楊佳秀，耿皆飛，李倩倩，劉錄祥，謝彥周，王成社

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊陵 712100； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081)

小麥類病斑突變基因 lm3的定位

楊佳秀1，耿皆飛1，李倩倩1，劉錄祥2，謝彥周1，王成社1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊陵 712100； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081)

為進(jìn)一步對(duì)類病斑突變基因lm3進(jìn)行克隆和功能研究，以EMS誘變普通小麥花培品系H261所得后代中選育出的一個(gè)穩(wěn)定遺傳的小麥類病斑突變體LF2010為研究材料，通過(guò)BSA(bulked segregant analysis)、MBSA(multiple bulked segregant analysis)、小麥90K基因芯片結(jié)合BSA三種不同的基因定位策略對(duì)該突變基因進(jìn)行定位。結(jié)果表明，lm3基因位于小麥6B染色體的長(zhǎng)臂，與其兩側(cè)標(biāo)記SWES2和Xbarc134的遺傳距離分別為13.1 cM和3.8 cM，為一個(gè)新的小麥類病斑突變基因。

小麥；類病斑突變；基因定位；lm3

在小麥中，目前已報(bào)道的僅有7個(gè)類病斑突變體，分別為M66[11]、C591(M8)[12]、AIM9[13]、HLP[8]、Ning 7840[14]、Yanzhan 1/Zaosui 30分離群體中的一個(gè)穩(wěn)定斑點(diǎn)后代[15]、LF2010[16]。不同類病斑突變體的表型存在不同程度的差異，并且不同類病斑表型對(duì)各自農(nóng)藝性狀、抗病性等的影響也各有不同，如突變體HLP與野生型相比產(chǎn)量性狀差異不明顯，對(duì)葉銹菌成株期抗病性顯著增強(qiáng)[8]；突變體M66雖然產(chǎn)量較親本明顯下降，但對(duì)白粉病[11]、條銹病和葉銹病[9]的抗病性增強(qiáng)。迄今為止，小麥中僅有3個(gè)類病斑突變基因被定位，只有不斷創(chuàng)造、發(fā)掘、定位更多的小麥類病斑基因，才能推動(dòng)小麥類病斑突變機(jī)理、基因克隆等研究地進(jìn)行。

通常情況下，基因定位是一個(gè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的過(guò)程，尤其是在小麥這種基因組復(fù)雜且龐大的植物中。為了盡快確定目標(biāo)染色體，不同的基因定位策略隨著生物技術(shù)的發(fā)展相繼被嘗試。BSA(bulked segregant analysis)法是快速定位目標(biāo)基因的有效策略[17]。但試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)目標(biāo)基因附近標(biāo)記密度較低時(shí)，運(yùn)用BSA法則可能會(huì)漏掉距離目標(biāo)基因相對(duì)較遠(yuǎn)的分子標(biāo)記，從而導(dǎo)致篩選到連鎖標(biāo)記的可能性大大降低，有時(shí)甚至?xí)Y不到連鎖的分子標(biāo)記，導(dǎo)致定位失敗。2012年，Hiebert等[18]提出了新的基因定位策略MBSA(multiple bulked segregant analysis)來(lái)提高BSA的靈敏度，Ghazvini等[19]對(duì)其做了具體地改進(jìn)及驗(yàn)證。此外，隨著基因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，使得高通量SNP基因分型得以實(shí)現(xiàn)，進(jìn)而為在小麥這樣的復(fù)雜基因組中構(gòu)建高分辨率的遺傳連鎖圖譜提供了快速而有效的策略。2014年，Wang等[20]利用小麥90K芯片對(duì)8個(gè)不同作圖群體進(jìn)行了遺傳變異分析，將46 977對(duì)SNP分子標(biāo)記進(jìn)行遺傳定位，并利用其中的6個(gè)群體構(gòu)建了包含40 267個(gè)遺傳位點(diǎn)的整合圖譜。這些標(biāo)記數(shù)量可觀的高密度遺傳圖譜為小麥基因組的研究提供強(qiáng)大的支持。在小麥中，9K、90K、660K芯片相繼被開發(fā)，結(jié)合BSA，可以利用大量的SNP對(duì)一個(gè)較小的群體進(jìn)行富集分析，為小麥基因定位研究開辟了一條全新、快速、高效的新策略。

LF2010是由EMS誘變普通小麥花培品系H261得到的一個(gè)穩(wěn)定遺傳的類病斑突變體，其斑點(diǎn)性狀受1對(duì)隱性核基因控制，且表達(dá)受光照和溫度的影響，推測(cè)LF2010為一類新的突變類型[16]。由于已定位的3個(gè)小麥類病斑突變基因分別為lm[14]、lm1[15]和lm2[15]，因此，這個(gè)類病斑突變基因暫時(shí)命名為lm3。本研究以突變體LF2010為研究材料，利用BSA、MBSA、小麥90K基因芯片結(jié)合BSA三種不同的基因定位策略，對(duì)突變基因lm3進(jìn)行定位研究，以期為lm3基因的克隆和功能研究以及最終揭示小麥類病斑突變發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及其種植

LF2010是普通小麥花培品系H261經(jīng)過(guò)EMS(ethane methyl sulfonate) 誘變所得后代中選育出的小麥類病斑突變體，經(jīng)過(guò)連續(xù)5代自交已遺傳穩(wěn)定。2013年5月，將LF2010與普通六倍體小麥品種中國(guó)春雜交，隨后分別播種親本、F1、F2及F2∶3，從三葉期開始，以葉片是否出現(xiàn)黃色斑點(diǎn)為標(biāo)準(zhǔn)，鑒定植株的表型。

1.2 DNA的提取

一是構(gòu)建事業(yè)平臺(tái)。智庫(kù)要有事情做，有研究的問(wèn)題、項(xiàng)目、課題等，要有相關(guān)的科學(xué)有效的理論、方法、信息、手段等的支持，也要有專業(yè)、有水平團(tuán)隊(duì)支撐；

將LF2010與中國(guó)春雜交后自交得到的190個(gè)F2∶3代株系作為定位群體。按CTAB[21]法提取LF2010、中國(guó)春及定位群體各單株的全基因組DNA。

1.3 突變基因 lm3的初定位

1.3.1 BSA策略

參照Michelmore等[22]文章中所述BSA方法，隨機(jī)選取F2∶3定位群體中8株綠色野生型單株的DNA等量混合構(gòu)建正常性狀池(BW)，8株斑點(diǎn)型單株的DNA等量混合構(gòu)建突變性狀池(BM)，然后將親本LF2010和中國(guó)春間有差異的SSR分子標(biāo)記在BW和BM之間進(jìn)行篩選，在不同性狀池間存在多態(tài)性的標(biāo)記即為連鎖標(biāo)記。

1.3.2 MBSA策略

參照Ghazvini等[19]文章中所述MBSA方法，隨機(jī)選取F2∶3定位群體中2株斑點(diǎn)型單株的DNA(含隱性純合的目標(biāo)基因)等量混合組建一個(gè)迷你池(mini bulk)，一共組建14個(gè)這樣的mini bulk。將親本間存在多態(tài)性的所有SSR標(biāo)記在這14個(gè)mini bulk中進(jìn)行篩選，在5個(gè)以上mini-bulk中與隱性親本帶型一致的標(biāo)記即為連鎖標(biāo)記。

1.3.3 小麥90K芯片結(jié)合BSA策略

參照Michelmore等[22]文章中所述BSA方法，選取F2∶3定位群體中6株綠色野生型單株的DNA等量混合構(gòu)建正常性狀池(C-BW)，6株斑點(diǎn)型單株DNA等量混合構(gòu)建突變性狀池(C-BM)，送至北京康普森生物公司進(jìn)行小麥90K芯片檢測(cè)，2次樣本重復(fù)。根據(jù)Wang等[20]提供的SNP位點(diǎn)信息確定基因池間的差異SNP在小麥各個(gè)染色體上的富集情況，最終根據(jù)這個(gè)SNP富集結(jié)果即可初步確定目標(biāo)基因所在的染色體。

將90K芯片初步確定染色體上的多態(tài)性SNP對(duì)照Wang等[20]文章中小麥與二穗短柄草、水稻、高粱的對(duì)應(yīng)關(guān)系表，可以得到SNP對(duì)應(yīng)的二穗短柄草、水稻、高粱各自的基因區(qū)間，從而得到兩基因池之間SNP的富集區(qū)。利用富集區(qū)SNP的序列設(shè)計(jì)基于小麥基因組序列的SSR引物并在基因池間檢測(cè)其是否與目標(biāo)基因連鎖。

1.4 突變基因 lm3的精細(xì)定位

從F2∶3定位群體中隨機(jī)挑選一定單株用于驗(yàn)證得到的連鎖標(biāo)記及檢測(cè)初定位所得染色體上其他在親本間有多態(tài)性的分子標(biāo)記的多態(tài)性。將突變體LF2010特有的帶型記作A，中國(guó)春特有的帶型記作B，雜合帶型記作H；若連鎖標(biāo)記為顯性標(biāo)記，則單株帶型記作A/C或者B/D。利用JoinMap 4.0軟件分析，并繪制相應(yīng)的遺傳連鎖圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳分析

類病斑突變體LF2010與中國(guó)春雜交，F(xiàn)1代單株全部為野生型的綠色表型，說(shuō)明該基因?yàn)殡[性基因；經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn)，F(xiàn)2群體中綠色表型單株與斑點(diǎn)表型單株的比例符合3∶1的分離比例，F(xiàn)2∶3群體符合1∶2∶1的分離比例，表明在這個(gè)群體中的目標(biāo)性狀受1對(duì)核基因控制。以上說(shuō)明類病斑突變體LF2010的斑點(diǎn)性狀在LF2010與中國(guó)春雜交的F2群體中為單基因隱性遺傳(表1)。這與本實(shí)驗(yàn)室以前研究的結(jié)果相同。

2.2 突變基因lm3的BSA策略定位

杜麗芬[23]在京花一號(hào)與LF2010雜交的F2∶3定位群體中篩選到2對(duì)分子標(biāo)記Xwmc388和cfa2187，本研究基于此，將這2對(duì)分子標(biāo)記在親本LF2010、中國(guó)春及其F2∶3群體單株構(gòu)建的兩基因池間進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示，cfa2187在親本間無(wú)差異，Xwmc388在親本及基因池之間均存在多態(tài)性，初步表明Xwmc388與類病斑突變基因lm3連鎖，但由于Xwmc388有多個(gè)位點(diǎn)，分別位于3A、4D、5A、6A、6B、7A染色體上，所以并不能根據(jù)分子標(biāo)記Xwmc388初步判斷目標(biāo)基因lm3所在的染色體。

2.3 突變基因lm3的MBSA策略定位

選取Ghazvini等[19]列出的均勻分布在小麥21條染色體上帶型單一的423對(duì)引物中標(biāo)記Xwmc388所在的6條染色體上的110對(duì)SSR引物，及本實(shí)驗(yàn)室已有的位于這6條染色體上的27對(duì)SSR引物(表2)，進(jìn)行親本間多態(tài)性的篩選。在這137對(duì)引物中，68對(duì)在雙親間表現(xiàn)出多態(tài)性，作為進(jìn)一步篩選的候選引物。將候選引物在14個(gè)mini-bulk間進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，分子標(biāo)記Xbarc134 在14個(gè)池中均與隱性親本LF2010帶型一致(圖1A)，Xwmc417在6個(gè)mini-bulk中與隱性親本LF2010帶型一致(圖1B)，初步表明Xwmc417、Xbarc134與類病斑突變基因lm3連鎖。Xwmc417有2個(gè)位點(diǎn)，分別位于6A、6B染色體上，Xbarc134僅有1個(gè)位點(diǎn)，位于小麥6B染色體上，因此可以初步確定突變基因lm3位于小麥6B染色體上。

2.4 突變基因lm3的小麥90K芯片結(jié)合BSA策略定位

根據(jù)整合的高密度90K SNP遺傳連鎖圖譜[20]，可以得到基因池間差異SNP所在的染色體位置。從圖2A中可以看出，6B染色體上多態(tài)性SNP數(shù)目最多，為95個(gè)，占已知位置的總SNP數(shù)目的36.7%，與圖2B結(jié)果基本一致，說(shuō)明控制斑點(diǎn)的基因最可能在6B染色體上，但仍需進(jìn)一步地驗(yàn)證分析。

表1 突變體LF2010與中國(guó)春雜交后代性狀分離比

Table 1 Segregation for spotted mutation

群體Population總株(家系)數(shù)Totalnumberofplants(lines)綠色株(家系)數(shù)Numberofgreenplants(lines)分離家系數(shù)Numberofsegregationlines斑點(diǎn)株(家系)數(shù)Numberofspottedplants(lines)分離比Segregationratioχ2P值PvalueF11111F2190139513∶10．0250．84F2∶31804393441∶2∶10．2110．90

M：DL2000；P1：LF2010；P2：中國(guó)春；1～14：分別由2個(gè)突變型單株所構(gòu)建的14個(gè)迷你池。

M：DL2000; P1：LF2010; P2：Chinese Spring; 1～14:Fourteen mini bulks consisting of two mutant plants,respectively.

圖1 SSR分子標(biāo)記Xbarc134(A)和Xwmc417(B)的電泳結(jié)果

Fig.1 Electrophoresis of fragments amplified with SSR markers Xbarc134 (A) and Xwmc417 (B)

A和B為2個(gè)重復(fù)。 A and B indicate two replicates.

綜合2次重復(fù)結(jié)果，得到多態(tài)性SNP在6B染色體上的富集區(qū)，對(duì)照Wang等[20]文中各物種之間的線性關(guān)系，得到6B染色體上SNP富集區(qū)對(duì)應(yīng)的二穗短柄草、水稻、高粱各自的基因區(qū)間(表3)。利用所得區(qū)間內(nèi)的二穗短柄草的基因?qū)?yīng)的SNP序列信息設(shè)計(jì)了69對(duì)基于小麥基因組的SSR引物(表2)，其中37對(duì)在親本間有多態(tài)性。由于染色體已經(jīng)初步確定，試驗(yàn)重心已由確定目標(biāo)基因所在染色體轉(zhuǎn)為得到與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，因此利用BSA法對(duì)37對(duì)親本間有差異的引物進(jìn)行篩選，結(jié)果得到6BLm15、6BLm22、6BLm59在池之間存在差異，初步表明這3對(duì)引物與lm3連鎖，同時(shí)驗(yàn)證了芯片混池快速確定染色體的結(jié)果，基本確定了突變基因lm3位于6B染色體上。

2.5 連鎖標(biāo)記的驗(yàn)證及連鎖圖的構(gòu)建

隨機(jī)選取F2∶3定位群體中110個(gè)單株進(jìn)一步驗(yàn)證引物Xwmc388、Xwmc417、Xbarc134、6BLm15、6BLm22、6BLm59是否與類病斑突變基因lm3連鎖。數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，該突變基因位于SSR標(biāo)記Xbarc134和6BLm22之間。由于Xbarc134和6BLm22均位于6BL染色體上，因此搜索6BL上的SSR及EST-SSR引物，將得到的6BL染色體上親本間有差異且?guī)颓逦囊锞贔2∶3群體中進(jìn)行分析，最終得到如圖3的遺傳連鎖圖譜。該圖譜包括了11對(duì)SSR引物、1對(duì)EST-SSR引物、3對(duì)基于芯片數(shù)據(jù)開發(fā)的SSR引物，其中距離目標(biāo)基因最近的兩側(cè)引物為SWES2和Xbarc134，其遺傳距離分別為13.1 cM 和3.8 cM。

表2 本實(shí)驗(yàn)室已有的SSR引物(No.1-No.27)及本研究基于SNP序列重新合成的SSR引物(No.28-No.96)

Table 2 SSR primers kept in our laboratory(No.1-No.27) and resynthesized based on SNP sequences in this study(No.28-No.96)

編號(hào)No．SSR引物名稱NameofSSRprimer正向引物序列(5′?3′)Forwardprimersequence(5′?3′)反向引物序列(5′?3′)Reverseprimersequence(5′?3′)1barc310GGGCGGCGCATGTGCACCTAGCGTGGAAGCGACTAAATCAACT2barc356CGCTAGAGCTGTTTGAGGGGAGGAGCGCATGTAGGGGGAGGCTTCTTTT3gwm480TGCTGCTACTTGTACAGAGGACCCGAATTGTCCGCCATAG4cfa2234AATCTGACCGAACAAAATCACATCGGAGAGTATTAGAACAGTGCC5gwm155CAATCATTTCCCCCTCCCAATCATTGGAAATCCATATGCC6wmc388TGTGCGGAATGATTCAATCTGTGGCCATTAGACTGCAATGGTTT7wmc331CCTGTTGCATACTTGACCTTTTTGGAGTTCAATCTTTCATCACCA8barc334ATCCGCGTGTCAAACTTCTTCCGGGCTGGCTGGGCTAAATG9cfd54TCGTTCCAAAATGCATGAAAAAGGGCCAGAAATCTGTGTG10gwm205CGACCCGGTTCACTTCAGAGTCGCCGTTGTATAGTGCC11barc117TCATGCGTGCTAAGTGCTAAGAGGGCAGGAAAAAGTGACT12barc141GGCCCATGGATAATTTTTGAAATGCAATTCGGCCAAAGAAGAAGTCA13barc330GCACTAAGCGCTCTTTATTTACCCTGCATCTGGTATGGAGA14barc319GCAGAGCTACGGCAATGTGCGTAAGTCCCGGAAGTAACAGAA15barc171GCGGGGTCATCTTAGTAACTCAAATAACTGTCAACGTTGGTTCACATTCA16barc113GCGCACAACAACGGACACTTAACAATTGGGACTCATTTAGCTTCTACTCGCCATTA17gwm169ACCACTGCAGAGAACACATACGGTGCTCTGCTCTAAGTGTGGG18gwm617GATCTTGGCGCTGAGAGAGACTCCGATGGATTACTCGCAC19barc79GCGTTGGAAAGGAGGTAATGTTAGATAGTCGTGGGTTACAAGTTTGGGAGGTCA20barc24CGCCTCTTATGGACCAGCCTATGCGGTGAGCCATCGGGTTACAAAG21barc178GCGTATTAGCAAAACAGAAGTGAGGCGACTAGTACGAACACCACAAAA22barc134CCGTGCTGCAAATGAACACAGTTGCCGGTTCCCATTGTCA23wmc168AACACAAAAGATCCAACGACACCAGTATAGAAGGATTTTGAGAG24gwm60TGTCCTACACGGACCACGTGCATTGACAGATGCACACG25cfa2110TCACTACCCGCATGAACAAATTCTGCACAAACCGTTCTGA26cfa2123CGGTCTTTGTTTGCTCTAAACCACCGGCCATCTATGATGAAG27gwm332AGCCAGCAAGTCACCAAAACAGTGCTGGAAAGAGTAGTGAAGC286BLm01TTTCTAACCCATTCGTGACTAGAATAGGGGTTATCTTCCAGA296BLm02GGAAGAAGGGAGGAAATAAATGCGTCATTTCATTGAATTTT306BLm03TTGGACAACAAGTAGAGCAGTTCGCTAGTGACATACAGTGAA316BLm04GGAAAATTCAATGAAATGACGGAGAATTATACTCCCCAAACG326BLm05TCCCAAATGATGCATATAGACCTTTCAGGAGCAATTAGTCAA336BLm06TGATGGAGCAGTCAATATTTCGTAGATCCTGATCCCAAAGAC346BLm07CCAAATGTTCATCTTGTTTGTTGGTTGGTGATCAGAACTTAC356BLm08TTGCTTATTTGCTTACCTCACACTTCGACTGTACAACACCAT366BLm09GGTTTCATAGGCCTGTTCTCCATCACATGAAACAGATCACA376BLm10CAGATCATGTCTCCAAGGTCATCAGAAACAAGTGCTAATCG386BLm11AGGTTTGGACATGTGGATAATTTTACCTTTTATATGCCATCG396BLm12CTAAAAATTGACTGCACCATTTTTGTTTGGTAGTCTGTTCGT

(續(xù)表3 Continued table 3)

編號(hào)No．SSR引物名稱NameofSSRprimer正向引物序列(5′?3′)Forwardprimersequence(5′?3′)反向引物序列(5′?3′)Reverseprimersequence(5′?3′)406BLm13ATACTCGAAACCTTCTGAACCGTGAAATTTCGATCCCAAAG416BLm14CAAAGTCTGCTAGCTTTAGGAAGCAGCTATAGGCGTTCTAGT426BLm15GCACAGCCTTTAATCATCTACACACGAAGCTCTCTATCAATG436BLm16ACGTATGCCATCAGTAACCTACACCAAGCGTAAAGTGAATAA446BLm17GAGATCTTATGGGTTTCACCTCAGTTTCCAGAAGGAACATAA456BLm18CGCAAGTTGTATGTTGACTTCCCATCAGATAACACCAATAGC466BLm19TACTCCCTAATCTGCAGTAGCCATGTATGTAGCAGCAGAACA476BLm20TCATTGTACTGCGATGTTGTAGGTGGATGAAGCTAGGTAGAG486BLm21ATCGACATCAACTCGATCCTTTGTGGTTGCTAAAAGTGAC496BLm22ACCTTCATCTTGGACTTCTTGGTAGCGGTTGAGAGAAAGAG506BLm23AGAGCTTTGTCTTCACCTTCTTGAATTTCGATCTGAACAAAC516BLm24AAAAAGGTTCACATTGTTTCCAACTAATCAATGCATCCTCAA526BLm25TCTCTTCTTTTTAGGGCTTTCCAGTAGAAATCGAACTGAGGA536BLm26AAATGCCATGGTTAAACTACAGTAGGCTGAATGATGCTACC546BLm27ACCACCAAAAGATTTAGAAGCGCACCGCTAAGCAACACTA556BLm28AATGTTTTAACTCAGGCACAACCCAAGACATCAAAGTGTATC566BLm29GAATCGTGTGTTGATTTGGTCAGAAACAAGGAACGGTTAAT576BLm30CTGCTTATTGGAAATTGTTTCTTTAACCGATCTTCTGTTTTCA586BLm31ACACTCTTACATTGCTTTCCATATTCTGGTGGCAGATTTGTA596BLm32AGGTGTGACATGGAAACAAGTTATTAGTGGCCTCTCTCTCC606BLm33ACAGAGGGAGTAGTGAGTGGTCATTGATGTGTGTGTGTTCAT616BLm34ATGGAGTTGTACGAGCAATAACTTTGCAACTATGCTAATCGT626BLm35TCTGAATCACCCAGAAATAAATGATTAAGGCGTCTCCTCT636BLm36TTGTGAAAGGACAGAGTTCATTCCAGGTAAGATAACCAATCA646BLm37TCGAGATGAGTTTGAGCAGTGAGACGTACAGGTGATTAGA656BLm38GTGTCGAGGTCTTGGATGTAAGATAGAGCAGGTTTTCACC666BLm39GCTCAACATCATTTGAAAAACTGTTAAAAGTGGTGTCCAAAG676BLm40GACGTAGGCTGTTGGATCTCTAATTAATCGCAGCTGTACG686BLm41CTGGAACAGGAGGCAAAGCAGTGTAAATAACGTCGCTTC696BLm42TCTAGATCAAACTCCGAAACCGTTTTGCTTGAGCAGACG706BLm43AGAAGAAGAGAAGGACGTGACGTCGTTGTCTCCAGTGTAAAT716BLm44GTCAGAGGGCTAGTGGTAAATTTGTGCTGATAGTGTCAAAAA726BLm45TCAGCTAAAAGTGATGGCTACCATTTCGATTCCCAATCTT736BLm46GTTCAATGTATTGTTCCTTGGAACGATGACCCTTTCACTATT746BLm47ATAATTTCTATGCGGAAGAGCTCCCTAAATCCTGAAAGAAAC756BLm48TTCTTTCAGGATTTAGGGAAGGGATATTTTCCTTTTTCATCG766BLm49CAGACGATGATGACTTTATGCTCTGTTCTGATCTCTTTTGCT776BLm50CAAGCTGAAAACAGATCAAAGAGCTTGCACTACCCTAGAATC786BLm51CATGATACGCTACAATGTTGACCTCCCATCTCCATATTATTT796BLm52CGGTAAAATATTCTTCAGCAATGATAGATATCAATGGGGATG806BLm53CTGTTTTTAATGCCTCTTTTGCTGGTCCATATTAAAGCAGTG816BLm54TATATAGTGCGATGGTTTTGGGATAAAAACATCCATGTCACG826BLm55GCGATGTCAATGAAACACTACGGCTACTTGGTTGGAAACTAC836BLm56AGGGTAAACCAATTAAGAAGCACTTCACTGAGGAGGAGGAG846BLm57TGCATCTTAGCTAATTGTGGTGTCAATCGAATCCATAGAGGT856BLm58CCACCATTGCTTGTTAGTTTAGCTGCTACTGCTGCTATTATC866BLm59TTGATAGAGGCGTAGAAATGAGGCTTCTTATTTGAGATGGTT876BLm60AAGATAGATAACGTTCGTTGCGAGAGTGATGGAGTCAAGGTC886BLm61TAATTTTCATCGGTCATTCTGAGTAGTGGAGGAGTGATGGAT896BLm62ATCCATCACTCCTCCACTACTGGGAATGGGAGTTAGTACATT906BLm63ATTGCCCTTTCATACTTTTTCTGGTAGGGTACGTACATTTTG916BLm64TGAGAAGCAGAACCCAGTATACAATCATCCTCCCCTAGATA926BLm65TTTTACATGGAGAAACCACACAGTGAACAAGAAATCCATGTG936BLm66CACATGGATTTCTTGTTCACTGTTGTAGTGGTTGTGGTTTGT946BLm67GATGAAGACGATGAAGATGAGGTGCTACAACAGACATTAGGG956BLm68ATAAAAACAGTAGCGGTGGTTAATGTCTCACAGAAAATCGAA966BLm69TATAATACGCAGGCAACAGACATCCTTCCTCTGCTTGTTAAT

表3 小麥、水稻、二穗短柄草和高粱的共線性關(guān)系

Table 3 Macro-colinearity relationship among wheat,rice,Brachypodiumdistachyonand sorghum

90KSNP標(biāo)記90KSNPmarker二穗短柄草基因Brachypodiumdis?tachyongene水稻基因Ricegene高粱基因Sorghumgenewsnp＿CAP11＿c3599＿1741800Bradi3g50010．1LOC＿Os02g42890．1Sb04g033650．1＿PACid＿1968195Ex＿c20946＿574Bradi3g51617．1wsnp＿Ku＿c5744＿10166561Bradi3g51910．1LOC＿Os02g45920．1Sb04g031640．1＿PACid＿1967964RAC875＿c4420＿371Bradi3g51940．1LOC＿Os02g45950．1Sb04g031610．1＿PACid＿1967960Ra＿c23874＿338Bradi3g52367．2LOC＿Os02g46990．1Sb04g030980．1＿PACid＿1967873wsnp＿Ra＿c7889＿13482164Bradi3g55120．1Tdurum＿contig7986＿704Bradi3g55950．1Jagger＿c1231＿85Bradi3g55960．1LOC＿Os02g57830．2Sb04g037890．1＿PACid＿1968698RAC875＿c45987＿132Bradi3g56110．1LOC＿Os02g57990．1Sb04g037940．1＿PACid＿1968703CAP8＿c7260＿77Bradi3g56460．1LOC＿Os02g49320．1Excalibur＿c28014＿99Bradi3g56460．1LOC＿Os02g49320．1Sb04g029450．1＿PACid＿1967686Tdurum＿contig12648＿732Bradi3g60430．1LOC＿Os02g58230．1Sb04g038220．1＿PACid＿1968733RAC875＿c86296＿99Bradi3g60430．1LOC＿Os02g58230．1Sb04g038220．1＿PACid＿1968733BobWhite＿c447＿897Bradi3g60446．1RAC875＿c28848＿330Bradi3g60477．1LOC＿Os02g58280．1Sb04g038270．1＿PACid＿1968738

圖3 突變基因 lm3在小麥6BL染色體上的遺傳連鎖圖

3 討 論

在小麥中，已定位的類病斑突變基因有3個(gè)，Li和Bai[14]報(bào)道的小麥品系Ning 7840為自然突變產(chǎn)生的類病斑材料，利用Ning 7840/Chokwang的重組自交系將控制Ning 7840黃色斑點(diǎn)性狀的隱性基因lm定位在小麥1BL染色體上；Yao等[15]在Yanzhan 1/Zaosui 30的分離群體中發(fā)現(xiàn)了受光照誘導(dǎo)的類病斑突變性狀，其實(shí)是兩個(gè)隱性基因互作產(chǎn)生的斑點(diǎn)癥狀，對(duì)控制斑點(diǎn)性狀的這兩個(gè)互作基因進(jìn)行定位，其中來(lái)自親本Zaosui 30的lm1被定位于小麥3BS染色體上Xwmc674與Xbarc133/Xbarc147之間，遺傳距離分別為1.2 cM、3.8 cM，另一個(gè)來(lái)自親本Yanzhan 1的lm2被定位到小麥4B染色體的長(zhǎng)臂，距離兩側(cè)標(biāo)記Xgwm513、Xksum154的遺傳距離分別為1.5 cM、3.0 cM。本研究的類病斑突變體LF2010的突變基因雖然其表達(dá)也受光照誘導(dǎo)[16]，但被定位于小麥6BL染色體上，不同于之前定位的任何一個(gè)類病斑基因。因此，為一個(gè)新的類病斑突變基因，將其命名為lm3。

在基因定位中，為了找到目標(biāo)染色體區(qū)段，人們提出了多種策略，其中應(yīng)用最廣泛的是Michelmore等[24]于1991年提出的BSA法，該方法簡(jiǎn)單方便，能夠快速檢測(cè)到目標(biāo)基因相關(guān)的區(qū)域。但由于小麥SSR遺傳圖譜標(biāo)記密度不足夠高，有些染色體區(qū)段還存在較大的gap(>30 cM)，因此該方法在結(jié)合傳統(tǒng)SSR分子標(biāo)記時(shí)也存在一定的弊端，就是靈敏度不高。例如，小麥桿銹基因SrCad的定位，一開始采用BSA法定位時(shí)失敗，最終由全基因組定位(whole genome mapping，WGM)法定位成功[25]。但全基因組定位需要消耗大量的人力物力，由此Hiebert等[18]提出了MBSA法，同時(shí)兼?zhèn)淞巳蚪M定位的靈敏度與BSA法的操作高效性。Hiebert等[26]運(yùn)用MBSA法將小麥葉銹抗性基因 Lr70成功定位在小麥5D染色體短臂。突變基因lm3的定位工作，一開始單純依靠BSA法進(jìn)行基因定位時(shí)，656對(duì)SSR引物在京花一號(hào)與L2010的F2∶3定位群體中只篩選到兩個(gè)連鎖的分子標(biāo)記Xwmc388和cfa2187[23]，而在中國(guó)春與LF2010的F2∶3定位群體中cfa2187在雙親間沒(méi)有多態(tài)性，Xwmc388在染色體上有多個(gè)位點(diǎn)，由于本實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有缺體材料，所以并不能確定目標(biāo)帶型是位于哪一條染色體上?；诖耍覀兂醪綄⒛繕?biāo)染色體鎖定在Xwmc388所在的染色體，運(yùn)用MBSA提高檢測(cè)的靈敏度進(jìn)行連鎖標(biāo)記的篩選，得到兩個(gè)連鎖標(biāo)記，最終確定突變基因的目標(biāo)染色體。說(shuō)明MBSA在小麥這樣基因組龐大、遺傳連鎖圖密度不夠高的作物中進(jìn)行基因定位是切實(shí)可行的。

隨著生物芯片的不斷發(fā)展，新的快速定位基因的策略應(yīng)運(yùn)而生。相對(duì)于傳統(tǒng)的利用全基因組SSR標(biāo)記篩選目標(biāo)染色體區(qū)段的方法，更加省時(shí)省力、快速精確。同時(shí)，90K芯片是通過(guò)不同小麥品系的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)而來(lái)，檢測(cè)到的SNP大多數(shù)位于編碼區(qū)，可以提高定位精度和準(zhǔn)確性。本研究即是利用90K芯片與BSA的結(jié)合，對(duì)兩個(gè)相對(duì)性狀基因池進(jìn)行SNP檢測(cè)，根據(jù)SNP的富集結(jié)果快速地發(fā)現(xiàn)了多態(tài)性SNP較多的的集中在6B染色體上，經(jīng)6B富集區(qū)設(shè)計(jì)引物的篩選及F2∶3群體的驗(yàn)證分析確定突變基因lm3在6B染色體上，與MBSA結(jié)果一致。說(shuō)明利用90K SNP芯片快速進(jìn)行小麥基因定位的策略是切實(shí)可行、簡(jiǎn)單高效。需要說(shuō)明的是，本研究中90K芯片在池之間的檢測(cè)結(jié)果在6B以外的個(gè)別染色體上SNPs的數(shù)量也相對(duì)較多，并且得到的SNP富集區(qū)間也相對(duì)較大，推測(cè)是由于建池時(shí)所選取的F2∶3單株數(shù)目較少，使得池之間除目標(biāo)區(qū)域外其他背景值干擾性太強(qiáng)?？梢栽诖_保F2單株正確的基礎(chǔ)上選取較多的單株進(jìn)行混池檢測(cè)，所得的富集區(qū)間會(huì)大大縮小，更加富有針對(duì)性，有利于開發(fā)標(biāo)記加密目標(biāo)基因。后續(xù)將選用lm3兩側(cè)的共顯性標(biāo)記對(duì)更大的F2∶3群體進(jìn)行篩選，得到足夠數(shù)量的重組單株作為篩選加密標(biāo)記的群體，并選取更多數(shù)量的單株混池進(jìn)行基因芯片(90K或660K)的檢測(cè)，根據(jù)富集區(qū)的信息開發(fā)標(biāo)記對(duì)類病斑突變基因lm3進(jìn)一步加密。

4 結(jié) 論

小麥類病斑突變體LF2010的黃色斑點(diǎn)性狀為單基因隱性遺傳。通過(guò)運(yùn)用BSA、MBSA、小麥90K芯片3種不同的基因定位策略將小麥類病斑突變基因lm3定位于小麥6B染色體的長(zhǎng)臂，距兩側(cè)標(biāo)記SWES2、Xbarc134的遺傳距離分別為13.1 cM和3.8 cM，為一個(gè)新的小麥類病斑突變基因。

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Mapping of Lesion Mimic Mutant Genelm3 in Common Wheat

YANG Jiaxiu1,GENG Jiefei1,LI Qianqian1,LIU Luxiang2,XIE Yanzhou1,WANG Chengshe1

(1.College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China; 2.Institute of Crop Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China)

In order to clone the lesion mimic mutant genelm3 and analyse its function further,a lesion mimic wheat mutant LF2010,obtained from an anther culture line H261 which was mutated with EMS,was chosen as material,and three kinds of different gene mapping strategies were taken to map it,including BSA(bulked segregant analysis),MBSA(multiple bulked segregant analysis),and wheat 90K gene chip combined with BSA.The result showed that a genetic linkage map containing 15 pairs markers linked withlm3 was obtained. Finally,lm3 was mapped on 6BL of wheat chromosome,13.8 cM away from marker SWES2 and 3.8 cM away from Xbarc134.lm3 is a new gene of wheat lesion mimic mutant.

Wheat; Lesion mimic mutant; Gene localization;lm3

時(shí)間：2016-12-07

2016-05-26

2016-11-13

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0102101)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(2014YB081)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目(2014KTZB02-01-01，2015KTZDNY01-01-02)；西北農(nóng)林科技大學(xué)南陽(yáng)小麥試驗(yàn)示范站建設(shè)項(xiàng)目；西北農(nóng)林科技大學(xué)唐仲英育種基金項(xiàng)目

E-mail:jiaxiu_0906@126.com(楊佳秀)；18700895579@163.com(耿皆飛，與第一作者同等貢獻(xiàn))

謝彥周(E-mail:xieyanzhou@gmail.com); 王成社(E-mail:wangcs2008@126.com)

S512.1；S330

A

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