan，ZI Xiaoxue

(Daqing Normal University,Daqing,Heilongjiang 163712,China)

In order to establish a set of techniques for meiotic chromosome specimen making with simple procedures,glass slides for rye chromosomes were prepared by the improved method,using rye anthers as experimental materials,dyed by carbol fuchsin and the acetic acid magenta,and the meiosis of pollen mother cell of rye was observed under microscope and recorded by photograph.Two methods for coverslip removing(by the tertiary butyl alcohol and by freezing) were studied and compared.Specimens stained with carbol fuchsin are full of bright,suitable for undergraduate experimental teaching.Specimens dyed by acetic acid magenta are light red,more suitable for usinginsituhybridization,which will not affect the experimental results.Materials are easy to lose during the coverslip removing by the tertiary butyl alcohol,but the materials are in good condition during coverslip removing by freezing,with simple operation.Results showed that these permanent specimens stained with carbol fuchsin and coverslip removing by freezing were good,showing dynamic continuous phase.These specimens included two stages(meiosis Ⅰ and meiosis Ⅱ of rye) and all are dynamic process.They could be better used in the experimental teaching andinsituhybridization study.

Rye；Meiosis；Chromosome specimen

麥類(lèi)作物學(xué)報(bào) 2016，36(12)：1635?1642JournalofTriticeaeCropsdoi：10．7606/j．issn．1009?1041．2016．12．13

時(shí)間：2016-12-07

2016-05-16

2016-11-15

大慶師范學(xué)院科學(xué)研究基金項(xiàng)目(12ZR04) 第一作者E-mail:dinghaiyan2004@126.com

S512.5；Q23

A

1009-1041(2016)12-1629-06

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